2021新高考生物選擇性考試B方案一輪復習學案第10單元第35講基因工程（含多聚酶鏈式反應擴增DNA片段）

選修3現(xiàn)代生物科技專題第十單元現(xiàn)代生物科技專題第35講基因工程(含多聚酶鏈式反應擴增DNA片段)[考綱明細]1.基因工程的誕生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技術(含PCR技術)(Ⅱ)3.基因工程的應用(Ⅱ)4.蛋白質工程(Ⅰ)5.實驗：DNA的粗提取與鑒定知識自主梳理一基因工程的概念及基本工具1．基因工程概念基因工程的別名基因拼接技術或eq\x(\s\up1(01))DNA重組技術操作環(huán)境生物體外操作對象eq\x(\s\up1(02))基因操作原理eq\x(\s\up1(03))基因重組操作水平eq\x(\s\up1(04))DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導入→表達目的創(chuàng)造出更符合人們需要的eq\x(\s\up1(05))生物類型和生物產(chǎn)品優(yōu)點克服遠緣雜交不親和障礙，eq\x(\s\up1(06))定向改造生物的遺傳性狀2．DNA重組技術的基本工具(1)限制性核酸內(nèi)切酶(簡稱：eq\x(\s\up1(07))限制酶)①本質：蛋白質。②來源：主要是從eq\x(\s\up1(08))原核生物中分離純化出來的。③作用：識別雙鏈DNA分子的某種特定的eq\x(\s\up1(09))核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的eq\x(\s\up1(10))磷酸二酯鍵斷開。④結果：產(chǎn)生eq\x(\s\up1(11))黏性末端或eq\x(\s\up1(12))平末端。例：如下圖所示，EcoRⅠ限制酶識別的堿基序列是eq\x(\s\up1(13))—GAATTC—，切割位點在eq\x(\s\up1(14))G和A之間；SmaⅠ限制酶識別的堿基序列是eq\x(\s\up1(15))—CCCGGG—，切割位點在eq\x(\s\up1(16))C和G之間；說明限制酶具有eq\x(\s\up1(17))特異性。限制酶為何不切割自身DNA?提示限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別一種特定的堿基序列，并在特定的位點上進行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是自身DNA中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾。(2)DNA連接酶①作用：將限制酶切割下來的DNA片段eq\x(\s\up1(20))拼接成新的DNA分子。②類型常用類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源eq\x(\s\up1(21))大腸桿菌T4噬菌體功能只“縫合”eq\x(\s\up1(22))黏性末端“縫合”eq\x(\s\up1(23))黏性末端和平末端結果恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的eq\x(\s\up1(24))磷酸二酯鍵③DNA連接酶和限制酶的關系(3)載體①載體的作用：攜帶外源DNA片段進入受體細胞。②常用載體：eq\x(\s\up1(25))質粒。其他載體：λ噬菌體衍生物、eq\x(\s\up1(26))動植物病毒等。③質粒a．概念：質粒是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌eq\x(\s\up1(27))擬核DNA之外，并具有自我復制能力的很小的雙鏈eq\x(\s\up1(28))環(huán)狀DNA分子。b．特點：能自我復制；有一個至多個eq\x(\s\up1(29))限制酶切割位點；有特殊eq\x(\s\up1(30))標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。二基因工程的基本操作程序1．目的基因的獲取目的基因：主要指eq\x(\s\up1(01))編碼蛋白質的基因，也可以是一些具eq\x(\s\up1(02))調控作用的因子。獲取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(從\x(\s\up1(03))基因文庫中獲取,人工合成\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(利用\x(\s\up1(04))mRNA反轉錄合成,通過\x(\s\up1(05))DNA合成儀用化學方法人工合成)),利用PCR技術擴增))(1)從基因文庫中獲?、倩蛭膸欤簩⒑心撤N生物不同基因的許多eq\x(\s\up1(06))DNA片段，導入eq\x(\s\up1(07))受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因，可分為eq\x(\s\up1(08))基因組文庫和eq\x(\s\up1(09))部分基因文庫(如cDNA文庫)。