猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝研究

猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝研究摘要：本論文以猴頭菇、蘋(píng)果為主要原料，以乳酸菌和酵母菌為混菌發(fā)酵劑，對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素的混菌發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)分別考察料液比、菌種配比、初始糖度、初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素的DPPH自由基清除率以及SOD單位酶活力的影響，得出混菌發(fā)酵猴頭菇蘋(píng)果酵素最佳發(fā)酵條件。其結(jié)果表明：猴頭菇蘋(píng)果酵素的最佳釀造工藝為:猴頭菇酶解液:蘋(píng)果酶解液的質(zhì)量比為2:1、初始糖度為8Brix、酵母菌:乳酸菌質(zhì)量比為1:2、發(fā)酵溫度為28℃。在此優(yōu)化條件下的猴頭菇蘋(píng)果酵素SOD單位酶活力、DPPH自由基清除率均高于自然發(fā)酵分別為269.5782U/mL、96.42%、還原糖含量為4.1529mg/mL、總糖含量為4.5878mg/mL、總黃酮含量為0.3879mg/mL、游離氨基酸含量為5.1749mg/mL。酒體色澤金黃、澄清透明、滋味醇厚柔和、氣味協(xié)調(diào)、具有猴頭菇和蘋(píng)果復(fù)合酵素的特殊香味。關(guān)鍵詞：猴頭菇；蘋(píng)果；復(fù)合發(fā)酵；酵素；超氧化物歧化酶；

StudyonthepreparationtechnologyofthemixHericiumerinaceuswithAppleenzymeAbstract:Inthispaper,withHericiumerinaceusandappleasthemainrawmaterials,withlacticacidbacteriaandyeastasthemixedfermentationagent,themixedfermentationprocessofthemixHericiumerinaceuswithappleenzymewasoptimized.Bysinglefactorandorthogonalexperiment,theeffectsoftheratioofmaterialtoliquid,theproportionofstrains,theinitialsugardegree,theinitialpH,thefermentationtemperatureandthefermentationtimeontheDPPHfreeradicalscavengingrateofthemixHericiumerinaceuswithappleenzymeandtheactivityofSODunitenzymewereinvestigatedrespectively,andtheoptimalfermentationconditionsforthemixedfermentationofmixHericiumerinaceuswithappleenzymewereobtained.TheresultsshowedthattheoptimumbrewingprocessofHericiumerinaceusapplefermentationenzymewasasfollows:massratioofHericiumerinaceusenzymatichydrolysisliquid:appleenzymatichydrolysisliquidwas2:1,initialsugardegreewas8Brix,massratioofyeast:lacticacidbacteriawas1:2,fermentationtemperaturewas28℃.Undertheoptimizedconditions,theSODunitactivityandDPPHfreeradicalscavengingrateofthemixhericiumerinaceuswithappleenzymewerehigherthanthoseofnaturalfermentation,whichwere269.5782U/mL,96.42%,4.1529mg/mL,4.5878mg/mLand0.3879,respectivelymg/mL,freeaminoacidcontentwas5.1749mg/mL.Thecolorofthewineisgolden,clearandtransparent,thetasteismellowandsoft,thesmellisharmonious,withhericiumerinaceusandapplecomplexenzymespecialaroma.Keywords:Hericiumerinaceus;Apple;Complexfermentation;Enzyme;Superoxidedismutase

