《培養(yǎng)基及其配制》課件

第三章培養(yǎng)基及其配制1精選ppt第三章培養(yǎng)基及其配制1精選ppt

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長(zhǎng)。因此，沒(méi)有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。第一節(jié)培養(yǎng)基成分及作用2精選ppt培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件主要成分包括：無(wú)機(jī)鹽類（大量和微量元素）、維生素類、氨基酸類、有機(jī)附加物、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、糖類，水和瓊脂等。

1.大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素等。(1)N：是蛋白質(zhì)、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成成分，在制備培養(yǎng)基時(shí)以NO3—N和NH4—N兩種形式供應(yīng)。(2)P：是磷脂的主要成分。常用的物質(zhì)有KH2P04或NaH2P04

(3)K：對(duì)碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。制備培養(yǎng)基時(shí)，常以KCI、KN03等鹽類提供。(4)Mg、S和Ca、Mg：

是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。它們常以MgSO4·7H20提供。Ca是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用，常以CaCl2·2H2O提供。3精選ppt主要成分包括：無(wú)機(jī)鹽類（大量和微量元素）、維生素類、氨基酸類2.微量元素：指小于0.5mmol／L的元素主要有Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。鐵是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化氫酶等的組成成分。同時(shí)，它又是葉綠素形成的必要條件。培養(yǎng)基中的鐵對(duì)胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。在制做培養(yǎng)基時(shí)不用Fe2SO4，和FeCl3(因其在pH值5．2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)，而用FeSO4·7H20和Na2—EDTA結(jié)合成合物使用。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)、發(fā)育異?，F(xiàn)象。4精選ppt2.微量元素：指小于0.5mmol／L的元素4精選ppt3.有機(jī)化合物⑴碳水化合物：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長(zhǎng)。蔗糖使用濃度在2%—3%，常用3%高壓滅菌時(shí)，一部分糖會(huì)發(fā)生分解，制定配方時(shí)要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的綿白糖代替。

⑵維生素：這類化合物主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)、分化等有很好的促進(jìn)作用。主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時(shí)還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0.1—1.0mg／L。VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長(zhǎng)，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。5精選ppt3.有機(jī)化合物5精選ppt生長(zhǎng)培養(yǎng)基是植物再生的必要條件蔗糖（0%）蔗糖含量（

1%）蔗糖含量（5%）外植體完全被綠色的芽所包裹，根生長(zhǎng)在其下表面在外植體上既沒(méi)有芽發(fā)生，也沒(méi)有根和愈傷組織產(chǎn)生在外植體上表面邊緣產(chǎn)生芽，也有一些根發(fā)生芽從外植體的上表面發(fā)生而根從下表面發(fā)生tissuecultureintheAfricanViolet

6精選ppt生長(zhǎng)培養(yǎng)基是植物再生的必要條件蔗糖（0%）蔗糖含量（1%(3)肌醇又叫環(huán)己六醇：在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。使用濃度一般為l00mg／L，適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成。對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。⑷氨基酸：是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。4.有機(jī)附加物：其對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對(duì)器官的分化作用不明顯。其成分大多不清楚，所以一般應(yīng)盡量避免使用。常用的有機(jī)附加物有:⑴椰乳：⑵香蕉：⑶水解酪蛋白：7精選ppt(3)肌醇又叫環(huán)己六醇：在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。使用濃5.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開(kāi)花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動(dòng)，在培養(yǎng)基的各成分中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。5.1生長(zhǎng)素類(auxin)：