②構建過程基因組文庫的構建cDNA文庫的構建(2)利用PCR技術擴增目的基因①基礎知識PCR含義是一項在生物體外eq\x(\s\up1(17))復制特定DNA片段的核酸合成技術PCR原理DNAeq\x(\s\up1(18))雙鏈復制續(xù)表前提條件有一段已知目的基因的eq\x(\s\up1(19))核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成eq\x(\s\up1(20))引物要求模板eq\x(\s\up1(21))目的基因兩條鏈原料dCTP、dATP、dGTP、dTTP酶熱穩(wěn)定eq\x(\s\up1(22))DNA聚合酶(eq\x(\s\up1(23))Taq酶)引物人工合成的兩條eq\x(\s\up1(24))DNA片段(引物1，引物2)PCR反應過程變性當溫度上升到eq\x(\s\up1(25))90～95_℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈復性溫度下降到eq\x(\s\up1(26))55～60_℃時，兩種引物通過eq\x(\s\up1(27))堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合延伸70～75℃時，eq\x(\s\up1(28))Taq酶從引物3′端開始進行互補鏈的合成擴增方向DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈，即DNA的合成方向總是從子鏈的eq\x(\s\up1(29))5′端向3′端延伸方式指數(shù)形式擴增(2n，n為擴增循環(huán)的次數(shù))結果eq\x(\s\up1(30))短時間內(nèi)大量擴增目的基因②PCR反應的實驗操作實驗用具a.PCR儀b.eq\x(\s\up1(32))微量離心管：一種薄壁塑料管，總容積為0.5mL。c.eq\x(\s\up1(33))微量移液器：用于定量轉移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。續(xù)表操作步驟準備：按照PCR反應體系的配方將所需試劑擺放于實驗桌上↓移液：用微量移液器按照配方在微量離心管中依次加入各組分↓混合：蓋嚴離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁↓離心：將eq\x(\s\up1(34))微量離心管放在離心機上，離心約10s。目的是使反應液集中在離心管eq\x(\s\up1(35))底部↓反應：將離心管放入PCR儀中，設置程序進行反應DNA含量測定DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與eq\x(\s\up1(36))DNA含量有關。可以利用DNA的這一特點進行DNA含量的測定，具體方法如下：稀釋：取2μLPCR反應液，加入98μL蒸餾水，將樣品進行eq\x(\s\up1(37))50倍稀釋↓對照調零：以eq\x(\s\up1(38))蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調節(jié)至eq\x(\s\up1(39))零↓測定：取DNA稀釋液100μL至eq\x(\s\up1(40))比色杯中，測定260nm處的光吸收值↓計算：DNA含量(μg/mL)＝50*×(260nm的讀數(shù))×稀釋倍數(shù)注：公式中50的含義：在標準厚度為1cm的比色杯中，OD260為1相當于50μg/mL的雙鏈DNA注意事項a.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、吸液槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必需進行eq\x(\s\up1(41))高壓滅菌b．PCR所用的緩沖液實驗前應分裝成小份，并在eq\x(\s\up1(42))－20_℃儲存。使用前，將緩沖液從冰箱中取出，放在冰塊上緩慢融化，備用c．在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后移液器上的槍頭必須更換d．混勻后離心處理，使反應液集中在eq\x(\s\up1(43))離心管底部(3)人工合成①前提條件：核苷酸序列eq\x(\s\up1(44))已知，基因eq\x(\s\up1(45))比較小。②方法a．反轉錄法：目的基因的mRNAeq\o(→,\s\up17(反轉錄))eq\x(\s\up1(46))單鏈DNA→雙鏈DNA(目的基因)b．化學合成法：通過DNA合成儀直接人工合成2．基因表達載體的構建——基因工程的核心(1)操作目的使目的基因在受體細胞中eq\x(\s\up1(47))穩(wěn)定存在，并且可以eq\x(\s\up1(48))遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠eq\x(\s\up1(49))表達和發(fā)揮作用。(2)組成(3)構建過程獲取目的基因與切割載體時只能用同一種限制酶嗎？提示不是只能用一種限制酶，也可以用不同的限制酶，只要切割后目的基因和載體的黏性末端相同即可。3．將目的基因導入受體細胞(1)將目的基因導入植物細胞①eq\x(\s\up1(63))農(nóng)桿菌轉化法：最常用的方法。a．受體細胞：植物eq\x(\s\up1(64))體細胞或受精卵。b．操作過程：將目的基因插入eq\x(\s\up1(65))Ti質粒的T-DNA上→轉入eq\x(\s\up1(66))農(nóng)桿菌→導入eq\x(\s\up1(67))植物細胞→T-DNA上的目的基因整合到eq\x(\s\up1(68))受體細胞的染色體DNA上→目的基因表達。②基因槍法：適用于eq\x(\s\up1(69))單子葉植物，成本較高。③花粉管通道法：將目的基因通過eq\x(\s\up1(70))花粉管通道導入受體細胞，十分簡便經(jīng)濟。(2)將目的基因導入動物細胞①方法：eq\x(\s\up1(71))顯微注射技術。②受體細胞：動物的eq\x(\s\up1(72))受精卵。