目錄1引言 12材料與方法 22.1材料與試劑 22.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備 22.3實(shí)驗(yàn)方法 22.3.1猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝流程 22.3.2猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝操作要點(diǎn) 22.4猴頭菇蘋(píng)果酵素制備單因素實(shí)驗(yàn) 32.4.1猴頭菇酶解液與蘋(píng)果酶解液配比的確定 32.4.2發(fā)酵菌種質(zhì)量比的確定 32.4.3發(fā)酵溫度的確定 42.5猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝正交試驗(yàn)研究 42.6猴頭菇蘋(píng)果酵素品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)活性成分分析 52.6.1感官評(píng)價(jià) 52.6.2營(yíng)養(yǎng)活性成分分析檢測(cè) 52.7數(shù)據(jù)處理 63實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 73.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果 73.1.1猴頭菇、蘋(píng)果酶解液最佳質(zhì)量比的確定 73.1.2發(fā)酵菌種質(zhì)量比的確定 73.1.3最佳初始糖度的確定 83.1.4最佳發(fā)酵時(shí)間的確定 93.1.5最佳初始pH的確定 93.1.6最佳發(fā)酵溫度的確定 103.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 104結(jié)論 11參考文獻(xiàn) 13致謝 161引言猴頭菇（Hericiumerinaceus），屬擔(dān)子菌門(mén)、層菌綱、非褶菌目、齒菌科，其外形酷似猴頭故又名“猴頭蘑”、“猴菇”等[1]。同時(shí)也是大型名貴藥食兼用蕈菌，具有很高的藥食用價(jià)值，主要分布在黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、河北、陜西、山西、甘肅等省級(jí)自治區(qū)[2]。大量研究表明，猴頭菇子實(shí)體不僅具有高蛋白質(zhì)、高真菌多糖、低脂肪等功能食品理想原料特性[3-4]；還含有脂肪酸、萜類(lèi)化合物[5]、多肽[6]、核苷、多酚類(lèi)物質(zhì)、多糖類(lèi)[7]、甾醇等多種生物活性成分。因此，猴頭菇除了優(yōu)異的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以外，還具有抗氧化、保護(hù)胃粘膜、抗凝血、抑制炎癥、降低血糖、抗腫瘤以及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[8-9]。目前以猴頭菇為原輔料開(kāi)發(fā)有果脯、罐頭、風(fēng)味醋、猴頭菇飲料、猴菇餅干以及猴菇口含片等諸多醫(yī)藥制品和功能性食品，深受人們的青睞[10-11]。但市面上鮮有猴頭菇酵素產(chǎn)品，因而，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)猴頭菇功能性產(chǎn)品，增加其產(chǎn)品的附加值，具有較理想的市場(chǎng)前景。酵素（enzymes）是指以動(dòng)物、植物、食用菌為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[12-13]。根據(jù)其用途，酵素又可細(xì)分為食用酵素、環(huán)保酵素、農(nóng)用酵素、飼用酵素以及日化酵素等[14]。食用酵素不僅富含豐富的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)富含多種短鏈脂肪酸、醇、酶、酯類(lèi)等次級(jí)代謝產(chǎn)物，可將原材料的某些成分轉(zhuǎn)化為高活性物質(zhì)，保留了原材料本身所具有的營(yíng)養(yǎng)成分及發(fā)酵后帶來(lái)的功能成分[15-16]。因此，食用酵素在改善腸道環(huán)境、抗氧化[17]、抗癌解毒、降低血脂[18]、提高免疫力[19]等方面具有多種功能。目前，食用酵素研究開(kāi)發(fā)研究較多。舒旭晨等[20]以酵母菌、乳酸菌為混菌發(fā)酵劑，對(duì)石斛酵素發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化所制備的石斛酵素羥基自由基清除率達(dá)到34.79%,較優(yōu)化前提升了108.45%。張巧等[21]采用多菌發(fā)酵的大果山山楂酵素總酚質(zhì)量濃度以及SOD單位酶活力均顯著高于自然發(fā)酵。劉秀娟[22]等利用酵母菌、植物乳桿菌復(fù)合發(fā)酵得到的蘋(píng)果酵素酶活明顯增加且澄清透亮、質(zhì)地均勻。