轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后加工

關(guān)于轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后加工12第一節(jié)轉(zhuǎn)錄概述第2頁,共165頁，2024年2月25日，星期天3一、轉(zhuǎn)錄生物體以DNA為模板合成RNA的過程叫做轉(zhuǎn)錄(transcription)?；虮磉_(dá)(geneexpression):基因所貯存的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)生具有生物功能的多肽和蛋白質(zhì)的過程。階段特異性（時間特異性）組織特異性（空間特異性）第3頁,共165頁，2024年2月25日，星期天4

轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(Regulatoryprotein)決定了一個基因能否被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。生物體基因表達(dá)調(diào)控的第一步也就是決定是否要讓該基因轉(zhuǎn)錄。對于大多數(shù)基因來說，這是最重要的調(diào)控機(jī)制，在有些情況下甚至是唯一的調(diào)控機(jī)制。第4頁,共165頁，2024年2月25日，星期天5RNA分為3種:（1）信使RNA分子(mRNA)，含有一條或多條多肽鏈的氨基酸順序的信息；（2）轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA),可以閱讀mRNA中的信息,并在蛋白質(zhì)合成中攜帶和轉(zhuǎn)移特定的氨基酸到生長中的多肽鏈上；（3）核糖體RNA(rRNA),它與蛋白質(zhì)結(jié)合,形成蛋白質(zhì)合成的場所—核糖體。第5頁,共165頁，2024年2月25日，星期天6二、轉(zhuǎn)錄單位(Transcriptionunit)DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指引轉(zhuǎn)錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈（templatestrand），也稱作反義鏈（antisensestrand）或負(fù)鏈。相對的另一股單鏈?zhǔn)蔷幋a鏈（codingstrand），也稱為有義鏈（sensestrand）或正鏈。

第6頁,共165頁，2024年2月25日，星期天75′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtcatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯第7頁,共165頁，2024年2月25日，星期天8DNA模板與mRNA分子及多肽鏈之間存在共線性關(guān)系。第8頁,共165頁，2024年2月25日，星期天9RNA合成由RNA聚合酶(RNApolymerase)催化。當(dāng)RNA聚合酶結(jié)合到稱為啟動子(Promoter)的DNA特異轉(zhuǎn)錄起始區(qū)時，轉(zhuǎn)錄就開始了。啟動子通常在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)附近，即位于RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的第一個堿基對附近。RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(Startpoint)開始沿模板邊移動邊合成RNA，直至終止序列。從啟動子延伸到終止子(Terminator)所跨越的部分稱為一個轉(zhuǎn)錄單位。

第9頁,共165頁，2024年2月25日，星期天10第10頁,共165頁，2024年2月25日，星期天11位于起始位點(diǎn)之前的序列稱為轉(zhuǎn)錄單位的上游(Upstream)，起始位點(diǎn)之后(在轉(zhuǎn)錄序列之內(nèi))的序列被稱為下游(Downstream)。按照書寫規(guī)范，轉(zhuǎn)錄是從左(上游)向右(下游)進(jìn)行的，與mRNA的通常書寫形式：5'-3'方向一致。堿基的位置以起始位點(diǎn)為準(zhǔn)，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)被定為+1，位于其下游的堿基序數(shù)按順序值遞增。起始位點(diǎn)前的一個堿基的位置被定義為-1，越靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，堿基負(fù)值也越大。

第11頁,共165頁，2024年2月25日，星期天12轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物被稱為初始轉(zhuǎn)錄本(primarytranscript)。它包含一條從啟動子延伸到終止子含有5'端及3'端的RNA。初始轉(zhuǎn)錄本通常不穩(wěn)定:在原核生物中，它或被迅速降解(對于mRNA)，或被剪接成為成熟產(chǎn)物(對于rRNA和tRNA).在真核生物中,它或被末端修飾(主要對于mRNA)，或被剪接成為成熟產(chǎn)物(對于所有RNA).第12頁,共165頁，2024年2月25日，星期天13三、不對稱轉(zhuǎn)錄(asymmetrictranscription)

DNA分子的雙鏈均有轉(zhuǎn)錄功能，但對于一個特定的DNA區(qū)域或?qū)σ粋€特定的mRNA，只能有一條鏈為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，這種現(xiàn)象叫轉(zhuǎn)錄的不對稱性,即在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄。RNA合成過程，天然雙鏈DNA為不對稱轉(zhuǎn)錄，但體外條件下，一般DNA的2條鏈都可以作為模板鏈轉(zhuǎn)錄RNA，稱為對稱轉(zhuǎn)錄。

第13頁,共165頁，2024年2月25日，星期天145

3

3

5

模板鏈編碼鏈（codingstrand）結(jié)構(gòu)基因(structuralgene)編碼鏈模板鏈（templatestrand）

DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一條鏈可轉(zhuǎn)錄，另一條鏈不轉(zhuǎn)錄，但模板鏈并非永遠(yuǎn)在同一單鏈上。第14頁,共165頁，2024年2月25日，星期天15四、轉(zhuǎn)錄的一般特征1.底物:4種核糖核苷三磷酸，ATP,GTP,CTP,UTP;2.與DNA復(fù)制一樣，轉(zhuǎn)錄的方向總是從5′→3′;3.模板:以一條DNA鏈為模板，按堿基互補(bǔ)規(guī)律，在轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄;4.不需要引物:RNA聚合酶能起始一條新鏈的合成，起始的核苷酸一般是嘌呤核苷酸（占90%左右），而且將在RNA鏈的5’末端保持這一三磷酸基團(tuán);

第15頁,共165頁，2024年2月25日，星期天16RNA合成主要包括四個步驟：（1）RNA聚合酶結(jié)合于DNA上的特定位點(diǎn)（2）起始（3）鏈的延長（4）鏈的終止和釋放

第16頁,共165頁，2024年2月25日，星期天17第17頁,共165頁，2024年2月25日，星期天18第二節(jié)RNA合成的酶學(xué)第18頁,共165頁，2024年2月25日，星期天19 RNA聚合酶是轉(zhuǎn)錄過程中最關(guān)鍵的酶，主要以雙鏈DNA為模板，以四種核苷三磷酸作為活性前體，并以Mg2+/Mn2+為輔助因子，催化RNA鏈的起始、延伸和終止，它不需要任何引物，催化生成的產(chǎn)物是與DNA模板鏈互補(bǔ)的RNA。第19頁,共165頁，2024年2月25日，星期天20一、E.coliRNA聚合酶E.coliRNA聚合酶由6個亞基組成（5個多肽鏈），即α2ββ′σω

αββ′σ四個亞基的分子量分別為36.5KDa、150KDa、160KDa和82KDa，整個酶分子的分子量為465KDa;

分別是基因rpoA、rpoB、rpoC和rpoD的產(chǎn)物;與RNA聚合酶相結(jié)合的一個很小的蛋白質(zhì)(MW＝10KDa)，叫做ω亞基，其功能尚不清楚，有人認(rèn)為ω亞基對于RNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能沒有太大的影響。

第20頁,共165頁，2024年2月25日，星期天21原核生物的RNA聚合酶亞單位分子量亞單位數(shù)組分功能α365122核心酶決定哪種基因被轉(zhuǎn)錄β1506181核心酶與轉(zhuǎn)錄全過程有關(guān)β’1556131核心酶結(jié)合DNA模板ω110001核心酶未知σ702631σ因子辨認(rèn)起始點(diǎn)第21頁,共165頁，2024年2月25日，星期天22αββ′σω這樣的酶稱為全酶，RNA聚合酶是指全酶。從全酶中去除σ亞基后的其余部分（α2ββ′ω