③操作過程：將含有eq\x(\s\up1(73))目的基因的表達載體提純→取卵(eq\x(\s\up1(74))受精卵)→eq\x(\s\up1(75))顯微注射→受精卵經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動物的eq\x(\s\up1(76))輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有eq\x(\s\up1(77))新性狀的動物。獲得轉基因動物時，通常選擇受精卵做受體細胞的原因？提示受精卵全能性高，可使目的基因在相應的組織細胞內(nèi)表達。(3)將目的基因導入微生物細胞①轉化方法a．用eq\x(\s\up1(78))Ca2＋處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)(這種細胞稱為eq\x(\s\up1(79))感受態(tài)細胞)。b．感受態(tài)細胞吸收eq\x(\s\up1(80))重組表達載體DNA分子。②受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。③原核生物的特點：繁殖快、多為單細胞、eq\x(\s\up1(81))遺傳物質相對較少等。4．目的基因的檢測與鑒定類型步驟檢測內(nèi)容方法分子檢測第一步轉基因生物的DNA上是否插入了目的基因eq\x(\s\up1(82))DNA分子雜交技術(DNA和DNA之間)第二步目的基因是否轉錄出了mRNAeq\x(\s\up1(83))分子雜交技術(DNA和mRNA之間)第三步目的基因是否翻譯成蛋白質eq\x(\s\up1(84))抗原—抗體雜交技術個體生物學水平鑒定抗蟲或抗病接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度(1)不論是復制水平、轉錄水平還是翻譯水平的檢測，都是在eq\x(\s\up1(85))體外進行的。(2)在DNA分子、mRNA分子上檢測目的基因是否插入、目的基因是否轉錄時，用的探針都是用eq\x(\s\up1(86))放射性同位素等作標記的含有eq\x(\s\up1(87))目的基因的DNA片段。三基因工程的應用1．轉基因植物植物基因工程技術主要用于提高農(nóng)作物的抗逆能力(如抗除草劑、抗蟲、抗病、eq\x(\s\up1(01))抗干旱和抗鹽堿等)，以及改良eq\x(\s\up1(02))農(nóng)作物的品質和利用植物eq\x(\s\up1(03))生產(chǎn)藥物等方面。2．轉基因動物動物基因工程在動物品種改良、建立eq\x(\s\up1(04))生物反應器、器官移植等方面顯示了廣闊的應用前景。3．基因工程藥物(1)來源：轉基因的eq\x(\s\up1(05))工程菌。(2)成果：細胞因子、抗體、疫苗、激素等。(3)作用：用來預防和治療人類腫瘤、心血管疾病、eq\x(\s\up1(06))遺傳病、各種傳染病、糖尿病、類風濕等疾病。4．基因治療(1)方法：把eq\x(\s\up1(07))正?；驅氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能。(2)效果：治療eq\x(\s\up1(08))遺傳病的最有效的手段。(3)分類：eq\x(\s\up1(09))體內(nèi)基因治療和體外基因治療。四蛋白質工程1．概念：蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規(guī)律及其與生物功能的關系作為基礎，通過eq\x(\s\up1(01))基因修飾或eq\x(\s\up1(02))基因合成，對現(xiàn)有蛋白質進行eq\x(\s\up1(03))改造，或制造一種eq\x(\s\up1(04))新的蛋白質，以滿足人類生產(chǎn)和生活的需求。2．基本途徑：預期蛋白質功能→設計預期蛋白質結構→推測應有的eq\x(\s\up1(05))氨基酸序列→找到對應的eq\x(\s\up1(06))脫氧核苷酸序列(基因)?？键c題型突破考點1基因工程的操作工具1．下列關于載體的相關敘述錯誤的是()A．目前常用的載體有質粒、λ噬菌體的衍生物和動植物病毒B．天然質粒均可以直接用作載體將目的基因送入受體細胞C．載體DNA分子上要有一個至多個限制酶切割位點D．載體上的標記基因有利用篩選含重組DNA的細胞答案B解析天然質粒往往不能直接作為載體，要根據(jù)不同的目的和需求進行人工改造。2．(2016·全國卷Ⅲ)圖a中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內(nèi)切酶的識別序列與切割位點，圖b為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。根據(jù)基因工程的有關知識，回答下列問題：(1)經(jīng)BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產(chǎn)物連接，理由是___________________________________________________。(2)若某人利用圖b所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖c所示。這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產(chǎn)物的有________，不能表達的原因是___________________________________________。(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有____________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是________________。