2.2.2動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修33_第1頁
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文檔簡介

2.2動(dòng)物細(xì)胞工程二、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體什么是動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)?單克隆抗體是如何制備的?在臨床上有哪些應(yīng)用?本節(jié)聚焦12A細(xì)胞B細(xì)胞正在融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁高Ca2+—高pH融合法等脫分化再分化移栽植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)雜種植株愈傷組織A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體移栽后的植株植物體細(xì)胞雜交技術(shù)植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的優(yōu)勢:打破生殖隔離,實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種,培育出新的作物類型。

回顧舊知實(shí)驗(yàn):人——鼠細(xì)胞熒光標(biāo)記融合實(shí)驗(yàn)融合細(xì)胞細(xì)胞融合37℃40min正在融合的細(xì)胞紅色熒光染料標(biāo)記膜蛋白綠色熒光染料標(biāo)記膜蛋白人細(xì)胞小鼠細(xì)胞有沒有技術(shù)能讓不同種動(dòng)物的體細(xì)胞雜交,培育出集不同細(xì)胞的優(yōu)勢于一身的動(dòng)物細(xì)胞呢?

回顧舊知1.概念:2.原理:3.融合方法:4.意義:使兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞膜的流動(dòng)性PEG融合法、電融合法和滅活病毒誘導(dǎo)法等。(化學(xué)法、

物理法、

生物法

)突破了有性雜交的局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。已成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段,特別是雜交瘤技術(shù),為制造單克隆抗體開辟了新途徑。動(dòng)物細(xì)胞融合特有雜交細(xì)胞:具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息01動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與誘導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合的方法一樣:P37單核

滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力,但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理是:病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用,使細(xì)胞互相凝聚,細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布,細(xì)胞膜打開,細(xì)胞發(fā)生融合。動(dòng)物細(xì)胞融合實(shí)質(zhì)及完成的標(biāo)志:細(xì)胞核的融合

相關(guān)信息2024/4/5

19世紀(jì)30年代,科學(xué)家曾在患肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象?

病人體內(nèi)的病毒等誘導(dǎo)多個(gè)體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。注意說明動(dòng)物細(xì)胞融合與受精作用的區(qū)別(1)受精作用:是在同種生物之間進(jìn)行的,精子與卵細(xì)胞的融合不需要任何誘導(dǎo)劑,受精卵內(nèi)具備同種生物的兩個(gè)親本的遺傳物質(zhì)。(2)動(dòng)物細(xì)胞融合可在不同物種間進(jìn)行,由于物種間存在生殖隔離,所以自然條件下不能融合成雜交細(xì)胞,必須有誘導(dǎo)劑才能融合。形成的雜交細(xì)胞具備兩個(gè)親本細(xì)胞的遺傳物質(zhì),從而體現(xiàn)兩個(gè)親本的遺傳特性。植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞物理法:電融合法、離心法;化學(xué)法:聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離,實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種,培育植物新品種突破了有性雜交的局限,使遠(yuǎn)緣雜交成為可能2024/4/5動(dòng)物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較《金》P55例11.抗體是什么?由什么細(xì)胞分泌產(chǎn)生?早期獲得抗體的方法及該方法的缺點(diǎn)?2.在體外培養(yǎng)條件下,如何讓一個(gè)B淋巴細(xì)胞無限增殖?3.給小鼠注射特定抗原的目的是什么?哪里收集B細(xì)胞?4.從小鼠體內(nèi)提取的B淋巴細(xì)胞只有一種嗎?為什么?5.誘導(dǎo)融合后有多少類雜交細(xì)胞(只考慮兩兩融合)?6.兩次篩選的目的和手段分別是什么?7.如何大規(guī)模進(jìn)行培養(yǎng)得到大量的單克隆抗體?單克隆抗體的制備二自主學(xué)習(xí)P48-P49,小組討論,解決下列問題:2.早期獲得抗體的方法向動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原→從動(dòng)物血清中分離所需抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差缺點(diǎn):抗原