）稱為核心酶;

核心酶

coreenzyme

全酶

holoenzyme第22頁,共165頁，2024年2月25日，星期天23σ亞基的最主要功能是識別啟動子，細(xì)胞內(nèi)DNA雙鏈的哪條鏈被轉(zhuǎn)錄，即轉(zhuǎn)錄的方向、轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的選擇都與σ亞基有關(guān);

不同的σ亞基識別不同類型的啟動子，可借以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，而核心酶相同，即哪條鏈被轉(zhuǎn)錄，起始點(diǎn)在什么地方靠σ亞基識別，與核心酶無關(guān)。σ亞基是酶的別構(gòu)效應(yīng)物，使酶專一性識別模板上的啟動子。第23頁,共165頁，2024年2月25日，星期天24核心酶在T7噬菌體DNA上約有1300個結(jié)合位點(diǎn)，平均結(jié)合常數(shù)為2x1011;

σ亞基（因子）可以極大地提高RNA聚合酶對啟動子區(qū)DNA序列的親和力，酶底結(jié)合常數(shù)提高103倍，酶底復(fù)合物的半衰期可達(dá)數(shù)小時甚至數(shù)十小時。σ因子還能使RNA聚合酶與模板DNA上非特異性位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)降低104倍，使酶底復(fù)合物的半衰期小于1秒。第24頁,共165頁，2024年2月25日，星期天25枯草桿菌中有6種不同相對分子質(zhì)量的σ因子，其中σ55是主要存在形式，出現(xiàn)在營養(yǎng)細(xì)胞中，σ29則主要出現(xiàn)在胞子形成階段，參與胞子形成期基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。在大腸桿菌中，最常見的調(diào)控因子是由rpoD基因所編碼的σ70。第25頁,共165頁，2024年2月25日，星期天26由rpoH編碼的σ32是與熱休克啟動子所控制的基因轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。由rpoN編碼的σ54則參與細(xì)胞的氮代謝。由T4噬菌體所編碼的σ55能與大腸桿菌RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，啟動T4晚期基因的轉(zhuǎn)錄。第26頁,共165頁，2024年2月25日，星期天27β亞基參與底物的結(jié)合（包括前體核苷三磷酸以及已經(jīng)形成的RNA鏈），催化磷酸二酯鍵的形成;

在E.coli細(xì)胞里，某些藥物如利福霉素類藥物（抑制RNA合成的起始）和鏈霉溶菌素（抑制RNA鏈的延伸）能有效抑制RNA合成，試驗(yàn)證明，這2種藥物均作用于β亞基;同時，發(fā)現(xiàn)β亞基與前體核苷三磷酸有很強(qiáng)的親和力。第27頁,共165頁，2024年2月25日，星期天28β′亞基參與反義鏈結(jié)合。在離體轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)中，肝素(heparin)能抑制轉(zhuǎn)錄作用，人們發(fā)現(xiàn)肝素是與β′亞基緊密結(jié)合的。β′亞基是堿性最強(qiáng)的亞基，而肝素是一種酸性的粘多糖，正好與核酸競爭β′亞基，從而妨礙β′亞基與反義鏈的結(jié)合。第28頁,共165頁，2024年2月25日，星期天29α亞基可能參與全酶和啟動子的牢固結(jié)合。這一牢固結(jié)合需要DNA雙螺旋的局部解鏈；當(dāng)RNA聚合酶核心酶沿著模板移動、進(jìn)行RNA鏈的延伸時，需要不斷地在前面解開雙螺旋，在后面恢復(fù)雙螺旋，這些作用可能與兩個α亞基的功能有關(guān)。

RNA聚合酶僅僅是復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的核心部分。除了RNA聚合酶之外，還需要其他一些輔助的蛋白質(zhì)因子。如在轉(zhuǎn)錄終止時發(fā)生作用的釋放因子(ρ因子)和抗終止因子等。參與起始作用的σ因子習(xí)慣上算作RNA聚合酶的成分，其實(shí)也是一種輔助因子。第29頁,共165頁，2024年2月25日，星期天30二、真核生物的RNA聚合酶真核細(xì)胞中有三種RNA聚合酶，即RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ、RNA聚合酶Ⅲ;

這些名稱最早是依據(jù)它們從DEAE－纖維素柱上洗脫的先后順序而定出來的。后來發(fā)現(xiàn)不同生物的三種RNA聚合酶的洗脫順序并不相同，因而改用三種不同的RNA聚合酶對于α-鵝膏蕈堿(α-amanitine)的敏感性不同來進(jìn)行區(qū)別。RNA聚合酶I基本不受α-鵝膏蕈堿的抑制，在大于10－3mol/L時才表現(xiàn)出輕微的抑制作用；RNA聚合酶Ⅱ?qū)τ讦?鵝膏蕈堿最為敏感，在10-9-10-8mol/L濃度下就會被抑制;

RNA聚合酶Ⅲ的敏感性介于RNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ之間，在10-5-10-4mol/L時表現(xiàn)抑制作用。第30頁,共165頁，2024年2月25日，星期天31真核生物的RNA聚合酶

種類

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

對鵝膏蕈堿的反應(yīng)

rRNAsnRNAmRNA

5S-rRNA

tRNA耐受極敏感中度敏感轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物第31頁,共165頁，2024年2月25日，星期天32RNA聚合酶Ⅰ主要存在于核仁中，其功能是合成5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA;RNA聚合酶Ⅱ存在于核質(zhì)中，其功能是合成mRNA以及snRNA;RNA聚合酶Ⅲ也存在于核質(zhì)中，其功能是合成tRNA和5SrRNA以及轉(zhuǎn)錄Alu序列。第32頁,共165頁，2024年2月25日，星期天33在細(xì)胞質(zhì)中也能發(fā)現(xiàn)一些RNA聚合酶Ⅲ，它是從細(xì)胞核中滲漏出來的。三種主要的RNA聚合酶的分子量都在500KDa左右(14S-15S)，每種酶分子含有兩個大亞基和4～8個小亞基，每個小亞基的分子量為10KDa-90KDa。像原核生物一樣，不同種類的基因需要不同的蛋白質(zhì)輔助因子協(xié)助RNA聚合酶進(jìn)行工作。第33頁,共165頁，2024年2月25日，星期天3430第34頁,共165頁，2024年2月25日，星期天35細(xì)菌RNA聚合酶的核心酶可以獨(dú)立合成RNA，它由α亞基的兩個拷貝和β、β′、ω各一個拷貝組成;該酶與真核生物的聚合酶有密切聯(lián)系;大亞基β和β′與PolⅡ的大亞基RPB1及RPB2同源;

α亞基與RPB11及RPB3同源;

ω亞基與RPB6同源。原則上，細(xì)菌的核心酶能夠在DNA分子的任何一點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄，但在細(xì)胞內(nèi)，聚合酶只在啟動子處起始轉(zhuǎn)錄－－由于σ起始因子的加入。此為全酶。第35頁,共165頁，2024年2月25日，星期天36第三節(jié)啟動子和終止子第36頁,共165頁，2024年2月25日，星期天37啟動子是基因轉(zhuǎn)錄起始所必需的一段DNA序列，一般位于結(jié)構(gòu)基因的上游，是DNA分子與RNA聚合酶特異結(jié)合而起始轉(zhuǎn)錄的部位。啟動子本身不被轉(zhuǎn)錄。第37頁,共165頁，2024年2月25日，星期天38一、原核生物的啟動子結(jié)構(gòu)原核生物啟動子有4個保守特征：起始位點(diǎn)、-10區(qū)、-35區(qū)以及-10和-35區(qū)之間的間隔距離。第38頁,共165頁，2024年2月25日，星期天39大腸桿菌最常見的σ因子為σ70。σ70識別的啟動子有以下共同特征：兩段6個核苷酸長的保守序列,其中心分別位于起始位點(diǎn)上游約10bp和35bp處，被17～19個核苷酸的非特異序列隔開。第39頁,共165頁，2024年2月25日，星期天401.起始位點(diǎn)通常都是嘌呤堿基(>90%)原核典型的啟動子轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)、-10區(qū)、-35區(qū)第40頁,共165頁，2024年2月25日，星期天41