答案(1)Sau3AⅠ兩種酶切割后產(chǎn)生的片段具有相同的黏性末端(2)甲和丙甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄(其他合理答案也可)(3)E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶(其他合理答案也可)解析(1)分析圖a可知，限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故經(jīng)這兩種酶切割得到的產(chǎn)物可以用DNA連接酶進行連接。(2)構建基因表達載體時，為保證目的基因能在宿主細胞中成功表達，目的基因應插入在啟動子和終止子之間，據(jù)此可判斷甲、丙均不符合要求，目的基因均不能被轉錄。(3)常見的DNA連接酶有E·coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中T4DNA連接酶既能連接黏性末端又能連接平末端。與DNA相關的六種酶的比較名稱作用部位底物作用結果限制酶磷酸二酯鍵DNA將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵DNA片段將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵脫氧核苷酸以單鏈DNA為模板，將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵DNA將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵DNA將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈RNA聚合酶磷酸二酯鍵核糖核苷酸以DNA一條鏈為模板，將單個核糖核苷酸依次連接到單鏈末端考點2基因工程的基本操作程序1．使用PCR儀具體實驗操作順序應為()①設計好PCR儀的循環(huán)程序②按配方準備好各組分③用微量移液器在微量離心管中依次加入各組分④進行PCR反應⑤離心使反應液集中在離心管底部A．②③⑤④① B．①⑤③②④C．②③⑤①④ D．④②⑤③①答案C解析PCR反應的操作步驟一般分為準備—移液—混合—離心—反應。因PCR儀是一種自動控制溫度的儀器，設計好循環(huán)程序就可以進行反應了。2．PCR一般要經(jīng)過三十多次循環(huán)，從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作為模板參與反應，由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時將()A．仍與引物Ⅰ結合進行DNA子鏈的延伸B．與引物Ⅱ結合進行DNA子鏈的延伸C．同時與引物Ⅰ和引物Ⅱ結合進行子鏈延伸D．無需與引物結合，在酶的作用下從頭合成子鏈答案B解析當由引物Ⅰ延伸而成的DNA單鏈作模板時，此單鏈引物固定端為5′端，因此與它互補的子鏈應從另一端開始合成，即與引物Ⅱ結合延伸DNA子鏈。3．(2019·成都一診)用基因工程技術生產(chǎn)羧酸酯酶(CarE)制劑的流程如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)①過程所需的酶是________。從cDNA文庫中獲取的目的基因________(填“有”或“無”)啟動子。實現(xiàn)②過程常用________技術，運用該技術的前提是要有________________________，以便合成引物。(2)過程③將重組表達載體導入大腸桿菌時，首先用Ca2＋處理大腸桿菌，目的是____________________________。然后將________________溶于緩沖液中與該大腸桿菌混合，在一定溫度下完成轉化。(3)過程④可利用________技術鑒定CarE基因是否已導入大腸桿菌。答案(1)逆轉錄酶無PCR一段已知目的基因的核苷酸序列(2)使大腸桿菌處于較易吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)重組表達載體(重組質粒)(3)DNA分子雜交解析(1)過程①是以mRNA為模板合成cDNA的逆轉錄(反轉錄)過程，此過程需要逆轉錄酶的參與。mRNA中無啟動子的轉錄片段，所以從cDNA文庫中獲取的目的基因無啟動子。過程②可表示使用PCR技術擴增目的基因的過程，運用該技術的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。(2)過程③表示將重組表達載體導入大腸桿菌。用Ca2＋處理大腸桿菌的目的是使大腸桿菌處于較易吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后將重組表達載體溶于緩沖液中與該大腸桿菌混合，在一定溫度下完成轉化。(3)過程④是目的基因的檢測與鑒定，可利用DNA分子雜交技術鑒定目的基因(即CarE基因)是否導入大腸桿菌。4．(2019·河南省九師聯(lián)盟高三質檢)內(nèi)皮抑素是從血管內(nèi)皮細胞瘤中分離出的一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，能特異性地抑制內(nèi)皮細胞增殖和遷移。某小組為獲得內(nèi)皮抑素，構建分泌型內(nèi)皮抑素基因表達載體，并在C6細胞(大鼠源性膠質瘤細胞)中表達。具體操作如下：(1)構建分泌型內(nèi)皮抑素基因表達載體①采用相關技術提取1日齡SD大鼠大腦半球組織中的總RNA，檢測RNA質量和濃度。②內(nèi)皮抑素cDNA的獲得：以上述提取的RNA為模板，通過________過程獲得cDNA，并利用PCR技術體外擴增cDNA。PCR技術中除需目的基因作為模板外，還需要的條件有____________________________和控制溫度等。