本論文以安康優(yōu)質(zhì)富硒猴頭菇菌粉、蘋(píng)果為主原料，采用酶解、均質(zhì)以及混菌發(fā)酵等技術(shù)研究制備猴頭菇蘋(píng)果酵素復(fù)合飲品，以DPPH自由基清除率和SOD酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立猴頭菇蘋(píng)果復(fù)合酵素制備工藝以及活性物質(zhì)分析技術(shù)體系，增加富硒猴頭菇深加工產(chǎn)品種類(lèi)，提升猴頭菇類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)效益。2材料與方法2.1材料與試劑材料:猴頭菇（產(chǎn)自旬陽(yáng)市國(guó)樺公司）、新鮮富士蘋(píng)果（購(gòu)自安康市萬(wàn)輝超市）、土蜂蜜（江西省昌旺蜂業(yè)有限公司）、耐高溫釀酒高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）、川秀乳酸菌發(fā)酵粉（北京川秀科技有限公司）。試劑：1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（美國(guó)Sigma公司）；焦性沒(méi)食子酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；30000U/g果膠酶（山東隆科特酶制劑有限公司）；10000U/g纖維素酶（河南糖柜食品有限公司）；檸檬酸；焦亞硫酸鈉；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；LHS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱（常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司）；糖度計(jì)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、九陽(yáng)榨汁攪拌機(jī)JYL-CO22E（國(guó)華電器有限公司）；純水機(jī)（成都越純科技有限公司）；TDL-60B低速離心機(jī)（上海市安亭科學(xué)儀器廠）；CP214電子天平（上海市奧豪斯儀器有限公司）；酸度計(jì)（雷磁上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝流程猴頭菇蘋(píng)果酵素工藝流程如圖1所示。圖1猴頭菇蘋(píng)果酵素工藝流程圖2.3.2猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝操作要點(diǎn)（1）蘋(píng)果酶解液的制備：選擇新鮮成熟、無(wú)病蟲(chóng)危害的富士蘋(píng)果，去皮去籽后，切成小塊，按蘋(píng)果與水1:1的比例打漿，采用巴士殺菌法，水浴鍋85℃，殺菌15min。纖維素酶和果膠酶的質(zhì)量濃度分別為60mg/L和50mg/L，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間為1h。冷卻至室溫密封保存，待用。（2）猴頭菇酶解液的制備：稱(chēng)取定量猴頭菇粉，選擇料液比為1:40加入去離子水，置于溫度80℃的恒溫水浴鍋中水浴6h；過(guò)濾后用2%果膠酶，加熱溫度50℃，加熱時(shí)間1h進(jìn)行酶解。調(diào)至pH為4.0，于4℃下冷卻待用。（3）混菌發(fā)酵劑的制備與活化[23-24]：先稱(chēng)取0.1%的酵母菌與乳酸菌干粉，將酵母干粉活化（5%蔗糖水中30℃活化15min）后，冷卻至室溫，后將活化后的酵母菌和乳酸菌依次加入猴頭菇蘋(píng)果酶解液中，混合均勻。（4）主發(fā)酵：將調(diào)整好的漿液置于發(fā)酵罐中，加入125mg/kg的焦亞硫酸鉀混和均勻，采用密閉式發(fā)酵，發(fā)酵溫度控制在28℃。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，發(fā)酵結(jié)束獲得猴頭菇蘋(píng)果酵素。（5）過(guò)濾：將酵素進(jìn)行抽濾取上清液，將其傾入潔凈干燥的離心管中，以4500r/min離心30min，取其上清液待調(diào)配。（6）調(diào)配：調(diào)整酵素原漿的糖度、酸度、色澤等更加為人們所接受。（7）裝瓶滅菌：酵素在裝罐密封前需對(duì)酵素進(jìn)行巴氏滅菌，在65℃至70℃溫度下滅菌15min。2.4猴頭菇蘋(píng)果酵素制備單因素實(shí)驗(yàn)2.4.1猴頭菇酶解液與蘋(píng)果酶解液配比的確定按照2.3.2步驟分別制得猴頭菇和蘋(píng)果酶解液，將猴頭菇、蘋(píng)果酶解液質(zhì)量比分別按照3:1、2:1、1:1、1:2、1:3進(jìn)行混合均質(zhì)，調(diào)整其初始糖度為5Brix，pH為4.0，酵母菌與乳酸菌質(zhì)量比為1:2，在32℃下進(jìn)行密閉式恒溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24h。發(fā)酵結(jié)束后，以猴頭菇蘋(píng)果酵素發(fā)酵原漿液的SOD單位酶活力、DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的料液比。