在組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。在促進(jìn)生長(zhǎng)方面，根對(duì)生長(zhǎng)素最敏感，在極低的濃度下，就可促進(jìn)根生長(zhǎng)，其次是莖和芽。天然的生長(zhǎng)素?zé)岱€(wěn)定性差，高溫高壓或受光條件易被破壞。在植物體內(nèi)也易受到體內(nèi)酶的分解。一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0.05－5mg／L。8精選ppt5.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物8精選ppt⑴IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，其活力較低，是生長(zhǎng)素中活力最弱的激素，對(duì)器官形成的副作用小、，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。 ⑵NAA(萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動(dòng)能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)。⑶IBA(吲哚丁酸)是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。⑷2，4—D(2，4—二氯苯氧乙酸)起動(dòng)能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過(guò)量常有毒效應(yīng)。9精選ppt⑴IAA(吲哚乙酸)是天然存在的生長(zhǎng)素，亦可人工合成，其活力5.2細(xì)胞分裂素類細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時(shí)使用較少或用量較低。這類激素是腺嘌吟的衍生物，包括6－BA(6－芐基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激動(dòng)素)、Zt(zeatin玉米素)等，細(xì)胞分裂素0.05－10mg／L。

其中Zt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6—BA。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：①誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)。②促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。③抑制根的分化。10精選ppt5.2細(xì)胞分裂素類10精選ppt5.3激素配比模式生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素：它們的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去或降低生長(zhǎng)素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例。高：有利于根的形成和愈傷組織的形成；適中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比例11精選ppt5.3激素配比模式生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比例11精選pptNoBAP

BAPreducedto0.1mg.l-1

NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant12精選pptNoBAP

BAPreducedto0.1mg.NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.

MSsaltsreducedto0.47g.l-1

SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1

Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.13精選pptNAAincreasedto5.0mg.l-1NoGA(赤霉素)：有20多種，生理活性及作用的種類、部位、效應(yīng)等各有不同、培養(yǎng)基中添加的是GA3，主要用于促進(jìn)幼苗莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長(zhǎng)素協(xié)同作用，對(duì)形成層的分化有影響，當(dāng)生長(zhǎng)素／赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化；此外，赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。一般在器官形成后，添加赤霉素可促進(jìn)器官或胚狀體的生長(zhǎng)。14精選pptGA(赤霉素)：14精選ppt6.抗生物質(zhì)抗生物質(zhì)有青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5—20mg/L之間。添加抗生物質(zhì)可防止菌類污染，減少培養(yǎng)中材料的損失。對(duì)于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5%—10%的抗菌素。15精選ppt6.抗生物質(zhì)15精選ppt活性炭的應(yīng)用：⑴莖尖初代培養(yǎng)，可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，一般為0.1%—0.2%，不能超過(guò)0.2%。⑵活性炭在生根時(shí)有明顯的促進(jìn)作用，可能是通過(guò)減弱光照保護(hù)IAA。⑶降低玻璃苗的產(chǎn)生頻率，對(duì)防止產(chǎn)生玻璃苗有良好作用，一般濃度為0.3%。7.活性炭活性炭結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用通常使用濃度為0.5—l0g／L。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)。16精選ppt活性炭的應(yīng)用：7.活性炭16精選ppt⑷活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基加入0.1%的活性炭，可減少組織變褐和培養(yǎng)基變色，產(chǎn)生較少的愈傷組織。但是，活性炭具有副作用，研究表示，每毫克的活性炭能吸附l00ng左右的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，這說(shuō)明只需要極少量的活性炭就可以完全吸附培養(yǎng)基中的調(diào)節(jié)物質(zhì)。大量的活性炭加入會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加一些瓊脂。很細(xì)的活性炭也易沉淀，通常在瓊脂凝固之前，要輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶?？傊?，那種隨意抓一撮活性炭放人培養(yǎng)基，會(huì)帶來(lái)不良的后果。因此，在使用時(shí)要有其量的意識(shí)，使活性炭發(fā)揮其積極作用。17精選ppt⑷活性炭在胚胎培養(yǎng)中也有一定作用，如在葡萄胚珠培養(yǎng)時(shí)向培養(yǎng)基８、瓊脂瓊脂(agar)是固體培養(yǎng)基的必要成分，瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營(yíng)養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。通常所說(shuō)的“煮化”培養(yǎng)基，就是使瓊脂溶解于90℃以上的熱水。瓊脂條的用量在6—10g／L之間，瓊脂粉的用量在3—4g／L之間。若濃度太高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過(guò)低，凝固性不好。新買(mǎi)來(lái)的瓊脂最好先試一下它的凝固力。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。18精選ppt８、瓊脂18精選ppt第二節(jié)培養(yǎng)基配制及注意事項(xiàng)19精選ppt第二節(jié)培養(yǎng)基配制及注意事項(xiàng)19精選ppt(一)母液配制的目的