保守序列（一致性序列）開始轉(zhuǎn)錄TTGACAAACTGT-35

區(qū)(Pribnowbox)TATAATATATTA-10

區(qū)1-30-5010-10-40-205

3

3

5

第41頁,共165頁，2024年2月25日，星期天422.Pribnow框Pribnow框：在原核生物啟動子-10區(qū)域的一段核苷酸序列中，大多包含TATAAT序列或是稍有不同的變化形式，是RNA聚合酶牢固結(jié)合的位點(diǎn)，此段序列稱為Pribnow框。由于其中心在-10位點(diǎn)附近，所以又稱為-10序列。不同的啟動子，其位置略有不同，一般都在-4到-13的范圍之內(nèi)。第42頁,共165頁，2024年2月25日，星期天43一致序列：T80A95T45A60A50T96第43頁,共165頁，2024年2月25日，星期天44其中帶有底線的T稱為保守T,它存在于目前已知的幾乎所有啟動子中,一般位于-6到-9位點(diǎn)。頭兩個核苷酸是TA的也占3/4以上;

Pribnow框是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)（簡稱結(jié)合位點(diǎn)）;由于RNA聚合酶的誘導(dǎo)作用，在富含A·T的Pribnow框內(nèi)的DNA雙螺旋首先“熔解”。DNA雙螺旋在起始點(diǎn)周圍大約14bp的距離內(nèi)分開以形成轉(zhuǎn)錄泡，即與RNA聚合酶形成開放式啟動子復(fù)合體，使RNA聚合酶定向移動而行使其轉(zhuǎn)錄功能。第44頁,共165頁，2024年2月25日，星期天453.Sextama框

對于大多數(shù)啟動子,在RNA聚合酶覆蓋的部分還有一個重要的區(qū)域,叫做Sextama框,其位置在-35附近,因此又叫-35序列。-35序列是RNA聚合酶初始結(jié)合位點(diǎn),RNA聚合酶依靠其σ亞基(因子)識別該位點(diǎn),因此又稱為RNA聚合酶識別位點(diǎn)。

一致序列為：T82T84G78A65C54A45

第45頁,共165頁，2024年2月25日，星期天46RNA聚合酶先結(jié)合于-35序列;然后才結(jié)合于-10序列。有實(shí)驗(yàn)表明，σ亞基識別-35序列并與之結(jié)合。由于RNA聚合酶分子很長，大約能覆蓋70bp的DNA序列。因此酶分子上的一個適合部位就能達(dá)到-10序列區(qū)域。酶分子一旦與-10序列結(jié)合以后，σ亞基就立即從識別位點(diǎn)上解離下來。第46頁,共165頁，2024年2月25日，星期天47

-35序列的重要性還在于，這一序列的核苷酸結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了啟動子的強(qiáng)度。RNA聚合酶很容易識別強(qiáng)啟動子,而對弱啟動子的識別較差。Pribnow框和Sextama的堿基序列通過影響開放性啟動子復(fù)合物的形成速度而控制轉(zhuǎn)錄。這兩個序列是決定啟動子強(qiáng)度的重要因素，細(xì)胞可以由此來調(diào)節(jié)單位時間內(nèi)所轉(zhuǎn)錄的mRNA分子數(shù)，從而控制蛋白質(zhì)的合成速度。第47頁,共165頁，2024年2月25日，星期天48啟動子的強(qiáng)度指一個啟動子在一定的時間內(nèi)可以起始轉(zhuǎn)錄物的多少;具有與共有序列近似序列的啟動子“更強(qiáng)”。啟動子的強(qiáng)度受以下因素影響：啟動子最初與聚合酶的結(jié)合程度、對異構(gòu)化作用的支持效率，以及此后聚合酶逃離的難易程度。第48頁,共165頁，2024年2月25日，星期天494.-10和-35區(qū)之間間隔距離

在90%啟動子中，-35和-10區(qū)之間的分隔距離在16到19bp之間。個別例外的可以小于15或者大于20bp。盡管間隔區(qū)的真實(shí)序列并不重要，但其距離大小保持兩個位點(diǎn)恰當(dāng)分隔，從而在適合RNA聚合酶的幾何結(jié)構(gòu)方面是很重要的。第49頁,共165頁，2024年2月25日，星期天50幾種啟動子的Sextama框、Pribnow框以及二者之間的距離第50頁,共165頁，2024年2月25日，星期天51二、真核生物的啟動子結(jié)構(gòu)

真核生物有三種RNA聚合酶，每一種都有自己的啟動子類型：RNA聚合酶Ⅰ只轉(zhuǎn)錄rRNA（合成5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA），只有一種啟動子類型。RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)編碼基因（合成mRNA和snRNA），其啟動子結(jié)構(gòu)最復(fù)雜。RNA聚合酶Ⅲ負(fù)責(zé)合成tRNA和5SrRNA，其啟動子常位于轉(zhuǎn)錄的DNA序列之內(nèi)，稱為下游啟動子。第51頁,共165頁，2024年2月25日，星期天521.RNA聚合酶Ⅰ的啟動子

RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄rRNA，大多數(shù)真核生物rRNA基因啟動子可以分為兩個部分：核心元件，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)周圍（-40～+5），又稱近啟動子，其功能決定轉(zhuǎn)錄起始的精確位置;

-165～-40稱為遠(yuǎn)啟動子（上游控制元件），其功能是影響轉(zhuǎn)錄的頻率。每種生物都有特定的轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅰ結(jié)合，因此，RNA聚合酶Ⅰ的啟動子具有明顯的種族特異性。

第52頁,共165頁，2024年2月25日，星期天532.RNA聚合酶Ⅱ的啟動子結(jié)構(gòu)

1）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：具有基因表達(dá)所需的保守序列，該保守序列的共同序列為PyPyANT/APyPy（Py指嘧啶C或T，N為任意堿基），這個保守序列稱為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)與TATA框一起組成核心啟動子，啟動位于下游的任意基因的轉(zhuǎn)錄。