2.4.2發(fā)酵菌種質(zhì)量比的確定按照最佳質(zhì)量比分別取一定量猴頭菇和蘋(píng)果酶解液，混合均勻，設(shè)置發(fā)酵菌種接種質(zhì)量比(酵母菌:乳酸菌)分別為1:0、1:1、1:2、1:3、0:1、2:1、3:1七個(gè)梯度，調(diào)整發(fā)酵液初始糖度為5Brix，pH為4.0，在發(fā)酵溫度為32℃的條件下進(jìn)行密閉式恒溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24h。發(fā)酵結(jié)束后，以猴頭菇蘋(píng)果酵素發(fā)酵原液的SOD單位酶活力、DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的發(fā)酵菌種質(zhì)量比。2.4.3發(fā)酵溫度的確定按照最佳質(zhì)量比分別取一定量猴頭菇和蘋(píng)果酶解液，混合均勻后將最佳菌種質(zhì)量比的混菌發(fā)酵劑接入猴頭菇蘋(píng)果酶解液中,設(shè)置發(fā)酵溫度分別為22℃、25℃、28℃、31℃、34℃、37℃共6個(gè)水平，調(diào)整發(fā)酵液初始糖度為5Brix，pH為4.0進(jìn)行密閉式恒溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24h。發(fā)酵結(jié)束后，以猴頭菇蘋(píng)果酵素發(fā)酵原漿液的SOD單位酶活力、DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的發(fā)酵溫度。2.4.4初始糖度的確定將已確定的混菌發(fā)酵劑接入到最佳質(zhì)量比的猴頭菇、蘋(píng)果酶解液中，混合均勻，選取最佳發(fā)酵溫度為28℃。設(shè)置猴頭菇蘋(píng)果酵素初始糖度為分別為4Brix、6Brix、8Brix、10Brix、12Brix共5個(gè)水平。在pH為4.0的條件下進(jìn)行密閉式恒溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24h。發(fā)酵結(jié)束后，以猴頭菇蘋(píng)果酵素發(fā)酵原漿液的SOD單位酶活力、DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的初始糖度。2.4.5初始pH的確定將已確定的混菌發(fā)酵劑接入到最佳質(zhì)量比的猴頭菇、蘋(píng)果酶解液中，混合均勻，選取最佳發(fā)酵溫度為28℃、最佳初始糖度為4Brix。用碳酸氫鉀或無(wú)水檸檬酸調(diào)節(jié)酵素的pH分別為3.5、4.0、4.5、5、5.5共5個(gè)水平。在此條件下進(jìn)行密閉式恒溫發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24h。發(fā)酵結(jié)束后，以猴頭菇蘋(píng)果酵素發(fā)酵原漿液的SOD單位酶活力、DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的初始pH。2.4.6發(fā)酵時(shí)間的確定將已確定的混菌發(fā)酵劑接入到最佳質(zhì)量比的猴頭菇、蘋(píng)果酶解液中，混合均勻，選取最佳發(fā)酵溫度為28℃、最佳初始糖度為4Brix、最佳初始pH為4.0，調(diào)配后設(shè)置發(fā)酵時(shí)間分別為16h、24h、32h、40h、48h、56h共6個(gè)水平。在此條件下進(jìn)行密閉式恒溫發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，以猴頭菇蘋(píng)果酵素發(fā)酵原漿液的SOD單位酶活力、DPPH自由基清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的發(fā)酵時(shí)間。2.5猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝正交試驗(yàn)研究依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取猴頭菇酶解液與蘋(píng)果酶解液配比(A)、發(fā)酵菌種質(zhì)量比(B)、初始糖度(C)、發(fā)酵時(shí)間（D）為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行4因素3水平L9(34)猴頭菇蘋(píng)果酵素制備工藝優(yōu)化試驗(yàn)，具體正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。以猴頭菇蘋(píng)果酵素中SOD單位酶活力、DPPH自由基清除率為活力評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化猴頭菇蘋(píng)果酵素發(fā)酵制備工藝。