1.2微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用（第2課時(shí)）

第一章發(fā)酵工程第2節(jié)微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用（課前+課中+課后，三案一體）第2課時(shí)微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)課前案【預(yù)習(xí)新知】一、選擇培養(yǎng)基1.實(shí)驗(yàn)室中微生物篩選的原理：人為提供有利于目的菌生長的條件（包括營養(yǎng)、溫度和pH等），同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物的生長。2.選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。二、微生物的選擇培養(yǎng)1.培養(yǎng)基：配制相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基。2.樣品處理：對(duì)樣品進(jìn)行充分稀釋。3.接種方法：稀釋涂布平板法。4.培養(yǎng)（細(xì)菌）：將平板倒置，放入3037℃的恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12d。三、微生物的數(shù)量測定1.稀釋涂布平板法（1）原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長的一個(gè)單一菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。（2）計(jì)數(shù)原則：平板上菌落數(shù)應(yīng)在30300個(gè)，同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值。（3）不足：當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落，所以統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少。2.顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（1）計(jì)數(shù)工具：顯微鏡、細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（2）不足：由于計(jì)數(shù)結(jié)果是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和，所以一般比活菌的實(shí)際數(shù)目多。四、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)1.原理：絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離分解尿素的細(xì)菌。2.步驟【預(yù)習(xí)自測】1.因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量不同，所以，為獲得不同類型的微生物要按不同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行分離。(√)2.測定土壤中細(xì)菌總量和測定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍不同。(√)3.在同一稀釋度下，如果得到了兩個(gè)或兩個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，澤爾說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。（√）4.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目明顯少于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌種。（X）第2課時(shí)微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)課中案【導(dǎo)】自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合的菌群中不是優(yōu)勢種群時(shí)，僅通過一般的平板劃線法或稀釋涂布平板法很難實(shí)現(xiàn)。該怎么辦呢?【思】1.怎樣運(yùn)用生物與環(huán)境相適應(yīng)的觀點(diǎn)來理解選擇培養(yǎng)基的原理？2.如何通過調(diào)整培養(yǎng)基的配方來有目的地培養(yǎng)某種微生物？3.測定微生物數(shù)量的常用方法有哪些？【議】1.你如何設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來？培養(yǎng)基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖。2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？這種培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基相比，只是用尿素作為唯一氮源，培養(yǎng)基的其他營養(yǎng)成分基本相同。3.為什么只有能分解尿素的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長？分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可將尿素分解成氨，從而為微生物提供氮源。4.設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：如何驗(yàn)證所用的選擇培養(yǎng)基沒有受到污染？將未接種的培養(yǎng)基在適宜的溫度下放置適宜的時(shí)間，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生。5.在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？選用稀釋范圍更大的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)6.甲、乙兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。(1)甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230，該同學(xué)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果是否真實(shí)可靠？為什么？不真實(shí)。為增加實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性，應(yīng)設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果后計(jì)算平均值。