β內(nèi)酰胺酶(拮抗劑)杯碟法等檢測(cè)方法-內(nèi)部資料

β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）管控與檢測(cè)方法現(xiàn)場(chǎng)講解深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司

主要內(nèi)容主要內(nèi)容：深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司簡(jiǎn)介認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法深圳易瑞β內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓(xùn)牧場(chǎng)β內(nèi)酰胺酶的建議管控方法區(qū)分內(nèi)源性與外源性β內(nèi)酰胺酶的方法移液槍操作注意事項(xiàng)深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司簡(jiǎn)介公司簡(jiǎn)介：企業(yè)成長(zhǎng)趨勢(shì)與相關(guān)榮譽(yù)企業(yè)承擔(dān)部分國(guó)家科研項(xiàng)目企業(yè)部分專(zhuān)利企業(yè)產(chǎn)品第三方驗(yàn)證報(bào)告易瑞生物產(chǎn)品簡(jiǎn)介深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司簡(jiǎn)介企業(yè)成長(zhǎng)趨勢(shì)與相關(guān)榮譽(yù)深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司簡(jiǎn)介企業(yè)承擔(dān)部分國(guó)家科研項(xiàng)目科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：09C26214425280）科技部國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2011DFA32930）國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：

2012BAK17B10）科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（項(xiàng)目編號(hào)：

13C26214424714

）深圳市科技研發(fā)資金技術(shù)研究開(kāi)發(fā)計(jì)劃——深港創(chuàng)新圈合作研發(fā)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：JSE201109160036A）深圳市2013技術(shù)創(chuàng)新計(jì)劃技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：重2013-027）深圳市戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：

CXZZ20120615163555764）深圳市技術(shù)研究開(kāi)發(fā)計(jì)劃-國(guó)際科技合作項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：

ZYA201007070114A）深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司簡(jiǎn)介企業(yè)部分專(zhuān)利（已申請(qǐng)和授權(quán)專(zhuān)利15項(xiàng)，包括國(guó)際專(zhuān)利（PCT））一種提高競(jìng)爭(zhēng)免疫分析靈敏性的方法（2012102333772）利用免疫層析技術(shù)區(qū)分檢測(cè)具有相似分子結(jié)構(gòu)的小分子（201210547765.8）一種超靈敏、定量免疫層析裝置及檢測(cè)方法（2011102041572）具有殼核結(jié)構(gòu)的磁性熒光納米顆粒的制備方法及應(yīng)用（2011102956054）瘦肉精聯(lián)檢試紙條（201220716928.6）硝基呋喃代謝物檢測(cè)裝置（2013200116973）孔雀石綠快速檢測(cè)裝置（2013200355298）氯霉素快速檢測(cè)裝置（2013200469049）β-激動(dòng)劑類(lèi)藥物檢測(cè)裝置及方法（2012100015099）深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司簡(jiǎn)介企業(yè)承擔(dān)部分國(guó)家科研項(xiàng)目國(guó)家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)）國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（南京）技術(shù)復(fù)核鑒定：

深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試紙條：簡(jiǎn)便、快速、靈敏；檢測(cè)結(jié)果與液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定結(jié)果相符。深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司簡(jiǎn)介易瑞生物部分產(chǎn)品簡(jiǎn)介認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）什么是β內(nèi)酰胺酶β內(nèi)酰胺酶的單位β內(nèi)酰胺酶的分類(lèi)β內(nèi)酰胺酶的來(lái)源β內(nèi)酰胺酶的危害認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）什么是β內(nèi)酰胺酶

β-內(nèi)酰胺酶是由多種酶組成的酶家族，是一種由細(xì)菌產(chǎn)生的能水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的酶。這些酶的基因存在于細(xì)菌的染色體或質(zhì)粒中。β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細(xì)菌對(duì)(β內(nèi)酰胺類(lèi))抗菌藥物耐藥最常見(jiàn)的機(jī)制，在各種耐藥機(jī)制中占80%；絕大多數(shù)致病菌產(chǎn)生青霉素類(lèi)和頭孢菌素類(lèi)耐藥性的主要原因即為耐藥菌產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶所致。

