色譜的定性與定量

關(guān)于色譜的定性與定量一、色譜的定性分析1、利用保留值定性

鑒別每個(gè)色譜峰通過(guò)比較保留值(通常是保留時(shí)間)的方法，找到各色譜峰所對(duì)應(yīng)的組份大多數(shù)情況下用比較保留時(shí)間來(lái)定性 即所謂：保留時(shí)間相同，可能是同樣的組份保留時(shí)間不同，肯定不是同樣的組份第2頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）氣相色譜中用保留值定性的方法

①利用已知物直接對(duì)照進(jìn)行定性分析通常做法：把未知物和已知標(biāo)準(zhǔn)物在同一根色譜柱上，用相同的色譜操作條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖后利用保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)為避免載氣流速和溫度變化引起保留時(shí)間的變化，可用相對(duì)保留值定性或用已知物增加峰高法定性第3頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

已知物增加峰高法定性原理：在得到未知樣品的色譜圖后，往未知樣品中加入一定量的已知物質(zhì)，在同樣色譜條件下的兩色譜圖對(duì)比圖譜比較峰高。第4頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天②利用相對(duì)保留值定性

定義：相對(duì)保留值是組分i與基準(zhǔn)物S的調(diào)整保留值之比：

優(yōu)點(diǎn)：可以消除某些操作條件的影響，只要柱溫、固定相不變，即使柱徑、柱長(zhǎng)、填充情況及流動(dòng)相的流速有所變化，相對(duì)保留值γ仍然不變，它是色譜定性分析的重要參數(shù)第5頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天③利用保留指數(shù)定性

表示物質(zhì)在固定液上的保留行為，是目前使用最廣泛并被國(guó)際上所公認(rèn)的定性參數(shù)，它具有定性可靠，重現(xiàn)性好，標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一等優(yōu)點(diǎn)。

可將儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)中的標(biāo)準(zhǔn)保留指數(shù)轉(zhuǎn)換成用戶色譜條件下的保留指數(shù)和保留時(shí)間（tR）第6頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（A）定義（B）保留指數(shù)的測(cè)定保留指數(shù)的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性都很好，用同一色譜柱測(cè)定誤差小于1%，因此只要柱溫和固定液相同，就可以用文獻(xiàn)上發(fā)表的保留指數(shù)定性。第7頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）液相色譜中用保留值定性的方法

保留值定性的主要方法

★直接與已知標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照★某一未知峰和已知標(biāo)準(zhǔn)物的保留值完全相同—可能是★改變色譜柱或流動(dòng)相，保留時(shí)間仍完全相同—基本是第8頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天利用文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比和定性分析

注意HPLC的柱填充技術(shù)的復(fù)雜性，定性受到限制第9頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

最簡(jiǎn)單的方法：標(biāo)準(zhǔn)添加法

前提：要有標(biāo)準(zhǔn)物

判斷的標(biāo)準(zhǔn)：加入標(biāo)準(zhǔn)樣后，使未知樣色譜峰增高，改變色譜條件，未知峰仍能增高第10頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天同時(shí)用其他方法其他色譜方法（改變機(jī)理，如：用不同的色譜柱）其他檢測(cè)器PDA，光譜圖比較、譜庫(kù)檢索確認(rèn)色譜峰的純度

-保證每個(gè)色譜峰下只有一個(gè)被測(cè)的組份

-檢查是否有共流出的物質(zhì)（雜質(zhì)）干擾色譜峰純度確認(rèn)的方法

-用光電二極管矩陣檢測(cè)器比較光譜圖

-峰純度鑒定，四波長(zhǎng)比例MS，質(zhì)譜圖解析、譜庫(kù)檢索其他儀器方法第11頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）平面色譜中用保留值定性的方法

定性方法：比較未知組分和已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的比移值影響比移值的因素：固定相的性質(zhì)、展開(kāi)劑的性質(zhì)、被分離組分的性質(zhì)、展開(kāi)時(shí)的溫度等注意事項(xiàng)①展開(kāi)槽應(yīng)密閉②沿分離軌跡固定相與流動(dòng)相無(wú)梯度變化③展開(kāi)劑的前沿位置能正確測(cè)定第12頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.聯(lián)機(jī)定性