③為避免目的基因和載體自身環(huán)化，酶切目的基因和載體時，可用____________________酶切割，以保證目的基因和載體兩側具有____________________。(2)目的基因在C6細胞中表達(將目的基因導入C6細胞中，并表達)①培養(yǎng)C6細胞時，為防止雜菌污染，同時檢測目的基因是否導入受體細胞，可在培養(yǎng)基中加入一定量的________。②若要檢測目的基因是否成功整合到受體細胞的DNA上，可采用________________技術。③導入C6細胞中的目的基因成功表達后，可能會使C6細胞在大鼠體內(nèi)的________________受到抑制。答案(1)②逆轉錄熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)、兩種引物、四種脫氧核苷酸③兩種限制性核酸內(nèi)切(限制)不同的黏性末端(2)①抗生素②DNA分子雜交③增殖和遷移解析(1)遺傳信息從RNA到DNA的過程叫逆轉錄。PCR技術中除需目的基因作為模板外，還需要的條件有熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)、兩種引物、四種脫氧核苷酸和控制溫度等。為避免目的基因和載體自身環(huán)化，酶切目的基因和載體時，可用雙酶切法，即兩種限制性核酸內(nèi)切(限制)酶切割，以保證目的基因兩側和載體上具有不同的黏性末端。(2)在培養(yǎng)細胞時，為防止雜菌污染，同時檢測目的基因是否導入受體細胞，可在培養(yǎng)基中加入一定量的抗生素。若要檢測目的基因是否成功整合到受體細胞的DNA上，可采用DNA分子雜交技術。根據(jù)題干信息可知，導入C6細胞中的目的基因成功表達后，會使C6細胞在大鼠體內(nèi)的增殖和遷移受到抑制。1.基因表達載體構建時限制酶的選擇(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶，如圖甲可選擇PstⅠ、PstⅠ和EcoRⅠ。②不能選擇切點位于目的基因內(nèi)部的限制酶，如圖甲不能選擇SmaⅠ。③為避免目的基因和質粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質粒上也有這兩種酶的切點)。(2)根據(jù)質粒的特點確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致(也可以是能形成相同黏性末端的不同限制酶)，以確保具有相同的黏性末端。②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因；如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復制起點區(qū)，則切割重組后的片段進入受體細胞后將不能自主復制。2．基因表達載體中啟動子、終止子的來源(1)如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，目的基因中已含有啟動子、終止子，在構建基因表達載體時，不需要在質粒上接上特定的啟動子、終止子。(2)如果目的基因是通過人工方法合成的，或通過cDNA文庫獲得的，則目的基因是不含啟動子和終止子的。因此，在構建基因表達載體時，需要在與質粒結合之前，在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。3．如何篩選出含有目的基因的受體細胞(1)原理：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。(2)被轉化的細菌有三種：含環(huán)狀目的基因的細菌、含重組質粒的細菌、含質粒的細菌。(3)篩選方法：將轉化后的細菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組質粒的細菌和含質粒的細菌，如圖1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如圖能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)。考點3基因工程的應用及蛋白質工程題型一基因工程的應用1．(2019·福建三明一中高三開學考試)下列實踐與基因工程無關的是()A．利用DNA探針檢測飲用水是否含病毒B．將一種植物的葉綠體移入另一種植物以提高光合作用效率C．選擇“工程菌”來生產(chǎn)胰島素D．培育轉基因抗蟲棉答案B解析DNA分子雜交技術是將特定生物的DNA提取出來，用放射性同位素等作標記，以此作為探針檢測相應生物的存在，是基因水平的操作，屬于基因工程，A錯誤；將一種植物的葉綠體移入另一種植物以提高光合作用效率這是細胞器水平的操作，是細胞工程，B正確；用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表達的菌類細胞株系稱為工程菌，C錯誤；基因工程也叫轉基因技術，培育轉基因抗蟲棉利用了基因工程，D錯誤。2．普通番茄細胞中含有PG基因，其能控制合成多聚半乳糖醛酸酶(簡稱PG)，PG能破壞細胞壁使番茄軟化不耐貯藏。科學家將抗PG基因導入番茄細胞，培育出了抗軟化、保鮮時間長的轉基因番茄。如圖表示抗PG基因的作用原理，回答下列問題：(1)據(jù)圖回答該轉基因番茄具有抗軟化、保鮮時間長的原理是______________________________。(2)為培育抗軟化番茄，應采用________技術將抗PG基因進行體外擴增。在該技術的反應體系中除模板、引物、原料外，還需要加入________，這個基因的表達需要________等不可缺少的調控組件。