特別注意：

1個(gè)產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酶胺酶（ESBL）菌株在生鮮牛乳體外培養(yǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶的活力（50~85U/ml）。認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）什么是β內(nèi)酰胺酶其他相關(guān)文獻(xiàn)指出：

1.獸醫(yī)臨床統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)表明：患病乳牛長(zhǎng)期使用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性；耐藥菌自身能夠代謝產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶；不同區(qū)域分布、不同品種乳牛、不同類(lèi)型的抗生素使用之后內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶的在奶中的分布情況各不相同。2.引起乳房炎的主要病原菌對(duì)青、鏈霉素有很強(qiáng)的耐藥性。在杯碟法培養(yǎng)中如果存在耐藥菌即使無(wú)β-內(nèi)酰胺酶添加也不能產(chǎn)生青霉素抑菌圈（內(nèi)源性酶杯碟法一樣可以檢出）。認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）β內(nèi)酰胺酶的單位

1.《中國(guó)藥典》（2005版）定義的β-內(nèi)酰胺酶活力單位為：規(guī)范化的β-內(nèi)酰胺酶活性濃度標(biāo)識(shí)U/mL，這里的活性單位U特指：37℃，每小時(shí)分解青霉素活性單位的量。2.β-內(nèi)酰胺酶的活性單位定義為：在特定條件下（37℃），1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化1微摩爾底物（青霉素），或者底物中1微摩爾有關(guān)基團(tuán)所需的酶量，稱(chēng)為一個(gè)國(guó)際單位（IU）。

由以上內(nèi)容可知：因活性無(wú)法準(zhǔn)確獲得，且抗原抗體反應(yīng)的量受樣本基質(zhì)等均有影響，在U與IU兩個(gè)單位間無(wú)絕對(duì)的換算關(guān)系。

認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）β內(nèi)酰胺酶的來(lái)源

內(nèi)源性：β-內(nèi)酰胺酶是一種耐藥菌所特有的分解抗生素的酶，這種酶能分解β-內(nèi)酰胺類(lèi)的抗生素，比如青霉素、頭孢等都屬于β-內(nèi)酰胺類(lèi)的抗生素。而β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素是應(yīng)用最廣泛的抗生素，用于治療牛乳腺炎和其他細(xì)菌感染性疾病。因此，牛奶中檢測(cè)出β-內(nèi)酰胺酶很可能是奶牛體內(nèi)自身細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的；

外源性：首先在清洗有β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素奶殘留的奶罐時(shí)作為拮抗劑使用，使得β內(nèi)酰胺酶殘留到新灌入的生奶中；其次是人為加入β-內(nèi)酰胺酶，因?yàn)樗芊纸馀Ｄ讨袣埩舻摩?內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，為抗生素打掩護(hù)。（目前已有區(qū)分內(nèi)源性與外源性的具體方法，詳詢易瑞工程師）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）β內(nèi)酰胺酶的分類(lèi)

β-內(nèi)酰胺酶按照降解產(chǎn)物可分為4類(lèi)：第一類(lèi)為頭孢菌素酶第二類(lèi)為青霉素酶和超廣譜酶第三類(lèi)為金屬酶第四類(lèi)為其他不能被克拉維酸完全抑制的青霉素酶（應(yīng)用最廣泛的為前兩類(lèi)）