(2)乙同學(xué)在該濃度下涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)將21舍去，然后取平均值。該同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理是否合理？為什么？不合理。微生物計(jì)數(shù)時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果差別很大的情況，應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)過程中可能的影響因素，找出差異的原因，而不能簡單地將結(jié)果舍棄后進(jìn)行計(jì)數(shù)?！菊埂繉W(xué)生展示討論結(jié)果【評(píng)】1.稀釋涂布平板法操作步驟2.對(duì)比平板劃線法和稀釋涂布平板法【檢】引導(dǎo)學(xué)生總結(jié)本節(jié)課內(nèi)容【練】完成課后案第2課時(shí)微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)課后案1．幽門螺桿菌（Hp）生存于人體胃的幽門部位，能夠引起慢性胃炎等胃部疾病。尿素在酶的作用下分解產(chǎn)生NH3和CO2。體檢時(shí)常用14C呼氣試驗(yàn)來診斷測試者是否感染Hp，測試者口服含14C標(biāo)記的尿素膠囊，一段時(shí)間后通過測定呼出的氣體是否含有14CO2來診斷是否感染Hp。醫(yī)務(wù)工作者也可以采集胃病患者樣本進(jìn)行微生物的純化操作，判斷是否感染Hp。下列相關(guān)分析錯(cuò)誤的是（

）A．呼氣試驗(yàn)的前提是Hp能合成和分泌脲酶，從而催化尿素分解.B．對(duì)樣本進(jìn)行微生物的純化操作時(shí)，一般采用固體培養(yǎng)基C．篩選Hp的培養(yǎng)基應(yīng)以尿素為唯一氮源，能抑制雜菌生長D．在培養(yǎng)基中可加入醋酸洋紅液來鑒定是否分離得到了Hp【答案】D【分析】1、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理：培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。2、分解尿素的細(xì)菌的鑒定：細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變紅，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素。本題主要考查微生物的培養(yǎng)與分離，考查學(xué)生的實(shí)驗(yàn)探究能力。對(duì)Hp進(jìn)行純化要得到單菌落，因此用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基應(yīng)以尿素為唯一氮源，能分解尿素的微生物（Hp）可生長，不能分解尿素的微生物不能生長。尿素分解產(chǎn)生的氨會(huì)使培養(yǎng)基的pH升高，使酚紅指示劑變紅?！驹斀狻緼、幽門螺桿菌（Hp）要能產(chǎn)生脲酶，14C標(biāo)記的尿素進(jìn)入胃后才能在其產(chǎn)生的脲酶的催化下能分解生成NH3和14CO2，一段時(shí)間后通過測定呼出的氣體是否含有14CO2才能診斷是否感染Hp，A正確；B、對(duì)Hp進(jìn)行純化需要得到Hp單菌落，所以需要用到固體培養(yǎng)基，B正確；C、培養(yǎng)基應(yīng)以尿素作為唯一氮源，可以允許能分解尿素的微生物（Hp）在此培養(yǎng)基中生長，同時(shí)抑制或阻止其他不能利用尿素的微生物的生長，C正確；D、細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)。在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑培養(yǎng)細(xì)菌，若指示劑變紅，可確定該種細(xì)菌能夠分解尿素，D錯(cuò)誤。故選D。2．血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一種常用于計(jì)數(shù)細(xì)菌、酵母菌等微生物數(shù)量的生物學(xué)工具。下列關(guān)于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板及其使用的說法，正確的是（）A．血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上有1個(gè)計(jì)數(shù)室B．若取樣的小方格中酵母菌過多，可選擇鄰近的一個(gè)小方格計(jì)數(shù)C．滴加培養(yǎng)液后，用濾紙?jiān)谘?xì)胞計(jì)數(shù)板一側(cè)邊緣吸引進(jìn)行引流D．待酵母菌菌體沉降到計(jì)數(shù)室底部后應(yīng)先在低倍鏡下觀察【答案】D【分析】血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用（以計(jì)數(shù)酵母菌為例）：（1）用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌懸液的酵母菌個(gè)數(shù)。（2）樣品稀釋的目的是便于酵母菌懸液的計(jì)數(shù)，以每小方格內(nèi)含有45個(gè)酵母細(xì)胞為宜，一般稀釋10倍即可。（3）將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板用擦鏡紙擦凈，在中央的計(jì)數(shù)室上加蓋專用的厚玻片。（4）將稀釋后的酵母菌懸液，用吸管吸取一滴置于蓋玻片的邊緣，使菌液緩緩滲入，多余的菌液用吸水紙吸取，稍待片刻，使酵母菌全部沉降到血細(xì)胞計(jì)數(shù)室內(nèi)。（5）計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用16格×5格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對(duì)角線位，取左上，右上，左下，右下4個(gè)中格（即100個(gè)小格）的酵母菌數(shù)。如果規(guī)格為25格×16格的計(jì)數(shù)板，除了取其4個(gè)對(duì)角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格（即80個(gè)小方格）的酵母菌數(shù)?！驹斀狻緼、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上有2個(gè)計(jì)數(shù)室，A錯(cuò)誤；B、若取樣的小方格中酵母菌過多，需對(duì)酵母菌培養(yǎng)液樣品進(jìn)一步稀釋后再重新計(jì)數(shù)，B錯(cuò)誤；C、在蓋玻片的邊緣滴加培養(yǎng)液，待培養(yǎng)液從邊緣處自行滲入計(jì)數(shù)室，用濾紙吸除血細(xì)胞計(jì)數(shù)板邊緣多余培養(yǎng)液，C錯(cuò)誤；D、待酵母菌菌體沉降到計(jì)數(shù)室底部后，先低倍鏡下觀察，后換用高倍顯微鏡觀察、計(jì)數(shù)，D錯(cuò)誤。故選D。3．某興趣小組擬檢測某品牌冰淇淋中的大腸桿菌數(shù)量是否超標(biāo)。下列敘述正確的是（