第53頁,共165頁，2024年2月25日，星期天542）基本啟動子：位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-25～-30范圍的7bp左右的保守區(qū)域，共同序列為TATAAAA(非模板鏈序列)，其中第5、7位的A常常被T取代，該保守區(qū)的堿基頻率是T95A87T93A85A63A83A50，這一序列也稱為TATA框。TATA框是很多真核生物類型Ⅱ啟動子的核心啟動子組成部分，與原核生物啟動子-10的序列之間有很大的相似性。差別主要在于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)距離的不同。TATA框主要與基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)的定位有關(guān)，而與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的效率無關(guān)。第54頁,共165頁，2024年2月25日，星期天553）轉(zhuǎn)錄上游啟動元件：在許多蛋白質(zhì)編碼基因的核心啟動子上游100-200bp范圍內(nèi)，還存在一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，含有組成啟動子的多個元件，統(tǒng)稱為上游啟動子元件，這些序列元件的功能主要是提高轉(zhuǎn)錄的效率和特異性。4）轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)下游元件：上游元件和下游元件統(tǒng)稱為啟動子近端序列元件（promoterproximalsequenceelement,PSE）。第55頁,共165頁，2024年2月25日，星期天56真核生物的核心啟動子(corepromoter)是指在體外檢測時，PolⅡ精確地起始轉(zhuǎn)錄所需要的最少一組序列元件;代表性的核心啟動子約有40個核苷酸，向轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游或下游延伸。核心啟動子中發(fā)現(xiàn)的4個元件：TFⅡB識別元件(TFⅡBrecognitionelement,BRE)、TATA元件(盒)、起始位點(diǎn)(initiator,Inr)和下游啟動子元件(downstreampromoterelement,DPE)。一個啟動子含有其中的2或3個元件。第56頁,共165頁，2024年2月25日，星期天57在核心啟動子之外（上游）存在一些在體內(nèi)進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄所需的其他序列元件，共同組成調(diào)節(jié)序列(regulatorysequence)，包括：啟動子最近元件(promoterproximalelement)，上游激活物序列(upstreamactivatorsequence,UAS)，增強(qiáng)子(enhancer)，以及一列的沉默子(silencer)、邊界元件(boundaryelement)和絕緣子(insulator)組成的抑制元件。所有這些DNA元件都與調(diào)節(jié)蛋白（激活或抑制因子）結(jié)合，促進(jìn)或阻礙從核心啟動子開始的轉(zhuǎn)錄。第57頁,共165頁，2024年2月25日，星期天58第58頁,共165頁，2024年2月25日，星期天593.RNA聚合酶Ⅲ的下游啟動子

5SRNA基因的啟動子位于轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游＋50－＋83之間;缺失＋50以前的序列和缺失＋83以后的序列都能正常轉(zhuǎn)錄，但＋50－＋83這段序列缺失，無轉(zhuǎn)錄活性；而加上此段序列，又能正常轉(zhuǎn)錄;把這段DNA序列插入任何DNA中，RNA聚合酶Ⅲ都能識別并起始轉(zhuǎn)錄。這段序列就是5SRNA基因的啟動子，這樣的位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游的啟動子又稱為內(nèi)部啟動子。第59頁,共165頁，2024年2月25日，星期天60除啟動子外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游處還有一個稱為增強(qiáng)子的序列，它能極大地增強(qiáng)啟動子的活性，它的位置往往不固定，可存在于啟動子上游或下游，對啟動子來說它們正向排列和反向排列均有效，對異源的基因也起到增強(qiáng)作用。增強(qiáng)子（enhancer)，又稱為遠(yuǎn)上游序列，一般都在-100以上，是啟動子的上游或下游對轉(zhuǎn)錄有促進(jìn)作用的一段DNA序列。

第60頁,共165頁，2024年2月25日，星期天61增強(qiáng)子的特點(diǎn):遠(yuǎn)距離效應(yīng)：一般位于上游-200bp處，但可增強(qiáng)遠(yuǎn)處啟動子的轉(zhuǎn)錄，即使相距>10kb也能發(fā)揮作用；無方向性：無論位于靶基因的上游、下游或內(nèi)部都可發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用；順式調(diào)節(jié)：只調(diào)節(jié)位于同一染色體上的靶基因，而對其他染色體上的基因沒有作用。無物種和基因的特異性：具有組織特異性：有相位性：其作用和DNA的構(gòu)象有關(guān)；有的增強(qiáng)子可以對外部信號產(chǎn)生反應(yīng)：第61頁,共165頁，2024年2月25日，星期天62第四節(jié)轉(zhuǎn)錄過程第62頁,共165頁，2024年2月25日，星期天63一、

模板識別該階段主要指RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之結(jié)合的過程。轉(zhuǎn)錄起始前，啟動子附近的DNA雙鏈分開形成轉(zhuǎn)錄泡以促使底物核糖核苷酸與模板DNA的堿基配對。第63頁,共165頁，2024年2月25日，星期天64二、

轉(zhuǎn)錄起始就是RNA鏈上第一個核苷酸鍵的產(chǎn)生。啟動子與聚合酶結(jié)合，啟動子-聚合酶復(fù)合體一旦形成，就發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，起始過程繼續(xù)；DNA堿基對斷裂，形成“泡”；總是從5’向3’方向進(jìn)行。

第64頁,共165頁，2024年2月25日，星期天651、原核生物的轉(zhuǎn)錄起始當(dāng)σ亞基發(fā)現(xiàn)其識別位點(diǎn)時，全酶就與啟動子的-35區(qū)-10區(qū)序列結(jié)合形成啟動子復(fù)合物。由β亞基催化形成RNA的第一個磷酸二酸鍵，合成6~9bp時σ因子從全酶解離下來，靠核心酶在DNA鏈上向下游滑動，而脫落的σ因子與另一個核心酶結(jié)合成全酶反復(fù)利用。

第65頁,共165頁，2024年2月25日，星期天66（1）酶找到啟動子順序并與其形成封閉復(fù)合物(此時DNA仍處于雙螺旋狀態(tài))。這一步所識別的是-35序列，因此-35序列的突變損害啟動子的結(jié)合。第66頁,共165頁，2024年2月25日，星期天67（2）然后，封閉復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)殚_放復(fù)合物，聚合酶全酶所結(jié)合的DNA序列中有一小段雙鏈被解開。此時酶的結(jié)合比較緊密。在這個轉(zhuǎn)變中-10區(qū)約有17bp被解旋，暴露出模板鏈。-10序列富于AT堿基對，因?yàn)锳T對比GC對更易于“融化”。-10區(qū)的突變可阻礙開放復(fù)合物的形成。許多突變改變了-10序列中的堿基，但并未減低其AT對的水平，卻仍然能阻礙其“融化”為開放復(fù)合物，可見-10區(qū)除了要易于融化之外，還必須有特異的形狀，以便RNA聚合酶能夠識別它。

第67頁,共165頁，2024年2月25日，星期天68（3）

封閉性和開放性啟動子復(fù)合物均為二元復(fù)合物。因?yàn)橹挥腥负虳NA這兩種成分在開放性啟動子復(fù)合物中，RNA聚合酶上的起始位點(diǎn)和延長位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸前體充滿，在β亞基的催化下形成RNA的第一個磷酸二酯鍵。（4）此時，由RNA聚合酶、DNA模扳和新生的RNA鏈組成的復(fù)合物稱為三元復(fù)合物。三元復(fù)合物形成之后，σ因子從全酶解離下來，致使三元復(fù)合物中核心酶與DNA的親和力下降到非特異性結(jié)合水平以下。

第68頁,共165頁，2024年2月25日，星期天69轉(zhuǎn)錄起始過程第69頁,共165頁，2024年2月25日，星期天70新生的RNA鏈與模板形成的雜交雙鏈很短;用胰臟RNAase處理轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)時,由于胰臟RNAase能切斷單鏈RNA而不能切斷RNA—DNA雜交分子,結(jié)果得到大約10個堿基的RNA片斷;這10個堿基中多少是受到DNA的保護(hù)的(形成氫鍵),多少是受到RNA聚合酶保護(hù)的(空間作用)，尚不清楚。有人推測只有兩個左右核苷酸能與DNA形成氫鍵而配對形成雜交狀態(tài)。而在DNA合成中的引物可長達(dá)50—60個核苷酸均與DNA形成氫鍵結(jié)合。為什么有這樣的區(qū)別，其原因還不清楚。第70頁,共165頁，2024年2月25日，星期天71真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，已經(jīng)知道，在所有的細(xì)胞中有一類叫做轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)分子，它們與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過程。真核生物基因中，有專門為蛋白質(zhì)編碼的基因，這些基因由RNA聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始關(guān)鍵性作用。