β內(nèi)酰胺酶按照抑制劑作用可分為3類(lèi)：舒巴坦敏感的β內(nèi)酰胺酶（杯碟法檢測(cè)該類(lèi)）克拉維酸敏感的β內(nèi)酰胺酶他唑巴坦敏感的β內(nèi)酰胺酶（對(duì)β酶的抑制作用強(qiáng)度依次為：他唑巴坦>舒巴坦>克拉維酸）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）認(rèn)識(shí)牛乳中的β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）β內(nèi)酰胺酶的危害隨著抗生素的不合理應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性隨之產(chǎn)生，細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的原因很多，β-內(nèi)酰胺酶仍是細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥的主要原因，微量的β—內(nèi)酰胺酶對(duì)人體不會(huì)產(chǎn)生明顯的危害。β—內(nèi)酰胺酶的本質(zhì)是一種蛋白，攝入體內(nèi)之后，會(huì)被分解，不會(huì)長(zhǎng)期存在體內(nèi)；但是，病人在服用β—內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素后，再喝下含有β—內(nèi)酰胺酶的牛奶，那么抗生素的作用就會(huì)減弱，從而影響疾病的治療。時(shí)間久了，臨床上將無(wú)藥可用，即產(chǎn)生所謂的超級(jí)細(xì)菌。同時(shí)，對(duì)于未殺菌的鮮奶喝入人體后，耐藥菌將長(zhǎng)期生存在人體內(nèi)使得人體對(duì)于抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性，最終因抗生素藥物治療無(wú)效導(dǎo)致某些尋常疾病因無(wú)藥可救而奪去人類(lèi)性命。β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法舒巴坦敏感的β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)—杯碟法深圳易瑞抗原抗體法快速檢測(cè)—試紙條法其他檢測(cè)方法β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法舒巴坦敏感的β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)—杯碟法

本檢測(cè)方法為間接法，用對(duì)青霉素類(lèi)藥物絕對(duì)敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株藤黃微球菌作為指示菌，利用舒巴坦特異性抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性間接測(cè)定樣品是否含有β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物。在參照杯（本方法中的C和D杯)能證明加入的舒巴坦有活性的前提下比較判定杯(本方法中的A和B杯)抑菌圈直徑，如果抑菌圈直徑相差<3mm，即兩杯中的抗生素均未被分解，證明樣品中無(wú)β-內(nèi)酰胺酶殘留；如果抑菌圈直徑相差≥3mm，即未加舒巴坦的A杯中抗生素被分解，而加入舒巴坦的B杯中抗生素未被分解，證明樣品中有β-內(nèi)酰胺酶殘留。本方法的檢出限為0.5U/ml本方法單樣檢測(cè)時(shí)間為24小時(shí)。

————以上內(nèi)容參考蒙牛乳業(yè)《β-內(nèi)酰胺酶類(lèi)藥物檢測(cè)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)》P.7β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法深圳易瑞抗原抗體法快速檢測(cè)—試紙條法

本檢測(cè)方法亦為間接法，利用β-內(nèi)酰胺酶在原奶中強(qiáng)大的降解β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的能力，人為向原奶中添加一定濃度的β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的溫育反應(yīng)后用易瑞抗原抗體反應(yīng)體系檢測(cè)β內(nèi)酰胺類(lèi)殘留，如果原奶中β類(lèi)抗生素為陽(yáng)性(+)，即添加的β類(lèi)抗生素未被分解掉，證明原奶中無(wú)β-內(nèi)酰胺酶殘留；如果原奶中抗生素為陰性(-)，即添加的抗生素被分解掉，證明原奶中有β-內(nèi)酰胺酶殘留。本方法的檢出限：0.25-0.5U（31min）、0.75-1.5U（22min）以及2-3U（15min）；本方法的檢測(cè)時(shí)間為15-31分鐘不等本方法31分鐘檢出限與杯碟法非常吻合（據(jù)江蘇省質(zhì)檢院驗(yàn)證）β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法β內(nèi)酰胺酶（拮抗劑）的檢測(cè)方法其他檢測(cè)方法

其他檢測(cè)方法如碘量法以及E50抗生素間接法等，包括進(jìn)口

Snap，Charm相關(guān)檢測(cè)方法對(duì)于β內(nèi)酰胺酶的檢出限均在4U或以

上，且檢測(cè)時(shí)間在40分鐘-2小時(shí)不等。深圳易瑞β內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓(xùn)深圳易瑞β內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓(xùn)-檢測(cè)方法：第一步：溫育器溫度自動(dòng)跳至40℃，待其穩(wěn)定；第二步：首先取出白色反應(yīng)微孔，加入200ul待測(cè)樣品，吸打混勻；

