分子生物學(xué)第4章：翻譯

翻譯

比DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄更為復(fù)雜的過程氨基酸活化與轉(zhuǎn)運(yùn)----這個(gè)過程是在氨基酸活化酶和鎂離子作用下把氨基酸激活成為活化氨基酸。起始----核糖體與mRNA結(jié)合并與氨?；鵷RNA生成起始復(fù)合物。延伸----由于核糖體沿mRNA5’端向3’端移動(dòng)，開始了從N端向C端的多肽合成，這是蛋白質(zhì)合成過程中速度最快的階段。終止以及肽鏈的釋放，核糖體從mRNA上解離，準(zhǔn)備新一輪合成反應(yīng)。

mRNA蛋白質(zhì)合成的模板蛋白合成的三種RNAtRNA氨基酸的運(yùn)輸工具

rRNA蛋白質(zhì)合成的場所

參與蛋白合成的RNA1.密碼子與反密碼子遺傳密碼貯存在DNA上的遺傳信息通過mRNA傳遞給蛋白質(zhì)，mRNA與蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系是通過遺傳密碼的破譯來實(shí)現(xiàn)的。mRNA上每3個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這3個(gè)核苷酸就稱為密碼，也叫三聯(lián)子密碼。

tRNA的識(shí)別只與反密碼子有關(guān)，而與tRNA上攜帶的氨基酸無關(guān)。Chapeville和Lipmann的試驗(yàn)：將放射性同位素標(biāo)記的半胱氨酸在半胱氨酰－tRNA合成酶催化下與tRNAcys形成半胱氨酰tRNAcys。然后用活性鎳作催化劑，使半胱氨酸轉(zhuǎn)變成丙氨酸，形成丙氨酰tRNAcys，然后將它放到網(wǎng)織紅細(xì)胞無細(xì)胞體系中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙氨酸插入到原半胱氨酸的位置中了。密碼子的性質(zhì)

簡并性：由一種以上密碼子編碼同一個(gè)氨基酸的現(xiàn)象。

18種氨基酸都有一個(gè)以上的密碼子

只有精氨酸是個(gè)例外，因?yàn)樵谡婧松镏蠧G雙聯(lián)子出現(xiàn)的頻率較低，所以盡管有4個(gè)密碼子同時(shí)編碼，蛋白質(zhì)中精氨酸的使用率仍不高。密碼子使用偏愛性

幾乎在所用的簡并密碼子家族中，都有一個(gè)或者兩個(gè)是優(yōu)先使用的偏愛密碼子；有一些密碼子在各種不同基因中（不管其編碼的蛋白質(zhì)的豐度如何）都是最常用的，例如CCG便是編碼Pro的4種同義密碼子中優(yōu)先使用的密碼子；高表達(dá)活性的基因往往比低表達(dá)活性的基因呈現(xiàn)高程度的密碼子偏愛性；簡并密碼子的使用頻率通常反映著它們相應(yīng)的tRNA的豐度。

密碼子使用偏愛性的原因

同工tRNA在細(xì)胞中有豐度差異，使用頻率高的密碼子由豐度高的相應(yīng)tRNA負(fù)責(zé)譯碼，反之亦然；

在某些物種中，密碼子的偏愛性與以嘧啶堿基（C和U）結(jié)尾的密碼子之間的非隨機(jī)選擇有關(guān)。

密碼子使用偏愛性對基因表達(dá)效率的影響：由于物種使用密碼子的偏愛性不同，使得那些使用大腸桿菌罕用密碼子的真核基因很難在大腸桿菌中有效表達(dá)，正是外源基因不同類型密碼子的使用頻率，使蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在質(zhì)和量兩個(gè)方面都受到影響。

密碼子的通用性與特殊性

遺傳密碼不管在體內(nèi)還是體外，不管是對病毒、細(xì)菌、動(dòng)物還是植物都是適用的，大量事實(shí)證明生命世界從低等到高等，都使用幾乎完全相同的一套密碼，這是密碼子的普遍性和通用性。

特殊性在支原體中，終止密碼子UGA被用來編碼色氨酸，在嗜熱四膜蟲中，另一個(gè)終止密碼子UAA被用來編碼谷氨酰胺。對人、牛及酵母線粒體DNA序列和結(jié)構(gòu)的研究還發(fā)現(xiàn)，在線粒體中也有不少例外情況。

線粒體與核DNA密碼子使用情況的比較

密碼子和反密碼子的相互作用：在蛋白質(zhì)生物合成過程中，tRNA的反密碼子在核糖體內(nèi)是通過堿基的反向配對與mRNA的密碼子相互作用的。1966年，Crick根據(jù)立體化學(xué)原理提出擺動(dòng)假說(wobblehypothesis)，解釋了反密碼子中某些稀有成分(如I)的配對，以及許多氨基酸有2個(gè)以上密碼子的問題。

搖擺假說（Wobblehypothesis）1.