(3)將抗PG基因插入Ti質粒的________上構建基因表達載體，通過農(nóng)桿菌轉化法將抗PG基因導入番茄細胞，為檢驗抗PG基因是否成功表達，在個體生物學水平上應檢測____________________________________。(4)為避免抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導致“基因污染”，應將抗PG基因導入________(填“細胞核”或“細胞質”)。答案(1)抗PG基因能阻止PG基因表達的翻譯過程，使細胞不能合成PG(2)PCR(多聚酶鏈式反應)熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶)啟動子、終止子(3)T－DNA轉基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短(4)細胞質解析(1)據(jù)題圖可知，抗PG基因轉錄成的mRNA能夠與PG基因轉錄成的mRNA結合，阻止了PG基因表達的翻譯過程，使細胞不能合成PG，不能破壞細胞壁而使轉基因番茄抗軟化且保鮮時間延長。(2)采用PCR技術將抗PG基因進行體外擴增；PCR過程所需要的條件有：模板(抗PG基因)、引物、原料、熱穩(wěn)定DNA聚合酶；啟動子、終止子等是基因表達不可缺少的調控組件。(3)將抗PG基因插入Ti質粒的T－DNA上構建基因表達載體，通過農(nóng)桿菌轉化法將抗PG基因導入番茄細胞，為檢驗抗PG基因是否成功表達，在個體生物學水平上應檢測轉基因番茄是否抗軟化以及保鮮時間的長短。(4)花粉中的雄配子幾乎不含質基因，所以為避免抗PG基因通過花粉傳播進入其他植物而導致“基因污染”，應將抗PG基因導入細胞質。有關基因工程應用的四個易錯點(1)動物基因工程主要是為了改善畜產(chǎn)品的品質，而不是為了產(chǎn)生體型巨大的個體。(2)Bt毒蛋白基因控制合成的Bt毒蛋白并無毒性，進入昆蟲消化道被分解成多肽后產(chǎn)生毒性。(3)青霉素是青霉菌產(chǎn)生的，不是通過基因工程產(chǎn)生的。(4)并非所有個體都可作為乳腺生物反應器。操作成功的應該是雌性個體，個體本身的繁殖速度較高，泌乳量、蛋白含量等都是應該考慮的因素。題型二蛋白質工程3．(2019·福建三明一中高三開學考試)蛋白質工程的基本流程正確的是()①蛋白質分子結構設計②DNA合成③預期蛋白質功能④根據(jù)氨基酸序列推出脫氧核苷酸序列A．①②③④ B．④②①③C．③①④② D．③④①②答案C解析蛋白質工程的基本流程是：③預期蛋白質功能→①預期蛋白質分子結構→④據(jù)氨基酸序列推出脫氧核苷酸序列→②合成DNA，C正確。4．(2015·全國卷Ⅱ)已知生物體內(nèi)有一種蛋白質(P)，該蛋白質是一種轉運蛋白，由305個氨基酸組成。如果將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸，改變后的蛋白質(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性?；卮鹣铝袉栴}：(1)從上述資料可知，若要改變蛋白質的功能，可以考慮對蛋白質的________進行改造。(2)以P基因序列為基礎，獲得P1基因的途徑有修飾________基因或合成________基因。所獲得的基因表達時是遵循中心法則的，中心法則的全部內(nèi)容包括________的復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即：________________________________。(3)蛋白質工程也被稱為第二代基因工程，其基本途徑是從預期蛋白質功能出發(fā)，通過__________________和__________________，進而確定相對應的脫氧核苷酸序列，據(jù)此獲得基因，再經(jīng)表達、純化獲得蛋白質，之后還需要對蛋白質的生物________進行鑒定。答案(1)氨基酸序列(或結構)(2)PP1DNA和RNA(或遺傳物質)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白質(或轉錄、逆轉錄、翻譯)(3)設計蛋白質的結構推測氨基酸序列功能解析(1)從題中所述資料可知，將P分子中158位的絲氨酸變成亮氨酸，240位的谷氨酰胺變成苯丙氨酸后，該蛋白質的功能發(fā)生了改變，此過程對構成蛋白質的氨基酸序列進行改造，進而改變了蛋白質的結構，從而改變了蛋白質的功能。(2)在蛋白質工程中，目的基因可以以P基因序列為基礎，對生物體內(nèi)原有P基因進行修飾，也可以通過人工合成法合成新的P1基因。所獲得的基因表達遵循中心法則，中心法則的全部內(nèi)容包括DNA和RNA復制，以及遺傳信息在不同分子之間的流動，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白質。(3)蛋白質工程的基本途徑是預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→合成DNA→表達出蛋白質，經(jīng)過該過程得到的蛋白質，需要對其生物功能進行鑒定，以保證其發(fā)揮正常作用。蛋白質工程與基因工程的比較項目蛋白質工程基因工程區(qū)別過程預期的蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到相應的脫氧核苷酸序列(基因)獲取目的基因→構建基因表達載體→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定實質定向改造或生產(chǎn)人類所需的蛋白質定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的生物類型或生物產(chǎn)品結果生產(chǎn)自然界中沒有的蛋白質生產(chǎn)自然界中已有的蛋白質聯(lián)系蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程，是對現(xiàn)有蛋白質的改造或制造新的蛋白質，必須通過基因修飾或基因合成實現(xiàn)實驗14DNA的粗提取與鑒定1．