反復(fù)注射動(dòng)物從動(dòng)物的血清中分離抗體單克隆抗體的制備二1.抗體的本質(zhì)是什么?如何產(chǎn)生的?漿細(xì)胞抗體(蛋白質(zhì))抗原B細(xì)胞激活增殖、分化?若要得到大量的單一抗體,我們該如何去做?3.制造單克隆抗體理論基礎(chǔ):每一個(gè)B細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。B淋巴細(xì)胞不能無限增殖

克隆單一的B淋巴細(xì)胞,得到的細(xì)胞群就能分泌出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體制備思路:困難:單克隆抗體的制備二克隆單克隆抗體一個(gè)已免疫的B淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng),不能無限增殖化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)分泌英國米爾斯坦德國科勒

由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術(shù),米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。大膽設(shè)想:B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞(能產(chǎn)生抗體)(能大量增殖)雜交細(xì)胞(既能大量增殖,又能產(chǎn)生特定抗體)單克隆抗體的制備二單克隆抗體制備的過程:注射特定的抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞從脾中提取B淋巴細(xì)胞多種骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合①不產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞:B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞②產(chǎn)生B1、B2、B3等不同抗體的B細(xì)胞(漿細(xì)胞)目的:

獲得能產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B淋巴細(xì)胞融合體系中有多少種類型的細(xì)胞?未融合的細(xì)胞B淋巴細(xì)胞相互融合的細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞相互融合的細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞√單克隆抗體制備的過程:多種雜交細(xì)胞未融合的細(xì)胞瘤-瘤、B-B、第一次篩選:用特定的選擇培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基上,未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡,只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長雜交瘤細(xì)胞(既能迅速大量增殖,又能產(chǎn)生抗體)第二次篩選:克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(多次篩選)抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞用96孔板培養(yǎng)和篩選雜交瘤細(xì)胞(每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞)克隆化培養(yǎng)獲得能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合瘤-記B、瘤-B1、瘤-B2、瘤-B3…注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提取能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體制備的過程:單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn):特異性強(qiáng)、靈敏度高、可大量制備單個(gè)雜交瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生高度純一的抗體2.制備過程.&1&

.(二)單克隆抗體及其應(yīng)用3.制備單克隆抗體的過程:動(dòng)物細(xì)胞融合(原理:細(xì)胞膜的流動(dòng)性)

*不是為了得到抗體!第一次篩選:獲得雜交瘤細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(原理:細(xì)胞增殖)第二次篩選:獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn):優(yōu)點(diǎn):能準(zhǔn)確地識(shí)別抗原的細(xì)微差異,與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合,并且可以大量制備應(yīng)用到的技術(shù):原理:

細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、細(xì)胞增殖多種雜交細(xì)胞及未融合的細(xì)胞誘導(dǎo)

融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選足夠數(shù)量的能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(既能迅速大量增殖,又能產(chǎn)生抗體)(產(chǎn)生抗體)(能無限增殖)從腹腔液中提取從培養(yǎng)液中提?。蛇M(jìn)行多次)動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

歸納向小鼠注射特定的抗原培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細(xì)胞B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞多種細(xì)胞多種雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞第一次篩選:選擇培養(yǎng)基第二次篩選:克隆化培養(yǎng)+專一抗體檢測注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖體外培養(yǎng)單克隆抗體融合★單克隆抗體制備的過程(既能迅速大量增殖,又能產(chǎn)生抗體)(特異性強(qiáng)、靈敏度高、可大量制備)《金》P56例2、例3;P576、12、14第一次篩選第二次篩選原因方法原理結(jié)果誘導(dǎo)融合后得到的細(xì)胞中,除雜交瘤細(xì)胞之外,還有未融合的親本細(xì)胞,也有融合的具有同種核的細(xì)胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激,所以經(jīng)第一次篩選之后獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選用96孔板培養(yǎng),在每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下,進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(進(jìn)行多次篩選)獲得雜交瘤細(xì)胞獲得能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞兩次篩選的比較只有融合的雜交瘤細(xì)胞可以生長,其他細(xì)胞死亡細(xì)胞增殖、抗原抗體特異性結(jié)合