任意一個(gè)密碼子的前兩位堿基都與tRNA反密碼子中的相應(yīng)堿基形成Watson-Crick堿基配對。2.

反密碼子第一位是A或C時(shí)，只能識(shí)別一個(gè)密碼子。當(dāng)反密碼子第一位是U或G時(shí)，能識(shí)別兩個(gè)密碼子。當(dāng)Inosine（I）作為反密碼子第一位時(shí)，能識(shí)別三個(gè)密碼子。3.

如果數(shù)個(gè)密碼子同時(shí)編碼一個(gè)氨基酸，凡是第一、二位堿基不相同的密碼子都對應(yīng)于各自的tRNA。4.根據(jù)上述規(guī)則，至少需要32種不同的tRNA才能翻譯61個(gè)密碼子。

在目前已知一級(jí)結(jié)構(gòu)的200多個(gè)tRNA中，反密碼子第一位為C、G、U、I者都符合擺動(dòng)假說。對某些密碼子來說，反密碼子的第一個(gè)堿基可識(shí)別4種密碼子，表明3對堿基中的第三對是無關(guān)緊要的，這就是所謂“三中配二”原則。

密碼子使用規(guī)律：

原核生物中大部分以AUG為起始密碼子，少數(shù)使用GUG，真核生物則全部使用AUG為起始密碼子，而終止密碼子UAA、UAG、UGA全部被使用，有時(shí)連用兩個(gè)密碼子，以便更保險(xiǎn)地終止肽鏈合成。在哺乳動(dòng)物中，對同義密碼子的使用差異甚大，有的廣泛使用，有些則有所偏愛。在大腸桿菌中，以C、U為結(jié)尾的同義密碼，若前兩個(gè)堿基為A、U，則第三位堿基優(yōu)先使用C而不是U，若前兩個(gè)堿基為C、G，則優(yōu)先使用U。

氨基酸的運(yùn)輸工具“中介作用”攜帶氨基酸反密碼子與mRNA的密碼子作用2.

tRNA由不超過100個(gè)核苷酸組成，稀有堿基和修飾堿基二級(jí)結(jié)構(gòu)是三葉草型，含有4個(gè)雙鏈的莖和4個(gè)單鏈的環(huán)。5‘端和3’端的堿基通過形成7個(gè)waston-Crick堿基配對將兩端拉在一起，形成受體臂。氨基酸通過與3端的核糖連接形成氨酰－tRNA分子。三葉草型的二級(jí)結(jié)構(gòu)可折疊成L－型的三級(jí)結(jié)構(gòu)。L型結(jié)構(gòu)由兩個(gè)螺旋以直角的方位構(gòu)成，結(jié)合氨基酸的一端稱為接受臂,另一端含有反密碼子，稱為反密碼子臂。與多肽合成有關(guān)的位點(diǎn)有：

1）氨基酸接受位點(diǎn)－－3‘端CCA。

2）識(shí)別氨酰－tRNA合成酶的位點(diǎn)。

3）識(shí)別核糖體的位點(diǎn)。

4）識(shí)別mRNA的位點(diǎn)－－反密碼子臂。tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)活化的氨基酸至mRNA模板上tRNAsecondarystructureDloopTloopAnticodonloop15:invariant8:RorYxtRNAtertiarystructuretRNAtertiarystructuretRNAtertiarystructure●

tRNA的”L”三維結(jié)構(gòu)與功能“L”結(jié)構(gòu)域的功能---aaacceptarm位于“L”的一端，契合于核糖體的P位點(diǎn)和A位點(diǎn),以利肽鍵的形成---anti-codonarm位于”L”另一端，與結(jié)合在核糖體小亞基上的codonofmRNA配對A

P---“L”結(jié)構(gòu)中堿基堆積力大使其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定

wobblebase

位于“L”結(jié)構(gòu)末端堆積力小自由度大使堿基配對搖擺---TΨCloop&DHUloop

位于“L”兩臂的交界處，利于“L”結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定tRNA種類起始tRNA和延伸tRNA同工tRNA校正tRNAAA-tRNA合成酶●