）A．在實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)將微生物培養(yǎng)的器皿、接種工具、操作者的手等進(jìn)行滅菌B．制作大腸桿菌培養(yǎng)基時(shí)，一般需將培養(yǎng)基pH調(diào)至酸性C．用稀釋涂布平板法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)時(shí)，結(jié)果往往比實(shí)際值低D．可利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)大腸桿菌直接進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)【答案】C【分析】1、檢測學(xué)校飲水機(jī)的直飲水中大腸桿菌是否超標(biāo)，應(yīng)對(duì)直飲水中的大腸桿菌進(jìn)行分離、計(jì)數(shù)，并對(duì)大腸桿菌進(jìn)行鑒定。2、微生物常見的接種的方法：①平板劃線法：將已經(jīng)熔化的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制成平板，接種，劃線，在恒溫箱里培養(yǎng)。在線的開始部分，微生物往往連在一起生長，隨著線的延伸，菌數(shù)逐漸減少，最后可能形成單個(gè)菌落。②稀釋涂布平板法：將待分離的菌液經(jīng)過大量稀釋后，均勻涂布在培養(yǎng)基表面，經(jīng)培養(yǎng)后可形成單個(gè)菌落。3、消毒是指使用較為溫和的物理、化學(xué)或生物等方法殺死物體表面或內(nèi)部一部分微生物。滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒和滅菌工作主要包括兩個(gè)方面：對(duì)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌。常用的消毒方法有煮沸消毒、巴氏消毒等；滅菌方法有濕熱滅菌、干熱滅菌和灼燒滅菌等?！驹斀狻緼、在實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)將微生物培養(yǎng)的器皿、接種工具等進(jìn)行滅菌，而操作者的手需要進(jìn)行消毒處理，A錯(cuò)誤；B、在培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，一般需要將培養(yǎng)基調(diào)至中性或弱堿性，B錯(cuò)誤；C、用稀釋涂布平板法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)時(shí)，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少，這是因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落，C正確；D、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板適用于真菌的計(jì)數(shù)，細(xì)菌計(jì)數(shù)板用于細(xì)菌的數(shù)量測定等，D錯(cuò)誤。故選C。4．一定濃度的抗生素會(huì)殺死細(xì)菌，但變異的細(xì)菌可能產(chǎn)生耐藥性。為探究某種抗生素對(duì)大腸桿菌的選擇作用，將大腸桿菌培養(yǎng)液接種到培養(yǎng)基上后，繼續(xù)放置含該抗生素的圓形濾紙片和不含抗生素的圓形濾紙片，一段時(shí)間后測量濾紙片周圍抑菌圈的直徑，第一代培養(yǎng)結(jié)果如圖所示。然后再重復(fù)上述步驟培養(yǎng)三代。與上述實(shí)驗(yàn)相關(guān)的描述不符的是（）A．圖中1處放入不含抗生素的濾紙片起到對(duì)照作用B．可采用稀釋涂布平板法將大腸桿菌接種到固體培養(yǎng)基上C．應(yīng)從抑菌圈邊緣的菌落里挑取大腸桿菌繼續(xù)培養(yǎng)D．隨培養(yǎng)代數(shù)增多，抑菌圈的直徑變得越大，說明細(xì)菌的耐藥性越強(qiáng)【答案】D【分析】一般情況下，一定濃度的抗生素會(huì)殺死細(xì)菌，但變異的細(xì)菌可能產(chǎn)生耐藥性。在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)，如果向培養(yǎng)基中添加抗生素，耐藥菌有可能存活下來?！驹斀狻緼、為排除濾紙片對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，應(yīng)增設(shè)空白對(duì)照組，即增加不含抗生素的濾紙片或含無菌水的濾紙片作為對(duì)照組；平板1號(hào)區(qū)域的濾紙片不含抗生素，起空白對(duì)照的作用，A正確；B、稀釋涂布平板法可以獲得的單個(gè)菌落且便于計(jì)數(shù)，故采用稀釋涂布平板法將大腸桿菌接種到固體培養(yǎng)基上，B正確；C、抑菌圈邊緣上的細(xì)菌可能產(chǎn)生了耐藥性，實(shí)驗(yàn)中需要從抑菌圈邊緣的菌落上挑取細(xì)菌，接種到已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，C正確；D、根據(jù)題干信息實(shí)驗(yàn)人員在接種了大腸桿菌的培養(yǎng)基中放置了含某種抗生素的圓形濾紙片和不含抗生素的圓形濾紙片，故抑菌圈直徑越小，說明細(xì)菌的耐藥性越強(qiáng)，由題表可知隨培養(yǎng)代數(shù)增多，抑菌圈的直徑越小，說明細(xì)菌的耐藥性越強(qiáng)，D錯(cuò)誤。故選D。5．細(xì)菌氣溶膠是由懸浮于大氣或附著于顆粒物表面的細(xì)菌形成的。利用空氣微生物采樣器對(duì)某市人員密集型公共場所采樣并檢測細(xì)菌氣溶膠的濃度（菌落數(shù)/m3）。下列敘述錯(cuò)誤的是（

）A．采樣前需對(duì)空氣微生物采樣器進(jìn)行無菌處理B．細(xì)菌氣溶膠樣品恒溫培養(yǎng)時(shí)需將平板倒置C．同一稀釋度下至少對(duì)3個(gè)平板計(jì)數(shù)并取平均值D．稀釋涂布平板法檢測的細(xì)菌氣溶膠濃度比實(shí)際值高【答案】D【分析】稀釋涂布平板計(jì)數(shù)是根據(jù)微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的單個(gè)菌落，即是由一個(gè)單細(xì)胞繁殖而成這一培養(yǎng)特征設(shè)計(jì)的計(jì)數(shù)方法，即一個(gè)菌落代表一個(gè)單細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)，首先將待測樣品制成均勻的系列稀釋液，盡量使樣品中的微生物細(xì)胞分散開，使成單個(gè)細(xì)胞存在（否則一個(gè)菌落就不只是代表一個(gè)細(xì)胞），再取一定稀釋度、一定量的稀釋液接種到