表1正交試驗(yàn)因素與水平2.6猴頭菇蘋(píng)果酵素品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)活性成分分析2.6.1感官評(píng)價(jià)依據(jù)QB/T5323-2018[12]中酵素的評(píng)分細(xì)則，選擇10名有食品專(zhuān)業(yè)經(jīng)驗(yàn)的學(xué)生對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，分別從色澤、滋味、氣味、組織狀態(tài)4個(gè)指標(biāo)對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素成品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，具體評(píng)分細(xì)則見(jiàn)表2。表2猴頭菇蘋(píng)果酵素感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)2.6.2營(yíng)養(yǎng)活性成分分析檢測(cè)（1）SOD酶活力的測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定猴頭菇蘋(píng)果酵素樣品的SOD酶活力[25]。鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：取兩支干燥潔凈的試管分別加入4.5mL預(yù)熱后的10mmol/L、pH=8.2的Tris-HCL緩沖液,自氧化管中加入8.5μL鄰苯三酚溶液，迅速搖勻，立即傾入1cm比色皿中。空白管加入8.5μL、10mmol/LTris-HCL緩沖液代替鄰苯三酚，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)量光吸收值(A0)，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。酵素樣液的活性測(cè)定：取兩支干燥潔凈的試管分別加入4.5mL預(yù)熱后的10mmol/L、pH=8.2的Tris-HCL緩沖液。樣管中加入樣液15μL、鄰苯三酚溶液8.5μL，迅速搖勻，立即傾入1cm比色皿中。空白管加入23.5μL、10mmol/LTris-HCL緩沖液，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)量光吸收值（A1），每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。按照下列公式求出SOD單位酶活性。酶活性（U/mL）=（2）DPPH自由基清除率的測(cè)定分別取四支潔凈干燥的試管，加入20mmol/L的DPPH試劑（用無(wú)水乙醇溶液配置）3mL和發(fā)酵樣液2ml為實(shí)驗(yàn)管（A1）；3mL無(wú)水乙醇和2mL酵素樣液為陰性對(duì)照組（A2）；20mmol/LDPPH溶液3mL和2mL發(fā)酵樣液為空白組（A0）；，混合均勻，避光保存30min，以BHT（2,6-二叔丁基對(duì)甲酚）作為陽(yáng)性對(duì)照組。以無(wú)水乙醇矯正空白，置于517nm條件下測(cè)定吸光值，計(jì)算其清除率[26]。DPPH清除率（3）其他理化成分的測(cè)定酒精度測(cè)定：參考GB5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》[27]；還原糖和總糖的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法[28]；總黃酮測(cè)定參考刺梨原汁酒中總黃酮的測(cè)定[29]；游離氨基酸測(cè)定采用茚三酮顯色法[30-31]。2.7數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)均平行三次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS20.0，實(shí)驗(yàn)繪圖均采用GraphPad.Prism6.01進(jìn)行處理，組間差異用顯著性差異表示。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1猴頭菇、蘋(píng)果酶解液最佳質(zhì)量比的確定不同猴頭菇與蘋(píng)果酶解液質(zhì)量比對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素活性影響實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，猴頭菇、蘋(píng)果酶解液質(zhì)量比對(duì)DPPH自由基清除率影響不明顯，其變化趨于平緩，在質(zhì)量比為1:1時(shí)達(dá)到最高值為92.68%。SOD單位酶活力隨著猴頭菇酶解液比例的不斷減少，呈先顯著升高后下降的趨勢(shì)，在猴頭菇、蘋(píng)果酶解液為2:1時(shí)達(dá)到最高值，因此選猴頭菇、蘋(píng)果酶解液質(zhì)量比為2:1進(jìn)行后續(xù)研究。