方便配置其他培養(yǎng)基；保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取(二)母液配制方法（一）單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)。（二）混配法：將幾類營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可用amg/L表示，即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液aml.一、培養(yǎng)基母液的配制20精選ppt(一)母液配制的目的方便配置其他培養(yǎng)基；(二)母液配制方（三）母液配制的藥品與器材1、藥品：配制MS培養(yǎng)基所需的藥品、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、蒸餾水、0.1mol/L的NaOH，0.1mol/L的HCL2、器材：各類天平、燒杯、容量瓶、量筒、母液瓶、標(biāo)簽、冰箱等。21精選ppt（三）母液配制的藥品與器材1、藥品：配制MS培養(yǎng)基所需的藥品（四）母液配制（以MS培養(yǎng)基為例）有機(jī)物母液鐵鹽母液無(wú)機(jī)大量母液無(wú)機(jī)微量母液激素母液22精選ppt（四）母液配制（以MS培養(yǎng)基為例）有機(jī)物母液鐵鹽母液無(wú)配制MS培養(yǎng)基時(shí)母液的計(jì)算23精選ppt配制MS培養(yǎng)基時(shí)母液的計(jì)算23精選ppt1、無(wú)機(jī)大量母液(擴(kuò)大10倍配1L)成分硝酸鉀

硝酸銨硫酸鎂

磷酸二氫鉀氯化鈣稱量工具托盤(pán)天平注意：無(wú)機(jī)大量母液中的各種物質(zhì)在混合過(guò)程中有些離子易產(chǎn)生沉淀，應(yīng)使每種物質(zhì)先充分溶解，再進(jìn)行混合，而且鈣鹽最后緩慢加入進(jìn)去。24精選ppt1、無(wú)機(jī)大量母液(擴(kuò)大10倍配1L)成分硝酸鉀

硝酸銨硼酸，硫酸銅，硫酸錳，硫酸鋅，氯化鈷，鉬酸鈉，碘化鉀托盤(pán)天平和電子天平2、無(wú)機(jī)微量母液（擴(kuò)大100倍配1000ml）稱量工具成分25精選ppt硼酸，硫酸銅，托盤(pán)天平和電子天平2、無(wú)機(jī)微量母液（擴(kuò)大1003、鐵鹽（擴(kuò)大100倍1000ml）鐵鹽硫酸亞鐵，Na2-EDTA注意：鐵鹽采用托盤(pán)天平稱取。鐵鹽選用硫酸亞鐵而不用硫酸鐵，是因?yàn)樗芙夂笠桩a(chǎn)生紅色的氫氧化鐵沉淀。26精選ppt3、鐵鹽（擴(kuò)大100倍1000ml）鐵鹽硫酸亞鐵，注意：鐵鹽4、有機(jī)物（擴(kuò)大50倍500ml）有機(jī)物甘氨酸VB1VB6煙酸肌醇注意：有機(jī)物中的物質(zhì)均采用托盤(pán)天平和電子天平稱取。27精選ppt4、有機(jī)物（擴(kuò)大50倍500ml）有機(jī)物甘氨酸注意：有機(jī)物中5、激素母液（常用的）生長(zhǎng)素NAA，IBA，2,4-D，IAA細(xì)胞分裂素6-BA，KT，GA，ZT注意：這些激素配制時(shí)，一般配成1mg/ml，NAA、IBA、IAA一般可先用少量95%酒精助溶。2，4-D可用0.1mol／L的NaOH或KOH助溶，細(xì)胞分裂素類一般先用少量1mol／L鹽酸溶解。28精選ppt5、激素母液（常用的）生長(zhǎng)素NAA，IBA，細(xì)胞分裂素6-B29精選ppt29精選ppt6、母液的保