DNA粗提取和鑒定的原理(1)提取思路：利用DNA和其他物質在理化性質方面的差異，提取DNA。(2)DNA的理化性質(提取和鑒定原理)：①DNA在不同濃度的NaCl溶液中的溶解度不同②DNA不溶于酒精；③對酶、高溫和洗滌劑的耐受性強；④DNA＋二苯胺試劑eq\o(→,\s\up17(沸水浴))藍色。2．DNA粗提取和鑒定的操作流程1．(2019·揚州江都中學段考)下列有關“DNA的粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是()A．DNA既溶于2mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水B．向雞血細胞液中加蒸餾水是為了釋放出DNAC．向濃鹽溶液中加蒸餾水是為了析出DNAD．用菜花替代雞血做實驗，其實驗操作步驟相同答案D解析DNA既溶于2mol/L的NaCl溶液也溶于蒸餾水，A正確；向雞血細胞液中加蒸餾水是為了讓雞血細胞吸水漲破，從而釋放出DNA，B正確；向溶解DNA的濃鹽溶液中加蒸餾水是為了降低DNA的溶解度，進而析出DNA，C正確；用菜花替代雞血作為實驗材料，其實驗操作步驟不完全相同，如植物細胞有細胞壁，破碎細胞時需要加入食鹽和洗滌劑并充分攪拌和研磨，D錯誤。2．下列關于“DNA的粗提取和鑒定”實驗依據(jù)原理的敘述，錯誤的是()A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白質能溶于酒精溶液，可將DNA與蛋白質分離B．利用高溫能使蛋白質變性，卻對DNA沒有影響的特性，可將DNA與蛋白質分離C．二苯胺與DNA沸水浴呈現(xiàn)藍色可用于DNA的鑒定D．在DNA濾液中加入嫩肉粉，通過木瓜蛋白酶的作用，可將DNA與蛋白質分離答案B解析高溫能使蛋白質、DNA變性，蛋白質在60～80℃發(fā)生變性，DNA在80℃3．下列關于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，正確的是()選項試劑操作作用A檸檬酸鈉溶液與雞血混合防止血液凝固B蒸餾水與雞血細胞混合保持細胞形狀C蒸餾水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中析出蛋白質D冷卻的酒精加入到過濾后含DNA的NaCl溶液中產(chǎn)生特定的顏色反應答案A解析蒸餾水與雞血細胞混合的目的是使紅細胞吸水漲破，釋放出核物質，B錯誤；將蒸餾水加入到溶解有DNA的NaCl溶液中，其目的是降低DNA的溶解度，初步析出DNA，C錯誤；加入冷卻酒精的目的是進一步析出DNA，D錯誤。DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4加蒸餾水2次①加到雞血細胞液中，使血細胞吸水漲破；②加到含DNA的2mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質的量濃度稀釋到0.14mol/L，使DNA析出用紗布過濾4次①過濾血細胞破裂液，得到含細胞核物質的濾液；②過濾用2mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，濾去溶液中的雜質；③濾取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④過濾溶有DNA的2mol/L的NaCl溶液用NaCl溶液4次①加2mol/L的NaCl溶液，溶解提取的細胞核物質；②用0.14mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解濾取的DNA黏稠物；④用2mol/L的NaCl溶液，溶解絲狀物用于鑒定DNA方向真題體驗1．(2019·全國卷Ⅰ)基因工程中可以通過PCR技術擴增目的基因?；卮鹣铝袉栴}。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以從基因文庫中獲得?；蛭膸彀╛_______和________。(2)生物體細胞內(nèi)的DNA復制開始時，解開DNA雙鏈的酶是________。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，使反應體系中的模板DNA解鏈為單鏈的條件是____________________。上述兩個解鏈過程的共同點是破壞了DNA雙鏈分子中的________。(3)目前在PCR反應中使用Taq酶而不使用大腸桿菌DNA聚合酶的主要原因是__________________________________________________________________。答案(1)基因組文庫cDNA文庫(2)解旋酶加熱至90～95℃(3)Taq酶熱穩(wěn)定性高，而大腸桿菌DNA聚合酶在高溫下會失活解析(1)基因工程中的基因文庫包括基因組文庫和部分基因文庫(cDNA文庫)。(2)生物體細胞內(nèi)的DNA復制開始時，通過解旋酶解開DNA雙鏈。在體外利用PCR技術擴增目的基因時，通過高溫(90～95℃(3)大腸桿菌DNA聚合酶不耐高溫，在高溫下會失活，而PCR反應體系中加入的聚合酶需耐高溫，故在PCR反應中要用能耐高溫的Taq酶。2．(2018·全國卷Ⅱ)某種熒光蛋白(GFP)在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光，這一特性可用于檢測細胞中目的基因的表達。