副密碼子---由若干Nt組成，存在于tRNA不定位置上---與AARS側(cè)鏈基團(tuán)的分子發(fā)生特異的“契合”---成為tRNA準(zhǔn)確負(fù)載氨基酸的機(jī)制之一1）氨酰－tRNA合成酶幫助使氨基酸結(jié)合到特定的tRNA上，氨酰－tRNA合成酶參與氨基酸與tRNA結(jié)合的二步反應(yīng)。a、氨基酸＋ATP

氨酰－AMP＋Ppi（活化）b、氨酰－AMP＋tRNA氨酰－tRNA＋AMP氨酰－tRNA合成酶催化的反應(yīng)是可逆的，其作用在于：

a、氨基酸與tRNA分子的結(jié)合使得氨基酸本身被活化，利于下一步肽健形成的反應(yīng)。

b、tRNA可以攜帶氨基酸到mRNA的特定部位，使氨基酸能夠被摻入到多肽鏈的合適位置。(反應(yīng)的專一性）2）每一個(gè)氨酰－tRNA合成酶可以識(shí)別一個(gè)特定的氨基酸和與此氨基酸對應(yīng)的tRNA的特定部位。酶與底物的選擇性主要由氫健來決定的。

例子：酪氨酰－tRNA合成酶與反應(yīng)中間物酪氨酰－腺苷復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析模型。反應(yīng)中間物結(jié)合在酶分子的一個(gè)深溝里，二者之間形成11個(gè)氫鍵。6個(gè)氫鍵涉及AMP部分，5個(gè)涉及酪氨酰部分。

3）氨酰－tRNA合成酶能夠糾正?；腻e(cuò)誤氨酰－tRNA合成有校正某些錯(cuò)誤的功能，可以水解非正確組合的氨基酸和tRNA之間形成的共價(jià)聯(lián)系。通過氨酰化部位以及校正部位的共同作用，可使翻譯過程的錯(cuò)誤頻率小于萬分之一。

COO－

COO－H3N+CHH3N+CHCHH3CCH

H3CCH3CH2

纈氨酸（Val.V）CH3

異亮氨酸

（Ile.I）

異亮氨酰tRNA合成酶纈氨酰－tRNAILe

+H2O

纈氨酸＋tRNAILe3.rRNA與核糖體

rRNAhaveGCcontentof60%

unusuallyrepetitive,dependingontheorganism,eachcellcontainsfromseveralhundredtoover20,000copiesofrDNAgene

rRNAsynthesizedinnucleolusandwasstimulatedbylowionicstrength&Mg+2

butotherRNAsynthesizedinniucleolpasmandstimulatedbyhighionicstrength&Mn+2

核糖體是蛋白質(zhì)的合成工廠

核糖體的一些基本特性是一個(gè)巨大的核糖核蛋白體。由rRNA和蛋白質(zhì)組成。原核中以游離核糖體形成或與mRNA結(jié)合形成串狀的多核糖體的形式，每個(gè)細(xì)胞約有20000多個(gè)。真核中一般與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相結(jié)合。形成粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，每個(gè)細(xì)胞中含有的數(shù)目為106～107。核糖體由兩個(gè)亞基組成，一大一小，其結(jié)構(gòu)組成如表所示。

rRNA在形成核糖體的結(jié)構(gòu)與功能起著重要作用。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是有許多雙螺旋區(qū)。核糖體的結(jié)構(gòu)模型核糖體上必須至少有5個(gè)以上的活性中心1）mRNA結(jié)受部位（在小亞基上）。2）結(jié)合或接受AA－tRNA部位（A位）（在大亞基上）。3）結(jié)合或接受肽基tRNA的部位。4）肽基轉(zhuǎn)移部位（P位）（在大亞基上）。5）肽健形成部位（轉(zhuǎn)肽酶中心）等。4.肽鏈的合成起始—延長—終止的過程肽鏈合成的方向多肽鏈的合成是從N端走向C端，合成速度極快，大腸桿菌中，一個(gè)核糖體每秒鐘可延伸20個(gè)氨基酸。mRNA上信息閱讀的方向是5‘-----3’inProk.