聯(lián)機(jī)定性是指把色譜和質(zhì)譜、紅外、紫外和核磁共振法聯(lián)合使用聯(lián)用方式：第一種：先收集色譜分離后的組分，再用“四大譜”的方法進(jìn)行定性分析第二種：通過(guò)“接口”技術(shù)直接把色譜和“四大譜”儀器連接起來(lái)，對(duì)每一被分離的組分進(jìn)行定性分析第13頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、色譜定量分析定量分析的具體內(nèi)容確定樣品的類(lèi)型，主要成分/痕量成分使分析條件的分離度（R）大于：1.5色譜峰的定性，峰一致性測(cè)定檢測(cè)限及定量限：確定靈敏度及線性范圍用標(biāo)樣建立標(biāo)準(zhǔn)曲線檢查方法的準(zhǔn)確度及精確度用標(biāo)樣定期檢查方法第14頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（一）定量分析基礎(chǔ)1.定量分析的基本公式定量分析的目的：

要確定樣品中某一組分的準(zhǔn)確含量，是一種相對(duì)的定量方法

定量分析的方法：

在某些限定條件下，檢測(cè)器響應(yīng)值（色譜峰的峰面積或峰高）---所測(cè)組分的數(shù)量或濃度成正比，第15頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天即：

式中：–組分i的質(zhì)量

—組分i的濃度

—組分的校正因子（與檢測(cè)器的性質(zhì)和被測(cè)組分的性質(zhì)有關(guān)）

—組分i的峰面積，

—組分i的峰高第16頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.峰面積的準(zhǔn)確測(cè)定1）對(duì)稱峰的峰高和峰面積的測(cè)定第一法：峰高×半高峰寬式中：h—從峰頂?shù)椒宓拙€的垂直距離

Wh/2—峰高1/2處的峰寬第17頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二法：三角形法式中：BM—三角形的高

Wi—三角形KML的半高寬，近似等于色譜峰高0.607處的峰寬第18頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天2)不對(duì)稱峰峰高和峰面積的測(cè)量第一法：峰高×峰寬的平均值式中：h—峰頂?shù)椒宓拙€的垂直距離

?（b0.15+b0.85)—峰高0.15處和峰高0.85處的峰寬平均值第19頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二法：峰分割計(jì)算后加和法

A=A1+A2=h1×b1+h2×b2第三法：大峰上的小峰峰面積的測(cè)量第四法：基線漂移時(shí)色譜峰峰面積的測(cè)量第五法：重疊峰峰面積的測(cè)量第20頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.定量校正因子的測(cè)定（1）絕對(duì)校正因子（fi)★fi的物理意義:單位峰面積所代表的I組分的量,是一個(gè)與i組分的物理化學(xué)性質(zhì)和檢測(cè)器的性質(zhì)有關(guān)的常數(shù)★定量校正因子的計(jì)算公式為：注意:峰高定量校正因子fi(h)受操作條件影響較大

第21頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

絕對(duì)校正因子fi的大小主要由操作條件和儀器的靈敏度所決定，既不容易準(zhǔn)確測(cè)量，也無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)操作條件波動(dòng)時(shí)，fi也發(fā)生變化。故fi無(wú)法直接應(yīng)用，定量分析時(shí)，一般采用相對(duì)校正因子。第22頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）相對(duì)校正因子（校正因子）：式中：f--相對(duì)校正因子，簡(jiǎn)稱為校正因子，無(wú)因次量

fi,fs—i物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)（s）的質(zhì)量（或濃度)Ai(hi),As(hs)---物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積（或峰高）第23頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

根據(jù)物質(zhì)量的不同表示方法，校正因子分為：①質(zhì)量校正因子(fm)

定義：當(dāng)物質(zhì)量用質(zhì)量來(lái)表示時(shí)的校正因子稱為質(zhì)量校正因子(fm),表示單位峰面積所代表的組分質(zhì)量，質(zhì)量一般用g或mg表示.