某科研團隊將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端，獲得了L1－GFP融合基因(簡稱為甲)，并將其插入質粒P0，構建了真核表達載體P1，其部分結構和酶切位點的示意圖如下，圖中E1～E4四種限制酶產(chǎn)生的黏性末端各不相同。回答下列問題：(1)據(jù)圖推斷，該團隊在將甲插入質粒P0時，使用了兩種限制酶，這兩種酶是____________。使用這兩種酶進行酶切是為了保證______________，也是為了保證__________________。(2)將P1轉入體外培養(yǎng)的牛皮膚細胞后，若在該細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了________和________過程。(3)為了獲得含有甲的牛，該團隊需要做的工作包括：將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的________移入牛的________________________中、體外培養(yǎng)、胚胎移植等。(4)為了檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，某同學用PCR方法進行鑒定。在鑒定時應分別以該牛不同組織細胞中的________(填“mRNA”“總RNA”或“核DNA”)作為PCR模板。答案(1)E1和E4甲的完整甲與載體正確連接(2)轉錄翻譯(3)細胞核去核卵母細胞(4)核DNA解析(1)甲是將某種病毒的外殼蛋白(L1)基因連接在GFP基因的5′末端而獲得的L1－GFP融合基因，據(jù)此結合題意并分析圖示可知：該團隊在將甲插入質粒P0時，如果用E2或E3，則目的基因不完整，而使用E1和E4這兩種限制酶進行酶切保證了甲的完整，而且也保證了甲與載體正確連接，因此，使用的兩種限制酶是E1和E4。(2)構建的真核表達載體P1中含有GFP基因，而GFP基因的表達產(chǎn)物“某種熒光蛋白(GFP)”在紫外光或藍光激發(fā)下會發(fā)出綠色熒光。若在導入P1的牛皮膚細胞中觀察到了綠色熒光，則說明L1基因在牛的皮膚細胞中完成了表達?；虻谋磉_過程包括轉錄和翻譯。(3)若要獲得含有甲的牛，可采用核移植技術，即將能夠產(chǎn)生綠色熒光細胞的細胞核移入牛的去核卵母細胞中獲得重組細胞，并將該重組細胞在體外培養(yǎng)成重組胚胎，再經(jīng)過胚胎移植等獲得含有甲的牛。(4)PCR是多聚酶鏈式反應的縮寫，是一種在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術。若利用PCR方法檢測甲是否存在于克隆牛的不同組織細胞中，則應分別以該牛不同組織細胞中的核DNA作為PCR模板。3．(2018·天津高考)甲型流感病毒為RNA病毒，易引起流感大規(guī)模流行。我國科學家在2017年發(fā)明了一種制備該病毒活疫苗的新方法，主要環(huán)節(jié)如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主細胞內(nèi)的增殖能力。以病毒RNA為模板，逆轉錄成對應DNA后，利用________技術擴增，并將其中某些基因(不包括表面抗原基因)內(nèi)個別編碼氨基酸的序列替換成編碼終止密碼子的序列。與改造前的基因相比，改造后的基因表達時不能合成完整長度的________，因此不能產(chǎn)生子代病毒。將該改造基因、表面抗原基因等其他基因分別構建重組質粒，并保存。(2)構建適合改造病毒增殖的轉基因宿主細胞。設計合成一種特殊tRNA的基因，其產(chǎn)物的反密碼子能與(1)中的終止密碼子配對結合，并可攜帶一個非天然氨基酸(Uaa)。將該基因與________連接后導入宿主細胞。提取宿主細胞的________進行分子雜交鑒定，篩選獲得成功表達上述tRNA的轉基因宿主細胞。(3)利用轉基因宿主細胞制備疫苗。將(1)中的重組質粒導入(2)中的轉基因宿主細胞，并在補加________的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，則該宿主細胞能利用上述特殊tRNA，翻譯出改造病毒基因的完整蛋白，產(chǎn)生大量子代病毒，用于制備疫苗。特殊tRNA基因轉錄時，識別其啟動子的酶是________(單選)。A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶(4)上述子代病毒不能在正常宿主細胞中增殖，沒有致病性，因此不經(jīng)滅活或減毒即可制成疫苗。與不具侵染性的流感病毒滅活疫苗相比，該病毒活疫苗的優(yōu)勢之一是可引起________免疫，增強免疫保護效果。答案(1)PCR多肽(或蛋白質)(2)載體總RNA(3)非天然氨基酸(Uaa)D(4)細胞解析(1)利用PCR技術體外擴增DNA。若將基因中個別編碼氨基酸的序列替換為編碼終止密碼子的序列，則改造后的基因轉錄合成的mRNA中，終止密碼子提前出現(xiàn)，將不能控制合成完整長度的多肽(或蛋白質)。(2)目的基因只有與載體連接后才能導入宿主細胞?？商崛∷拗骷毎目俁NA進行分子雜交鑒定，以篩選獲得成功表達題述tRNA的轉基因宿主細胞。(3)由(2)知，轉基因宿主細胞含有特殊tRNA基因轉錄的tRNA，該tRNA的反密碼子可與終止密碼子配對，并可攜帶非天然氨基酸(Uaa)，所以培養(yǎng)基中需補加非天然氨基酸(Uaa)。病毒的基因進行轉錄時利用的是宿主細胞的酶，識別其啟動子的酶是宿主的RNA聚合酶。(4)因該病毒疫苗侵染人體細胞，故可引起細胞免疫。4．(2018·全國卷Ⅰ)回答下列問題：(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)將非洲爪蟾核糖體蛋白基因與質粒重組后導入大腸桿菌細胞中進行了表達，該研究除證明了質?？梢宰?/p>