海島棉枯萎病抗性相關(guān)基因的克隆及功能驗(yàn)證

海島棉枯萎病抗性相關(guān)基因的克隆及功能驗(yàn)證新疆是中國唯一的海島棉種植基地。海島棉比起陸地棉有著纖維長度、比強(qiáng)度、細(xì)度等方面優(yōu)異的特性，是紡高支紗必不可缺少的原料，在國民經(jīng)濟(jì)中具有舉足輕重的地位。然而海島棉枯萎病的蔓延嚴(yán)重制約著其生產(chǎn)，影響了棉農(nóng)種植海島棉的積極性，使新疆海島棉種植面積及產(chǎn)量都大幅度下降。棉花抗病新品種的選育和種植是解決這個難題的有效途徑之一。培育抗病棉花新品種的關(guān)鍵是要研究海島棉抗枯萎病的機(jī)理機(jī)抗病相關(guān)基因的作用，從而在分子水平上對海島棉加以改良，獲得具有高抗特性的棉花新品種。本研究首先以定位到的與海島棉枯萎病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記為基礎(chǔ)，通過對功能標(biāo)記位點(diǎn)的克隆，獲得抗性相關(guān)基因的全序列；利用RT-PCR研究該基因的表達(dá)特性，并通過轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)一步揭示該基因在枯萎病抗性中的作用，結(jié)果如下：1.根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫上公布的抗病基因序列，設(shè)計出107對RGA引物，利用高抗枯萎病的海島棉品系“06-146”、高感枯萎病的海島棉品種新海14號及以雜交F₂群體中隨機(jī)選取的180個單株為實(shí)驗(yàn)材料，利用RGA引物在親本間篩選出來的12對引物在抗、感基因池中進(jìn)行篩選，初步確定Gbrga14是與海島棉枯萎病緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記與海島棉枯萎病抗性的交換值為15.5%，與海島棉抗枯萎病基因的遺傳距離為15.92cM。查找連鎖標(biāo)記的來源發(fā)現(xiàn)，根據(jù)擬南芥RPP5基因設(shè)計的引物最多，有4對（占33.33%）。這12對具有多態(tài)性的RGA標(biāo)記主要由3類組成，其中TIR-NBS-LRR類6對，占50%；NBS-LRR類5對，占41.67%；NBS類1對，占8.33%。2.通過對Gbrga14在兩親本間擴(kuò)增出來的位點(diǎn)進(jìn)行回收測序，以該測序片段為探針，通過同源克隆的方法，分別克隆到兩條抗性相關(guān)基因，命名為RGBCH和SGBCH。BLAST比對分析顯示，RGBCH、SGBCH基因具有較高的基因多態(tài)性。生物信息學(xué)分析表明，α-螺旋均是兩個蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要部分。ProtFun預(yù)測RGBCH蛋白的主要功能是參與能量代謝和生物合成輔助因子；SGBCH蛋白的主要功能是參與蛋白質(zhì)翻譯過程中的能量轉(zhuǎn)換。3.選取5份不同的海島棉及陸地棉材料，經(jīng)枯萎病誘導(dǎo)后，取不同的組織器官分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測。利用特異性引物GBCH–Q對材料的熒光定量PCR分析可知：品系“06-146”目的基因在不同組織器官的表達(dá)量在4d達(dá)到峰值；新海14號目的基因在6d時出現(xiàn)一個最高值，隨后降低到最初水平；中棉所35號、軍棉1號和TM-1在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后表達(dá)量均很微弱或者比較一致，基本維持在低水平表達(dá)；利用引物StVe-Q對材料的熒光定量PCR分析可知：品系“06-146”、新海14號、中棉所35號、軍棉1號和TM-1的目的基因在病菌誘導(dǎo)條件下，沒有隨著誘導(dǎo)時間的變化而呈現(xiàn)表達(dá)變化狀態(tài)。說明已克隆的RGBCH和SGBCH只在海島棉材料中表達(dá)，是與枯萎病抗性相關(guān)的兩個基因。4.將RGBCH、SGBCH基因重組到pCAMBIA1301植物表達(dá)載體上，構(gòu)建了海島棉pCAMBIA1301-RGBCH、pCAMBIA1301-SGBCH的植物表達(dá)載體，同時利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將RGBCH、SGBCH基因整合到煙草基因組中，并獲得T1代種子。對T1代轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因煙草采用菌液澆根法（每種材料種植30株），轉(zhuǎn)RGBCH基因植株的存活率為78%，葉片呈顯黃化狀態(tài)，，而轉(zhuǎn)