蛋白質(zhì)的提取純化和分析

關(guān)于蛋白質(zhì)的提取純化和分析材料選擇和預(yù)處理細(xì)胞破碎蛋白質(zhì)的粗提目錄題目分析蛋白質(zhì)的純化分析檢測(cè)第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天1題目解析已知某蛋白的分子量約為17kDa，等電點(diǎn)3.9~4.1，它能耐一定的高溫，在90°C加熱3~4min后仍然能夠保持80%的活性。該蛋白含有較多的疏水性殘基，與Ca2+結(jié)合后可以暴露它的疏水基團(tuán)。該蛋白的作用是作為生物體內(nèi)酶的激活劑。在鈣離子的作用下才能起到暴露疏水集團(tuán)發(fā)揮性能，結(jié)合蛋白質(zhì)基礎(chǔ)知識(shí)從而可以判斷其為鈣調(diào)蛋白。第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天材料的選擇TEXT材料的預(yù)處理成年健康雄性大鼠腦組織20克（比雌鼠體積大，成本較低物種易獲得）將切取的組織用4℃預(yù)冷0.01mol/l的PBS漂洗去血漬，再用濾紙吸干殘留的PBS（磷酸鹽緩沖液）第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

預(yù)處理過的組織

細(xì)胞破碎（高速珠磨法）

制備組織細(xì)胞懸液（剪碎法）

蛋白質(zhì)被釋放出來331122破碎第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天剪碎法1.將組織塊放入平皿后，加入少量PBS；2.用眼科剪將組織剪至勻漿狀，加入10mlPBS；3.用吸管吸取組織勻漿，用200目尼龍網(wǎng)過濾到試管內(nèi)；返回第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天高速珠磨法破碎機(jī)理：高速珠磨法是一種有效的細(xì)胞破碎方法，珠磨機(jī)是該法所用的設(shè)備，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖（1）。微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞膜破裂，釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天鈣調(diào)蛋白的粗提取抽提蛋白質(zhì)破碎后，使用適當(dāng)?shù)娜軇瑢⒌鞍踪|(zhì)提取溶解到溶劑當(dāng)中，常用稀酸、稀堿、有機(jī)溶劑等電點(diǎn)3.9~4.1酸性蛋白質(zhì)稀堿性溶液抽提溶液堿性的程度，堿性過大則難以復(fù)性pH調(diào)至等電點(diǎn)偏堿的一側(cè)（4.1）第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天粗提取物離心操作除去固體雜質(zhì)的上清液第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天熱變性初步純化天然結(jié)構(gòu)%鈣調(diào)蛋白一般蛋白100℃熱穩(wěn)定性不同第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天其他方法鹽析法等電點(diǎn)法有機(jī)溶劑法第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3蛋白質(zhì)的精純和分析鑒定第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天親和色譜配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體洗脫結(jié)合耦聯(lián)作用機(jī)理第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天金屬螯合親和層析鈣調(diào)蛋白的外形似啞鈴,有兩個(gè)球形的末端,中間被一個(gè)長而富有彈性的螺旋結(jié)構(gòu)相連,每個(gè)末端有兩個(gè)Ca2+結(jié)構(gòu)域,每個(gè)結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合一Ca2+,這樣,一個(gè)鈣調(diào)蛋白可以結(jié)合4個(gè)Ca2+,鈣調(diào)蛋白與Ca2+結(jié)合后的構(gòu)型相當(dāng)穩(wěn)定。第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天金屬螯合色譜原理：利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基

與二價(jià)金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相

上，二價(jià)金屬離子可以與流動(dòng)相中含有的半胱

氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合

作用而進(jìn)行分離NH2NH2NiHisHisHisHisprotein第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天步驟1.制作金屬螯合親和色譜柱：用濃度為0.2mol/L的CaCl2溶液上柱。將上清液PH調(diào)制6-8，加入蛋白質(zhì)解離抑制劑。慢上樣3.再用配體CaCl2溶液洗脫，下方流出為目的蛋白液，用大使管或者燒杯盛裝之。2.上柱后依次用50mlbufferB、200ml含0.5mol/LNaCl的bufferB洗脫。下方用大試管或燒杯收集雜質(zhì)液。第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天步驟目的：除去蛋白液中配體離子方法一：半透膜進(jìn)行透析方法二：將上次獲得目的蛋白液經(jīng)凝膠過濾色譜柱下方首次接受的溶液即為高純度的鈣調(diào)蛋白溶液；第二次接受到的即為配體離子的溶液。第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天凝膠過濾色譜的洗脫第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天定性分析分析鑒定定量分析第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天定性分析第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）測(cè)定

蛋白質(zhì)分子量

用SDS-PAGE檢測(cè)不同純化階段所獲得的提取液樣品中CaM的純度與相對(duì)分子質(zhì)量。電泳采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的分離膠和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的濃縮膠，120V電壓條件下進(jìn)行電泳，直至溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部，考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠成像儀成像。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天定量分析紫外檢測(cè)法簡(jiǎn)單快速不破壞樣品準(zhǔn)確度低考馬斯亮藍(lán)染色法簡(jiǎn)單迅速干擾少靈敏度高(1μg)Folin-酚試劑法靈敏度高常用第23頁,共25頁，2024年2月25日，星期天goalsFolin-酚試劑法在堿性條件下