2、真核生物的轉(zhuǎn)錄起始第71頁,共165頁，2024年2月25日，星期天72根據(jù)這些轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可大致分為二類：第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子，它們與RNA聚合酶Ⅱ共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置上開始。普遍轉(zhuǎn)錄因子是由多種蛋白質(zhì)分子組成的，其中包括特異結(jié)合在TATA盒上的蛋白質(zhì)，叫做TATA盒結(jié)合蛋白，還有另外一組復(fù)合物叫做轉(zhuǎn)錄因子ⅡD。TFⅡD再與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。第72頁,共165頁，2024年2月25日，星期天73除TFⅡD以外，在細(xì)胞核提取物中還發(fā)現(xiàn)TFⅡA，TFⅡF，TFⅡE，TFⅡH等，它們在轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝的不同階段起作用：轉(zhuǎn)錄因子（TranscriptionFactor)結(jié)合順序：D-A-B-F-E-H

TFII-D：首先與TATA區(qū)結(jié)合

TFII-A：穩(wěn)定TFII-D與TATA區(qū)結(jié)合

TFII-B：幫助RNA酶與啟動子區(qū)結(jié)合

TFII-F：與RNA酶結(jié)合

TFII-E與TFII-H：促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始第73頁,共165頁，2024年2月25日，星期天74三、通過啟動子轉(zhuǎn)錄起始后直到形成9個核苷酸短鏈?zhǔn)峭ㄟ^啟動子階段，此時RNA聚合酶一直處于啟動子區(qū)，新生的RNA鏈與DNA模板鏈的結(jié)合不夠牢固，很容易從DNA鏈上掉下來并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄重新開始。第74頁,共165頁，2024年2月25日，星期天75四、轉(zhuǎn)錄的延伸一旦RNA聚合酶成功地合成9個以上核苷酸并離開啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄便進(jìn)入延伸階段。所以，通過啟動子的時間代表一個啟動子的強(qiáng)弱。大腸桿菌RNA聚合酶的活性一般為每秒50-90個核苷酸。隨著RNA聚合酶的移動，DNA雙螺旋持續(xù)解開，暴露出新的單鏈DNA模板，新生RNA鏈的3’末端不斷延伸，在解鏈區(qū)形成RNA-DNA雜合物。在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。(NMP)n+NTP

(NMP)n+1

+PPi第75頁,共165頁，2024年2月25日，星期天76五、鏈的終止終止子概念：RNA鏈的終止與一段序列有關(guān)，其終止信號存在于已轉(zhuǎn)錄過的序列。這段終止信號序列叫終止子。終止子可以分為兩類：1）不依賴于蛋白質(zhì)輔助因子而能實(shí)現(xiàn)終止作用；2）依賴蛋白質(zhì)輔因才能實(shí)現(xiàn)終止作用。這種蛋白質(zhì)輔因子稱為釋放因子，通常又稱ρ因子。第76頁,共165頁，2024年2月25日，星期天77兩類終止子的共同序列特征：在轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)之前有一段回文序列；回文序列的兩個重復(fù)部分(每個7～20bp)由幾個堿基對的不重復(fù)節(jié)段隔開；回文序列的對稱軸一般距轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)16～24bp。

第77頁,共165頁，2024年2月25日，星期天78兩類終止子的不同點(diǎn)是：不依賴ρ因子的終止子的回文序列中富含G·C堿基對，在回文序列的下游方向又常有6～8個A·T堿基對(模板鏈上為A)；依賴ρ因子的終止子中回文序列的G·C對含量較少。在回文序列下游方向的序列沒有固定特征，其A·T對含量比前一種終止子低。第78頁,共165頁，2024年2月25日，星期天79E.coli的色氮酸操縱元的轉(zhuǎn)錄終止子（不依賴ρ因子）第79頁,共165頁，2024年2月25日，星期天80噬菌體λ的TA1終止子序列（依賴ρ因子）第80頁,共165頁，2024年2月25日，星期天812.抗終止及抗終止因子

在一些終止子上，終止事件可以被某些與RNA聚合酶相互作用的特異輔助因子所阻止?！翱菇K止(Antitermination)”使酶越過終止子序列而繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，此過程稱為通讀(Readthrough)?？菇K止是在細(xì)菌噬菌體感染中被發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌操縱子和噬菌體調(diào)控回路中的一個調(diào)控機(jī)制。

第81頁,共165頁，2024年2月25日，星期天82圖5.11抗終止作用決定RNA聚合酶在終止子位點(diǎn)處終止還是通讀下去第82頁,共165頁，2024年2月25日，星期天83第五節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄后加工第83頁,共165頁，2024年2月25日，星期天84基因轉(zhuǎn)錄的直接產(chǎn)物稱為初級轉(zhuǎn)錄物，通常是沒有功能的，它們在細(xì)胞內(nèi)必須經(jīng)歷各種特異性的改變即所謂的轉(zhuǎn)錄后加工才會轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒?、有活性的RNA分子?？偟恼f來，RNA經(jīng)歷的轉(zhuǎn)錄后加工主要有：去除或添加某些核苷酸序列、修飾某些特定的核苷酸。第84頁,共165頁，2024年2月25日，星期天85三種主要的RNA即mRNA、rRNA和tRNA在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中所經(jīng)歷的轉(zhuǎn)錄后加工反應(yīng)并不完全相同，而且同一種RNA前體（一般是mRNA前體）也可能有不同的加工路線，這樣可以導(dǎo)致一個基因產(chǎn)生幾種終產(chǎn)物，這種選擇性的轉(zhuǎn)錄后加工是基因表達(dá)調(diào)控的一種很重要的手段。第85頁,共165頁，2024年2月25日，星期天86絕大多數(shù)原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時進(jìn)行的，隨著mRNA開始在DNA上合成，核蛋白體即附著在mRNA上并以其為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，因此原核細(xì)胞的mRNA并無特殊的轉(zhuǎn)錄后加工過程，原核生物的mRNA壽命很短，其半衰期通常為幾分鐘。這個現(xiàn)象看起來似乎是浪費(fèi)，而實(shí)際上這恰恰是原核生物內(nèi)的重要調(diào)控機(jī)制。如果一種酶或蛋白質(zhì)不再需要，只要簡單地關(guān)閉其mRNA的合成就行了。第86頁,共165頁，2024年2月25日，星期天87