f

Met—tRNAf

met

&

Met--tRNAmetmAminoacyl—tRNAaainEuk.Met—tRNAI

met

&

Met--tRNA

mete

翻譯的起始(細(xì)菌)30S小亞基模板mRNAfMet-tRNAfMet起始因子（IF）GTP50S大亞基Mg2＋翻譯起始分為3步30S亞基與IF-1、IF-3結(jié)合，通過SD序列與mRNA模板結(jié)合在IF-2和GTP幫助下，fMet-tRNAfMet進(jìn)入小亞基P位點(diǎn)，反密碼子與起始密碼子配對與50S大亞基結(jié)合，GTP水解，釋放IF翻譯開始于mRNA與核糖體的結(jié)合蛋白質(zhì)合成中翻譯的開始需要在mRNA上選擇合適位置的起始密碼AUG，這一過程是通過核糖體小亞基與mRNA的結(jié)合。SD序列原核生物的mRNA中核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，即AUG起始密碼子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGU的部分或者全部，與16SrRNA的3‘末端互補(bǔ)。Shine-DelgarnoelementSD序列的重要性細(xì)菌毒素colecinE3可通過核酸酶的活性特異的在16SrRNA3’端切下50個(gè)堿基左右的片段，使得核糖體小亞基中的16SrRNA失去了與mRNA上SD序列互補(bǔ)的可能，由此抑制了細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。由于原核和真核生物在合成蛋白質(zhì)機(jī)制上的差異，colecinE3不影響真核生物的蛋白質(zhì)合成。

真核與原核在合成上的共同點(diǎn)：（1）核糖體小亞基結(jié)合起始tRNA（2）mRNA上必須有合適的起始密碼子（3）大亞基必須與已經(jīng)形成復(fù)合物的小亞基，起始tRNA、mRNA結(jié)合。

起始還需要非核糖體蛋白的起始因子（initationfactorIF）的參與。當(dāng)AUG(或GUG)密碼子位于核糖體P位點(diǎn)時(shí)，起始才能有效進(jìn)行，因?yàn)橹挥羞@時(shí)tRNA才能進(jìn)入小亞基和mRNA結(jié)合所產(chǎn)生的P位點(diǎn)。

當(dāng)與起始密碼子緊鄰的密碼子被其氨酰－tRNA上的反密碼子識(shí)別并結(jié)合后，延長反應(yīng)就開始了。在氨基酸的摻入過程中的三步反應(yīng)：進(jìn)位－轉(zhuǎn)位－移位進(jìn)位反應(yīng)：主要是密碼子與反密碼子的識(shí)別轉(zhuǎn)位反應(yīng)：涉及肽鍵的形成移位反應(yīng)：tRNA和mRNA相對核糖體的移動(dòng)具體過程見教材和flash動(dòng)畫

肽鏈延伸核糖體反應(yīng)中GTP的作用

每摻入一個(gè)氨基酸的延長過程中，都有二個(gè)GTP分子發(fā)生水解，GTP的結(jié)合和水解發(fā)生在EF-Tu和EF-G上。隨著GTP變成GDP，引起這些因子構(gòu)象變化，而從核糖體上解離。翻譯的終止需要釋放因子和終止密碼子的參加

1、合成好的肽酰－

tRNA的C端通終止涉及到二方面的解離過程過氨基酸酯鍵，從tRNA上的解離

2、mRNA與核糖體的解離

第一過程：需要終止密碼子和釋放因子（releasefactors,RFs）第二過程：需要核糖體釋放因子（ribosomereleasingfactor,RRF）細(xì)菌含3種不同的RFRF-1識(shí)別UAA和UAG.RF-2識(shí)別UAA和UGA.RF-3不識(shí)別終止密碼子，但能刺激另外二個(gè)因子的活性.

真核系統(tǒng)中只有一種釋放因子----RF可識(shí)別3種終止密碼子。

釋放因子的作用機(jī)理

細(xì)胞通常無識(shí)別終止密碼子的tRNA，這種識(shí)別與RF來完成。RF的功能是識(shí)別的mRNA上終止密碼子，終止肽鏈的合成并釋放核糖體。其機(jī)理是改變大亞基上的肽酰轉(zhuǎn)移酶的專一性，使肽酰轉(zhuǎn)移酶活性變成酯酶活性。它能結(jié)合水用于親核攻擊，水解肽鍵。多順反子mRNA的翻譯

大多數(shù)情況下，核糖體獨(dú)立地結(jié)合在一個(gè)順反子的起始位點(diǎn)。第一個(gè)順反子翻譯完成后，核糖體解離，離開mRNA，然后新的30S亞基結(jié)合在第二個(gè)順反子的起始位點(diǎn)，再結(jié)合50S亞基，開始第二個(gè)順反子的翻譯。若順反子之間的距離很短的話，30S亞基或短暫地解離，或在終止和重新起始過程中仍舊留在mRNA分子上。

核糖體在翻譯中能跳躍式讀碼

跳躍式讀碼屬于位移讀碼的特例，有的在翻譯過程中可以跳過一大段mRNA（約50個(gè)堿基左右）后繼續(xù)翻譯。這一過程類似于一種剪接方式