圖2料液比對(duì)酵素發(fā)酵的影響注：組間不同字母表示存在顯著性差異3.1.2發(fā)酵菌種質(zhì)量比的確定不同發(fā)酵菌種質(zhì)量比（酵母菌：乳酸菌）對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素活性影響實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3可知，不同發(fā)酵菌種質(zhì)量比對(duì)DPPH自由基清除率影響不明顯，其DPPH自由基清除率均高于90%。而猴頭菇蘋(píng)果酵素的SOD單位酶活力隨著乳酸菌比例的不斷升高，在酵母菌:乳酸菌的質(zhì)量比為1:2時(shí)，猴頭菇蘋(píng)果酵素的SOD單位酶活力達(dá)到了最高值，后又呈下降趨勢(shì)。因此，故選用酵母菌:乳酸菌的質(zhì)量比為1:2作為最佳接種量。圖3酵母菌和乳酸菌比例對(duì)酵素發(fā)酵的影響注：組間不同字母表示存在顯著性差異3.1.3最佳初始糖度的確定不同初始糖度對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素活性影響實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4可知，隨著初始糖不斷增高，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在初始糖度為8Brix時(shí)達(dá)到最高值；SOD單位酶活力呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在初始糖度為12Brix時(shí)達(dá)到最高值。考慮T/CBFIA08003-2017食用植物酵素、QB/T5323-2018植物酵素中規(guī)定食用酵素中酒精度含量不得超過(guò)0.5（g/100g）。測(cè)得初始糖度分別為4Brix、6Brix、8Brix、10Brix、12Brix時(shí)，酒精度分別是0.4%vol、1.0%vol、2.6%vol、3.5%vol、4.5%vol。因此選擇初始糖度為4Brix，進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)研究。圖4初始糖度對(duì)酵素發(fā)酵的影響注：組間不同字母表示存在顯著性差異3.1.4最佳發(fā)酵時(shí)間的確定不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素活性影響實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見(jiàn)圖5，由圖5可知，其DPPH自由基清除率、SOD酶活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，在24h時(shí)猴頭菇蘋(píng)果酵素的SOD單位酶活力、DPPH清除率均達(dá)到到最高值，因此選用最佳發(fā)酵時(shí)間為24h，進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)研究。圖5發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵素發(fā)酵的影響注：組間不同字母表示存在顯著性差異3.1.5最佳初始pH的確定不同初始pH對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素活性影響實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見(jiàn)圖6，由圖6可知，不同初始pH對(duì)DPPH自由基清除率影響不明顯，其DPPH自由基清除率均高于90%。SOD單溫酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，在pH=4.0時(shí)達(dá)到最高值為181.769U/mL。故選用最佳初始酸度為pH=4.0，進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)研究。圖6初始酸度對(duì)酵素發(fā)酵的影響注：組間不同字母表示存在顯著性差異3.1.6最佳發(fā)酵溫度的確定不同發(fā)酵溫度對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素活性影響實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果見(jiàn)圖7，由圖7可知，猴頭菇蘋(píng)果酵素本身DPPH自由基清除率均高于90%，不同發(fā)酵溫度對(duì)DPPH自由基清除率的影響并不明顯。而當(dāng)發(fā)酵溫度在28℃時(shí)，其SOD單位酶活力顯著升高達(dá)到最高值為256.827U/mL，后隨著溫度繼續(xù)升高SOD酶活力下降明顯。故選用28℃作為最佳發(fā)酵溫度進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)研究。