第一次篩選的雜交瘤細(xì)胞并非都是能分泌所需抗體的細(xì)胞,通常用“有限稀釋法”來進(jìn)一步選擇。將雜交瘤細(xì)胞稀釋,用多孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞,在每孔只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下,開始培養(yǎng),讓其增殖。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體(常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法),那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞,挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋,一般需進(jìn)行3~4次,直至確信每個(gè)孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。該過程即為雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)?!暗诙魏Y選”原理知識(shí)延伸克隆化培養(yǎng)多孔培養(yǎng)板抗體檢測稀釋單個(gè)細(xì)胞克隆化培養(yǎng)專一抗體檢驗(yàn)呈陽性的細(xì)胞篩選原因:由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激,所以經(jīng)第一次篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞中存在產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞。原理:抗原——抗體特異性結(jié)合【原理】將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋后滴入多孔板,如果稀釋度足夠高,多孔板的一個(gè)孔里就可能只有1個(gè)雜交瘤細(xì)胞,培養(yǎng)之后(即克隆化培養(yǎng)),用標(biāo)記的抗原檢測每個(gè)小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體(抗原抗體能結(jié)合即為陽性孔)。這樣經(jīng)過多次克隆化培養(yǎng)以及有限稀釋法的篩選,就能選出需要的那種雜交瘤細(xì)胞(AB3)。第二次篩選(1)篩選原因:由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激,所以經(jīng)第一次篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞中存在產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞。(2)篩選方法:用多孔培養(yǎng)皿培養(yǎng),在每個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下開始克隆化培養(yǎng)和抗體檢測,經(jīng)多次篩選得到能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞群。(3)篩選目的:得到能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞多孔培養(yǎng)板克隆化培養(yǎng)和抗體檢測篩選抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖又能產(chǎn)生特異性抗體注意說明陽性孔將雜交瘤細(xì)胞群稀釋,約每孔1個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(克隆化培養(yǎng))一段時(shí)間后,檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔多孔細(xì)胞培養(yǎng)板抗體檢測板分泌抗體能跟特定抗原結(jié)合的細(xì)胞即為所需雜交瘤細(xì)胞“第二次篩選”原理知識(shí)延伸《報(bào)》40期P38

思考·討論

單克隆抗體的應(yīng)用資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷,這比原來的診斷方法提前了10d左右,可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對(duì)胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90%以上。①作為診斷試劑——最廣泛應(yīng)用

思考·討論

單克隆抗體的應(yīng)用討論:1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用?資料2使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒有特異性,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會(huì)對(duì)健康細(xì)胞造成傷害,這限制了它在臨床上的應(yīng)用??贵w-藥物偶聯(lián)物(ADC)通過將細(xì)胞毒素與能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細(xì)胞毒素)三部分組成,它的作用機(jī)制如下圖所示??贵w:靶向運(yùn)輸藥物,即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原,將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞。藥物:發(fā)揮治療效應(yīng),如殺傷靶細(xì)胞ADC(2)用于運(yùn)載藥物

思考·討論

單克隆抗體的應(yīng)用2.除了細(xì)胞毒素,還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物?3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢?①可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療;②一些作用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路來抑制其生長,理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。①檢測的特異性和靈敏度大大提高;有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒;②ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識(shí)別的靶向作用和細(xì)胞毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)單克隆抗體的應(yīng)用三單克隆抗體能準(zhǔn)確地識(shí)別抗原的細(xì)微差異,與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合,并且可以大量制備。

利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù),可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。1.單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn):2.

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