相反，真核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上是分開的，剛轉(zhuǎn)錄出來的mRNA是分子很大的前體，即核內(nèi)不均一RNA。hnRNA分子中大約只有10%的部分轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA，其余部分將在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中被降解掉。在真核生物中，可能有特別的機(jī)制來延長需要翻譯的mRNA的壽命，而縮短不再需要的mRNA的壽命。第87頁,共165頁，2024年2月25日，星期天88rRNA和tRNA則不同，它們不是翻譯的模板，而是蛋白質(zhì)合成機(jī)器的組成成分。不管在原核生物中還是在真核生物中，它們都很穩(wěn)定，半衰期一般為幾個小時。無論是rRNA還是tRNA，都不是最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其證據(jù)如下：rRNA和tRNA分子的5′-端都是單磷酸，而所有原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5′-端都是三磷酸;rRNA和tRNA分子都比原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小，也就是比RNA的轉(zhuǎn)錄元小;所有的tRNA分子都含有原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所沒有的異常堿基，即除了A、G、C、U以外的堿基。第88頁,共165頁，2024年2月25日，星期天891.mRNA在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)占總RNA的2%左右，tRNA占16%左右，rRNA則占80%以上。真核細(xì)胞的mRNA往往以較大相對分子量的前體RNA出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的、相對分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)化學(xué)修飾的mRNA才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細(xì)胞mRNA的合成和功能表達(dá)發(fā)生在不同的空間和時間范疇內(nèi)。2.mRNA的代謝很快，細(xì)菌mRNA平均半壽期為2分鐘，真核mRNA半壽期較長，平均5小時。（一）mRNA的加工修飾第89頁,共165頁，2024年2月25日，星期天903.原核生物mRNA與相應(yīng)的基因是共線的，并且是多順反子；真核不是共線，單順反子，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是hnRNA，hnRNA是mRNA的未成熟前體，也稱為不均一核RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)。hnRNA分子中大約只有10%的部分轉(zhuǎn)變成成熟的mRNA，其余部分將在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中被降解掉。第90頁,共165頁，2024年2月25日，星期天914.hnRNA與mRNA之間的差別主要有兩點(diǎn)：一是hnRNA核苷酸鏈中的一些片段將不出現(xiàn)于相應(yīng)的mRNA中，這些片段稱為內(nèi)含子(intron)，而那些保留于mRNA中的片段稱為外顯子(exon)。也就是說，hnRNA在轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA的過程中經(jīng)過剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新連接在一起；二是mRNA的5′末端被加上一個m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一個多聚腺苷酸(polyA)尾巴。第91頁,共165頁，2024年2月25日，星期天92mRNA5′端的帽子功能：

a.使mRNA免遭核酸酶的破壞，起到保護(hù)和穩(wěn)定性的作用。

b.使mRNA能與核糖體小亞基結(jié)合并開始合成蛋白質(zhì)。

c.被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識別，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。第92頁,共165頁，2024年2月25日，星期天93mRNA3′端polyA尾巴的功能：多聚腺苷酸尾一般由數(shù)十個至幾百個腺苷酸連接而成。隨著mRNA存在時間的延續(xù)，這段聚A尾巴慢慢變短。因此，目前認(rèn)為：這種3′末端結(jié)構(gòu)可能與增加轉(zhuǎn)錄活性以及使mRNA趨于相對穩(wěn)定有關(guān)。也是分離mRNA和分子克隆的基礎(chǔ)。原核生物的mRNA沒有這種首尾結(jié)構(gòu)。第93頁,共165頁，2024年2月25日，星期天94一、原核生物mRNA的特征：1.半衰期短。原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯是在同一個細(xì)胞空間理同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄時就被引發(fā)了。大多數(shù)細(xì)菌mRNA在轉(zhuǎn)錄開始1分鐘后就開始降解，mRNA降解的速度大概只有轉(zhuǎn)錄或翻譯速度的一半?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)每過大約2分鐘，體系中出現(xiàn)新生蛋白質(zhì)的速度就下降50%。第94頁,共165頁，2024年2月25日，星期天952.原核細(xì)胞的mRNA（包括病毒）有時可以編碼幾個多肽，而真核細(xì)胞的mRNA最多只能編碼一個多肽。 我們把只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順反子mRNA，把編碼多個蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順反子mRNA。 幾乎所有mRNA都可以被分成3部分：編碼區(qū)、位于AUG之前的5′端上游非編碼區(qū)、位于終止密碼子之后不翻譯的3′端下游非編碼區(qū)。編碼區(qū)從起始密碼子AUG開始經(jīng)一連串編碼氨基酸的密碼子直至終止密碼子。第95頁,共165頁，2024年2月25日，星期天96 第一個蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離mRNA模板，第二個蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大亞基與該蛋白起始密碼子相結(jié)合后才能開始（圖7-1A）。 前一個多肽翻譯完成以后，核糖體大、小亞基分離，小亞基也可能不離開mRNA模板，而使迅速與游離的大亞基結(jié)合，啟動第二個多肽的合成（圖7-1B）。第96頁,共165頁，2024年2月25日，星期天97圖7-1：原核生物多順反子基因中后續(xù)編碼區(qū)翻譯起始受順反子之間距離的影響。

第97頁,共165頁，2024年2月25日，星期天98一個順反子的翻譯有時完全取決于它前面順反子的翻譯，因?yàn)橹挥械谝粋€翻譯起始位點(diǎn)是暴露的，在這個順反子翻譯產(chǎn)生多肽的過程中，核糖體的運(yùn)動破壞了后續(xù)順反子的二級結(jié)構(gòu)，使起始位點(diǎn)較容易與核糖體相結(jié)合形成起始復(fù)合物（圖7-2）。第98頁,共165頁，2024年2月25日，星期天99圖7-2：mRNA的次級結(jié)構(gòu)有可能控制翻譯的起始第99頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1003.原核生物mRNA的5′端無帽子結(jié)構(gòu)，3′端沒有或只有較短的多聚（A）結(jié)構(gòu)。原核生物起始密碼子AUG上游7-12個核苷酸處有一被稱為SD序列的保守區(qū)，因?yàn)樵撔蛄信c16S-rRNA3′端反向互補(bǔ)，所以被認(rèn)為在核糖體-mRNA的結(jié)合過程中起作用。4.原核生物常以AUG（有時GUG，甚至UUG）作為起始密碼子，而真核生物幾乎永遠(yuǎn)以AUG作為起始密碼子。第100頁,共165頁，2024年2月25日，星期天101二、真核生物mRNA的特征：編碼功能蛋白的真核基因都通過RNA聚合酶Ⅱ進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，幾乎都是單順反子，其長度在幾百到幾千個核苷酸之間。一個完整的基因，不但包括編碼區(qū)（codingregion），還包括5′和3′端長度不等的特異性序列，它們雖然不編碼氨基酸，卻在基因表達(dá)過程中起著重要作用。第101頁,共165頁，2024年2月25日，星期天102“基因”的分子生物學(xué)定義是：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。真核生物mRNA結(jié)構(gòu)上的最大特征是5′端的帽子及3′的多聚(A)結(jié)構(gòu)。第102頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1031.

真核生物mRNA的5′端存在“帽子”結(jié)構(gòu)。真核生物基因轉(zhuǎn)錄一般從嘌呤（主要是A，也可能是G）起始，其5′端大都經(jīng)過修飾，第一個核苷酸僅保留了5′端的三磷酸基團(tuán)。第103頁,共165頁，2024年2月25日，星期天104mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化。第一個甲基出現(xiàn)在所有真核細(xì)胞的mRNA中（單細(xì)胞真核生物mRNA主要是這個結(jié)構(gòu)），由鳥苷酸-7甲基轉(zhuǎn)移酶催化，稱為帽子零結(jié)構(gòu)（Cap0）。如在第二個核苷酸（原mRNA5′第一位）的2′-OH位上加另一個甲基，這步反應(yīng)由2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶完成。一般把有這兩個甲基的結(jié)構(gòu)稱為帽子1（Cap1），真核生物中以這類帽子結(jié)構(gòu)為主。第104頁,共165頁，2024年2月25日，星期天105當(dāng)mRNA原第二位核苷酸是腺嘌呤時，其N6位有時也被甲基化，這一反應(yīng)只能在2′-OH被甲基化以后才能發(fā)生。在某些生物細(xì)胞內(nèi)，mRNA鏈上的第三個核苷酸的2′-OH位也可能被甲基化，因?yàn)檫@個反應(yīng)只以帶有1類帽子的mRNA為底物，所以被稱為帽子2（Cap2）。有帽子2結(jié)構(gòu)的mRNA只占有帽mRNA總量的10-15%以下。第105頁,共165頁，2024年2月25日，星期天106第106頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1072.