第三步：白色微孔混勻后放在加熱器上孵育25分鐘（檢出限約0.5U，與杯碟法真實(shí)檢出限基本一致）：

注意：孵育16分鐘，檢出限為0.75-1.5U孵育9分鐘，檢出限為2-3U

牛乳中β內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試紙條操作演示深圳易瑞β內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓(xùn)-檢測(cè)方法：第四步：從加熱器上取下白色微孔，將白色微孔中的溶液完全轉(zhuǎn)入到紅色微孔，在紅色微孔混勻后，完全吸取并轉(zhuǎn)回至原白色微孔中，再次混勻；并重新放回至加熱器；第五步：在加熱器上孵育3分鐘：牛乳中β內(nèi)酰胺酶快速檢測(cè)試紙條操作演示深圳易瑞β內(nèi)酰胺酶產(chǎn)品操作培訓(xùn)-檢測(cè)方法：第六步：3分鐘孵育時(shí)間到后，插入β內(nèi)酰胺酶試紙條，試紙條孵育3分鐘后肉眼讀取結(jié)果或者讀數(shù)儀判定結(jié)果：讀數(shù)儀判定：讀數(shù)值<0.9為陰性讀數(shù)值>0.9為陽(yáng)性（讀數(shù)必須在實(shí)驗(yàn)結(jié)束3分鐘內(nèi)讀取有效）注意：1.待檢樣大于3個(gè)時(shí)請(qǐng)用排槍進(jìn)行轉(zhuǎn)移以及混勻操作；2.白色微孔所含為β類(lèi)抗生素，與待檢樣內(nèi)的β酶競(jìng)爭(zhēng)從而通過(guò)消耗掉的抗生素來(lái)判斷β酶的含量，故白色孔兩步轉(zhuǎn)回目的是減少人為消耗β類(lèi)抗生素而造成假陽(yáng)性。牧場(chǎng)β內(nèi)酰胺酶的建議管控方法牧場(chǎng)β內(nèi)酰胺酶的建議管控方法停止使用“拮抗劑”清洗奶罐等設(shè)備；從牧場(chǎng)源頭依據(jù)每頭牛的用藥記錄找出2次以上使用過(guò)β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素藥物的奶牛，暫停其正常供奶，并用易瑞試紙條對(duì)該牛的鮮奶進(jìn)行監(jiān)測(cè)：剛擠出的鮮奶檢測(cè)結(jié)果為陰性的牛奶2-8℃保存12小時(shí)后充分混勻并再次檢測(cè)，結(jié)果為陰性的用藥牛暫無(wú)耐藥菌，結(jié)果為陽(yáng)性的用藥牛已經(jīng)產(chǎn)生耐藥菌，在體外能夠大量代謝β內(nèi)酰胺酶使得整個(gè)儲(chǔ)奶罐變?yōu)殛?yáng)性（依據(jù)：1個(gè)產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酶胺酶耐藥菌株在生鮮牛乳體外培養(yǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶的活力50~85U/ml）；對(duì)陽(yáng)性牛采取治療（具體方法咨詢獸醫(yī)或者電聯(lián)易瑞工程師）；對(duì)該牧場(chǎng)已使用過(guò)的β內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的牛采取輪換用藥的形式避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生（或采取抗生素協(xié)同抑制劑藥物進(jìn)行乳房炎疾病的治療等）；區(qū)分內(nèi)源性與外源性β內(nèi)酰胺酶的方法區(qū)分內(nèi)源性與外源性β內(nèi)酰胺酶的方法：陽(yáng)性樣品倍比稀釋獲得臨界陰性奶樣并體外細(xì)菌培養(yǎng)法；陽(yáng)性樣品離心法獲得耐藥菌群添加實(shí)驗(yàn)鑒別法（詳