圖7發(fā)酵溫度對(duì)酵素發(fā)酵的影響注：組間不同字母表示存在顯著性差異3.2正交試驗(yàn)結(jié)果與分析猴頭菇蘋(píng)果酵素正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表3可知，以SOD單位酶活力為考察指標(biāo)時(shí)，各因素對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素SOD單位酶活力影響大小排序?yàn)镈>C>A>B,既發(fā)酵時(shí)間>初始糖度>料液比>接種量，最優(yōu)組合為A1B1C2D3，既猴頭菇酶解液:蘋(píng)果酶解液為2:1、酵母菌:乳酸菌質(zhì)量比為2:1、初始糖度為8Brix、發(fā)酵時(shí)間為32h；以DPPH清除率為考察指標(biāo)時(shí)，各因素對(duì)猴頭菇蘋(píng)果酵素DPPH清除率影響大小依次為A>D>C>B，既料液比>發(fā)酵時(shí)間>初始糖度>接種量，最優(yōu)組合為A3B1C1D1。既猴頭菇酶解液:蘋(píng)果酶解液為1:2、酵母菌:乳酸菌為2:1、初始糖度為6Brix、發(fā)酵時(shí)間為16h。兩種工藝制備的猴頭菇蘋(píng)果酵素SOD酶活力分別是269.5782U/mL、258.6437U/mL；DPPH清除率分別是96.42%、94.53%。因此確定最佳制備工藝為A1B1C2D3。在最佳條件下制得的猴頭菇蘋(píng)果酵素感官評(píng)分為80.73分，色澤金黃、澄清透明、滋味醇厚柔和、氣味協(xié)調(diào)、具有猴頭菇和蘋(píng)果復(fù)合酵素的特殊香味；測(cè)得優(yōu)化后的猴頭菇蘋(píng)果酵素中還原糖含量為4.1529mg/mL、總糖含量為4.5878mg/mL；總黃酮含量為0.3879mg/mL；游離氨基酸含量為5.1749mg/mL。符合QB/T5323—2018植物酵素、T/CBFIA08003-2017食用植物酵素中的要求。表3猴頭菇蘋(píng)果酵素正交試驗(yàn)結(jié)果水平因素單位SOD酶活力（U/mL）DPPH清除率/%A料液比/%B接種量/%C初始糖度/BrixD發(fā)酵時(shí)間/h11(2:1)1(2:1)1(6)1(16)186.7593.4921(2:1)2(1:1)2(8)2(24)131.1186.6631(2:1)3(1:2)3(10)3(32)193.2585.7942(1:1)1(2:1)2(8)3(32)194.2587.6752(1:1)2(1:1)3(10)1(16)137.8694.1162(1:1)3(1:2)1(6)2(24)55.6495.3873(1:2)1(2:1)3(10)2(24)142.9996.6583(1:2)2(1:1)1(6)3(32)151.8093.8993(1:2)3(2:1)2(8)1(16)200.5794.50k1170.37174.66131.40175.06k2129.25140.26175.31109.91k3165.12149.82158.03179.77R41.1234.4143.9169.86最優(yōu)組合A1B1C2D3k1＇88.6592.6194.2594.03k2＇92.3991.5589.6192.90k3＇95.0191.8992.1889.12R＇6.371.054.644.92最優(yōu)組合A3B1C1D14結(jié)論本研究以安康優(yōu)質(zhì)富硒猴頭菇為主原料，采用混菌發(fā)酵等技術(shù)研究制備猴頭菇蘋(píng)果酵素飲品，以SOD單位酶活力以及DPPH清除率作為理化指標(biāo)。進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化猴頭菇蘋(píng)果酵素的發(fā)酵工藝。以總糖、還原糖、蛋白質(zhì)含量以及感官評(píng)價(jià)等為指標(biāo)對(duì)優(yōu)化后的最佳釀造工藝進(jìn)行研究以及對(duì)所制備的猴頭菇蘋(píng)果酵素進(jìn)行品質(zhì)分析。優(yōu)化后的猴頭菇蘋(píng)果酵素的發(fā)酵工藝為猴頭菇、蘋(píng)果酶解液為質(zhì)量比為2:1、酵母菌:乳酸菌為2:1、初始糖度為8Brix、發(fā)酵時(shí)間為32h。制得的猴頭菇蘋(píng)果酵素的SOD酶活力、DPPH清除率分別是269.5782U/mL、94.53%。感官評(píng)分為80.73分，在此工藝條件下釀制的猴頭菇蘋(píng)果酵素色澤金黃、澄清透明、滋味醇厚柔和、氣味協(xié)調(diào)、具有猴頭菇和蘋(píng)果復(fù)合酵素的特殊香味。符合T/CBFIA08003-2017食用植物酵素、QB/T5323-2018植物酵素規(guī)定。該工藝充分結(jié)合了猴頭菇、蘋(píng)果自身的特點(diǎn)。成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)傳統(tǒng)酵素的發(fā)酵改良工藝，進(jìn)當(dāng)?shù)馗晃镱^菇深加工產(chǎn)品種類(lèi)，提升猴頭菇類(lèi)產(chǎn)品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)安康富硒食用菌產(chǎn)業(yè)持續(xù)快速健康發(fā)展壯大。

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