絕大多數(shù)真核生物mRNA具有多聚(A)尾巴。除組蛋白基因外，真核生物mRNA的3′末端都有多聚（A）序列，其長度因mRNA種類不同而變化，一般為40-200個左右。真核基因的3‘末端轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)上游15～30bp處的保守序列AAUAAA對于初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確切割及加多聚（A）是必需的（圖7-3）。第107頁,共165頁，2024年2月25日，星期天108圖7-3.真核生物mRNA中的多聚A反應(yīng)第108頁,共165頁，2024年2月25日，星期天109多聚(A)是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的形式，它大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。mRNA剛從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時，其多聚(A)尾巴一般比較長，隨著mRNA在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)逗留時間延長，多聚(A)逐漸變短消失，mRNA進(jìn)入降解過程。第109頁,共165頁，2024年2月25日，星期天110原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為多順反子，即幾個結(jié)構(gòu)基因，利用共同的啟動子和共同終止信號經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成一條mRNA，所以此mRNA分子編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過酶和乙?；D(zhuǎn)移酶。原核生物中沒有核模，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過程。三、原核生物mRNA的加工修飾第110頁,共165頁，2024年2月25日，星期天111四、真核生物mRNA的加工修飾真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為單順反子，即一個mRNA分子只為一種蛋白質(zhì)分子編碼。真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對5′-端和3′-端的修飾以及對中間部分進(jìn)行剪接。第111頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1121、在5′-端加帽成熟的真核生物mRNA，其結(jié)構(gòu)的5′-端都有一個m7G-PPNmN結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為甲基鳥苷的帽子。鳥苷通過5′-5′焦磷酸鍵與初級轉(zhuǎn)錄物的5′-端相連。真核生物mRNA5′-端帽子結(jié)構(gòu)的重要性在于它是mRNA做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對核糖體對mRNA的識別提供了信號，這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA免遭5′外切核酸酶的攻擊。第112頁,共165頁，2024年2月25日，星期天113盡管真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄起始于一個嘌呤核苷三磷酸(pppA或pppG，A或G)，第一個核苷酸保留著其5′三磷酸，使通常的磷酸二酯鍵從其3′位向下一個核苷酸的5′位之間生成。轉(zhuǎn)錄本的初始序列可描述為：

5′pApNpNpNp……或5′pGpNpNpNp……第113頁,共165頁，2024年2月25日，星期天114但是,當(dāng)成熟的mRNA在體外用能使其降解為單核苷酸的RNAase酶處理時，其5′-端并沒有像所希望的那樣生成核苷三磷酸pppA或pppG。相反，得到一個以5′-5′三磷酸二酯鍵相連的二核苷酸，且?guī)в屑谆?，而?′末端的一個核苷酸總是N7―甲基鳥嘌呤核苷酸。這樣成熟的mRNA沒有自由的5′端。mRNA5′端的這種結(jié)構(gòu)叫做帽子。第114頁,共165頁，2024年2月25日，星期天115圖5.13真核生物mRNA5′端的不同帽子結(jié)構(gòu)第115頁,共165頁，2024年2月25日，星期天116真核生物mRNA5′端的不同帽子結(jié)構(gòu):

1）第一種甲基化，即N7―甲基鳥嘌呤核苷酸甲基化，發(fā)生在所有真核生物中，是在端部鳥嘌呤的7位加上了一個甲基，僅僅擁有這樣單一甲基的帽子被稱為cap0，符號為M7GpppX。即使在單細(xì)胞真核生物中也發(fā)生這個甲基化反應(yīng)。負(fù)責(zé)催化這種修飾反應(yīng)的酶是鳥嘌呤-7-甲基轉(zhuǎn)移酶(Methyltranferase)。2）下一步是在第二堿基(在沒有任何修飾之前轉(zhuǎn)錄本真正的第一個起始堿基)的2′-O位置。此反應(yīng)被另一個酶催化(2′-O-甲基-轉(zhuǎn)移酶)，帶有上述兩個甲基的被稱為cap1，符號為M7GpppXm。除單細(xì)胞生物之外，這是一種多數(shù)的帽子形式。第116頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1173）第二個堿基再次發(fā)生甲基化，這是高等真核生物中的少數(shù)情況。僅當(dāng)此堿基為腺嘌呤時這種甲基化才發(fā)生，被甲基化的是N6位。只有當(dāng)腺嘌呤的2′-O位已經(jīng)甲基化時，負(fù)責(zé)此種甲基化的酶才能起修飾作用。4）在一些種類中，甲基被加到戴帽mRNA的第三個堿基，這種反應(yīng)的底物是已經(jīng)帶有兩個甲基的cap1mRNA。第三堿基的修飾通常是2′-O位的甲基化，這創(chuàng)造了cap2類型，符號為M7GpppXmpYm。所有戴帽mRNA中，此類帽子只占10～15%。第117頁,共165頁，2024年2月25日，星期天118 在真核mRNA群體中所有分子都加帽，對于特定有機(jī)體，不同帽子類型的比例是其主要特征。對于一個特定mRNA結(jié)構(gòu)而言，現(xiàn)在尚不知道是否可能有不止一種的帽子。在加帽過程中除了甲基化外，高等真核生物的mRNA會低頻率地發(fā)生內(nèi)部甲基化。在每1000個堿基中可能會產(chǎn)生一個N6甲基腺嘌呤，這樣在典型的高等真核mRNA（平均長度1800～2000bp）中存在1-2個甲基腺嘌呤，其功能還不知道。第118頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1192、在3′-端加尾尾巴的本質(zhì)是一段多聚腺苷酸序列（polyA），它位于絕大多數(shù)真核細(xì)胞核mRNA的3′-端，約由200個左右的腺苷酸組成，因此又稱為polyA尾巴。但含有polyA尾巴的mRNA的編碼鏈上并無相應(yīng)的polyA序列，顯然，polyA尾巴是在轉(zhuǎn)錄后添加上去的。第119頁,共165頁，2024年2月25日，星期天120第120頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1213、mRNA前體（hnRNA）的剪接原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)編碼序列，而真核生物基因往往是斷裂基因，斷裂基因的存在表明真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和mRNA合成過程比原核細(xì)胞要復(fù)雜得多，因?yàn)檎婧嘶虮磉_(dá)往往伴隨著RNA的剪接過程（splicing），從mRNA前體分子中切除被稱為內(nèi)含子的非編碼區(qū)，并使基因中被稱為外顯子的編碼區(qū)拼接形成成熟mRNA。從pre-mRNA中除去內(nèi)含子的過程稱為RNA剪接(RNAsplicing)。第121頁,共165頁，2024年2月25日，星期天122第122頁,共165頁，2024年2月25日，星期天123內(nèi)含子的數(shù)目和長度不同使基因間長度差別很大。在一個典型的哺乳動物基因中約有7-8個外顯子，分布在16kb左右的范圍內(nèi)。外顯子較短(100~200bp)，內(nèi)含子較長(1kb)。真核生物基因組內(nèi)存在更多需要加工剪接的情況，特別是真核生物基因的內(nèi)含子被轉(zhuǎn)錄后，需要在RNA水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的剪接。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪接是RNA水平上加工內(nèi)容之一，是基因表達(dá)調(diào)控的方式之一。第123頁,共165頁，2024年2月25日，星期天124第124頁,共165頁，2024年2月25日，星期天125由DNA轉(zhuǎn)錄生成的原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-----核不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA,hnRNA），即mRNA的前體，經(jīng)過5′加“帽”和3′酶切加多聚腺苷酸尾巴，再經(jīng)過RNA的剪接，編碼蛋白質(zhì)的外顯子部分就連接成為一個連續(xù)的可翻譯框架（openreadingframe,ORF），通過核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，就能作為蛋白質(zhì)合成的模板了。第125頁,共165頁，2024年2月25日，星期天126對于剪接反應(yīng)本身來說，一個最主要的問題是如何保證它的準(zhǔn)確性。是什么確保了每個內(nèi)含子末端可以被準(zhǔn)確的識別，并把正確的序列從RNA中剪接掉？從前體中切除內(nèi)含子的過程是否是按照特定的順序進(jìn)行？成熟RNA是通過有效前體間的識別，還是通過改變剪接機(jī)制來調(diào)控基因表達(dá)的？第126頁,共165頁，2024年2月25日，星期天127原核或真核生物的RNA剪接沒有單一的剪接機(jī)制，形式很多。根據(jù)基本的共同方式，內(nèi)含子的剪接可以分為三類。（1）第一類是自我剪接內(nèi)含子。由于這類內(nèi)含子的特殊結(jié)構(gòu)而能自發(fā)地進(jìn)行剪接，至少在體外不需要酶或蛋白質(zhì)參與。這一類又分為兩個亞類，即I型內(nèi)含子和Ⅱ型內(nèi)含子，它們各有特征性的二級結(jié)構(gòu)和短的共同序列，采取不同的兩種自我剪接方式。I型內(nèi)含子存在于多數(shù)真核線粒體、四膜蟲、一些葉綠體和噬菌體RNA等。Ⅱ型內(nèi)含子主要在線粒體和葉綠體基因中。一些I型內(nèi)含子自身也能編碼蛋白質(zhì)。第127頁,共165頁，2024年2月25日，星期天128（2）第二類內(nèi)含子是蛋白質(zhì)(酶)參與剪接的內(nèi)含子，主要在tRNA前體中發(fā)現(xiàn)。剪接是在一系列酶催化下進(jìn)行的。第128頁,共165頁，2024年2月25日，星期天129（3）第三類內(nèi)含子是snRNP參與剪接的內(nèi)含子。這一類內(nèi)含子絕大部分存在于真核細(xì)胞核的蛋白質(zhì)基因中。其剪接方式與第一類Ⅱ型內(nèi)含子相似，都通過形成套索結(jié)構(gòu)的中間物和套索內(nèi)含子產(chǎn)物。區(qū)別在于Ⅱ型內(nèi)含子剪接不需要任何蛋白質(zhì)，而細(xì)胞核RNA前體的內(nèi)含子剪接要在snRNP參與下進(jìn)行。兩者比較后認(rèn)為，Ⅱ型自我剪接的內(nèi)含子是細(xì)胞核基因內(nèi)含子的前身，是失去自我剪接能力和增加對snRNP依賴性的進(jìn)化過程。（在真核生物的細(xì)胞核中，含有大量的小分子RNA，在天然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白粒子形式存在，稱為snRNP。）第129頁,共165頁，2024年2月25日，星期天130

研究表明，許多相對分子質(zhì)量較小的核內(nèi)RNA以及與這些RNA相結(jié)合的核蛋白（smallnuclearribonucleo-proteinparticle,snRNP）參與RNA的剪接。snRNP分別被命名為U1RNP、U2RNP、U3RNP、U4RNP、U5RNP和U6RNP。mRNA鏈上每個內(nèi)含子的5′和3′端分別與不同的snRNP結(jié)合，形成RNA和RNP復(fù)合物。第130頁,共165頁，2024年2月25日，星期天131圖7-5：真核生物mRNA前體中內(nèi)含子剪接過程

第131頁,共165頁，2024年2月25日，星期天132真核生物mRNA前體在剪接過程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個分支部位的腺苷酸殘基，它的2′-OH可以自動攻擊內(nèi)含子5′端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開了外顯子1，而腺苷酸原來已有3′，5′-磷酸二酯鍵相連的兩個相鄰的核苷酸殘基，加上此3′，5′-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個套索，已被切下的外顯子1的3′-OH攻擊內(nèi)含子3′末端與外顯子2之間的3′，5′-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索的形式被節(jié)下來，此時外顯子1和外顯子2可以連接起來。

第132頁,共165頁，2024年2月25日，星期天133圖7-6第133頁,共165頁，2024年2月25日，星期天134真核生物編碼蛋白質(zhì)的核基因含有數(shù)目巨大的內(nèi)含子，它們占據(jù)了所有內(nèi)含子的絕大部分。這些內(nèi)含子的左端（5′-端）均為GT，右端（3′-端）均為AG（對應(yīng)于RNA為GU--AG）。哺乳動物細(xì)胞中，mRNA前體上的snRNP是從5′向下游“掃描”，選擇在分支點(diǎn)富集嘧啶區(qū)3′下游的第一個AG作為剪接的3′位點(diǎn)。AG前一個核苷酸可以影響剪接效率，一般說來，GAG=UAG>AAG>GAG。

第134頁,共165頁，2024年2月25日，星期天135（二）rRNA轉(zhuǎn)錄后加工一、原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工 原核細(xì)胞的三種rRNA（5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA）和兩個tRNA是作為一個共轉(zhuǎn)錄物被轉(zhuǎn)錄的（圖7-7），像這樣的轉(zhuǎn)錄單位在E.coli基因組中有7個拷貝，稱為rrnA-G操縱元。每個操縱元中tRNA基因的種類、數(shù)量和位置不固定。當(dāng)rrn操縱元轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一個多基因的30sRNA后，必須切除先導(dǎo)序列、拖尾序列和基因間序列，將各rRNA相互分開。

第135頁,共165頁，2024年2月25日，星期天136圖7-7原核細(xì)胞rRNA前體的后加工

第136頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1371、剪切和修剪由特定的核糖核酸酶催化，主要包括核酸酶Ⅲ、D、P、F、E、M16、M23和M5等。其中內(nèi)切酶行使“粗加工”，從內(nèi)部催化剪切反應(yīng)，負(fù)責(zé)從共轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)部將各rRNA兩側(cè)的多數(shù)不需要的核苷酸切除；外切酶進(jìn)行“細(xì)加工”，從3′-端或5′-端催化修剪反應(yīng)，負(fù)責(zé)從RNA兩端水解去除剩余的無用核苷酸序列，發(fā)生在rRNA與核糖體結(jié)合以后。第137頁,共165頁，2024年2月25日，星期天138

rRNA前體含有16SrRNA的片段和含有23SrRNA的片段的兩側(cè)都是反向重復(fù)序列，彼此之間能夠自發(fā)地形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。核糖核酸酶Ⅲ能夠識別莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖，進(jìn)行剪切。然后由核糖核酸酶M16和M23催化修剪反應(yīng)，分別產(chǎn)生成熟的16SrRNA和23sRNA（圖7-7）。5SrRNA由核糖核酸酶E和M5釋放出來，而tRNA由核糖核酸酶P和F釋放出來。第138頁,共165頁，2024年2月25日，星期天139圖7-7原核細(xì)胞rRNA前體的后加工

第139頁,共165頁，2024年2月25日，星期天1402、核苷酸的修飾 修飾的主要形式為核糖2′-OH的甲基化，一般發(fā)生在剪切和修剪反應(yīng)之前。甲基供體是S-腺苷甲硫氨酸。修飾的功能可能在于保護(hù)rRNA，使其抵抗某些核酸酶的消化。第140頁,共165頁，2024年2月25日，星期天141二、真核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工真核生物有四種rRNA，即5.8srRNA、18srRNA、28srRNA和5srRNA。真核生物rRNA前