式中：mi,ms-被測(cè)物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量

Ai,As-被測(cè)物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積

第24頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天②摩爾校正因子(fM)

定義：物質(zhì)的量用摩爾數(shù)表示，表示單位峰面積所代表的組分摩爾數(shù)

式中：Mi,Ms-被測(cè)物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的摩爾質(zhì)量第25頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天③體積校正因子（fv）定義：物質(zhì)的量用體積表示,表示單位峰面積所代表的組分體積。

式中：Vi,Vs—表示被測(cè)物質(zhì)、基準(zhǔn)物質(zhì)的體積第26頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天(3)相對(duì)響應(yīng)值sˊ

相對(duì)響應(yīng)值是物質(zhì)i與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)S的響應(yīng)值（靈敏度）之比。單位相同時(shí)，與校正因子互為倒數(shù)，即：與只與試樣、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及檢測(cè)器類(lèi)型有關(guān)，而與操作條件和柱溫、載氣流速、固定液性質(zhì)等無(wú)關(guān)，是一個(gè)能通用的常數(shù)。

第27頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（4）校正因子的實(shí)驗(yàn)測(cè)量方法

★樣品的準(zhǔn)備：測(cè)定校正因子時(shí)，要精密稱定適量色譜純的被測(cè)組分和基準(zhǔn)物質(zhì)，配制成已知準(zhǔn)確濃度的樣品?！飿悠返臏y(cè)定：在已確定的色譜條件下，取準(zhǔn)確體積的樣品進(jìn)樣，從譜圖上獲得準(zhǔn)確的峰面積

★計(jì)算：根據(jù)相對(duì)校正因子的計(jì)算公式可以算出質(zhì)量（或摩爾或體積）校正因子第28頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：某試樣合有5μg乙醇，測(cè)得相應(yīng)的色譜峰面積為150mm2，求乙醇的fi。解：即每平方毫米色譜峰面積代表3.3×10-2μg乙醇第29頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的色譜純對(duì)二甲苯、甲苯、苯及仲丁醇，混合后稀釋?zhuān)捎脷溲鏅z測(cè)器，定量進(jìn)樣并測(cè)量各物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的峰面積，數(shù)據(jù)如下：物質(zhì)苯仲丁醇甲苯對(duì)二甲苯

m/μg0.47200.63250.81490.4547A/cm22.603.404.102.20以仲丁醇為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各物質(zhì)的相對(duì)質(zhì)量校正因子。第30頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第31頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）定量方法1.歸一化法

★定義：把所有出峰的組分含量之和按100%計(jì)的定量方法稱為歸一化法，是一種相對(duì)定量方法?！锴疤幔簶悠分械乃薪M分都能流出色譜柱，而且在檢測(cè)器上所有的組分都能產(chǎn)生信號(hào)。計(jì)算方法：

第32頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天★優(yōu)點(diǎn)：歸一化法很直觀，容易接受，計(jì)算簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，當(dāng)操作條件如進(jìn)樣量、流速等發(fā)生變化時(shí)，對(duì)計(jì)算結(jié)果的影響很小，是一種常用的計(jì)算方法★缺點(diǎn)：校正因子的測(cè)定比較麻煩，必需所有組分都出峰★注意：▼主要用于GC的定量測(cè)定，當(dāng)fi相近時(shí)，可直接用峰面積歸一化法。▼由于檢測(cè)技術(shù)的影響,HPLC中很少使用歸一化

第33頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法：選擇適宜的物質(zhì)作為待測(cè)組分的參比物，定量加到樣品中去，根據(jù)待測(cè)組分和參比物在檢測(cè)器上的響應(yīng)值之比和參比物加入量進(jìn)行定量分析的方法。第34頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天鍵：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物內(nèi)標(biāo)物的選擇原則：A、內(nèi)標(biāo)物必須是原樣品中不存在的物質(zhì)，其性質(zhì)盡量與待測(cè)組分相近(同系物、異構(gòu)體)B、內(nèi)標(biāo)物不能和被測(cè)組分起化學(xué)反應(yīng)，要能完全溶于被測(cè)樣品中；C、內(nèi)標(biāo)物的峰盡可能接近待測(cè)組分的峰，或位于幾個(gè)待測(cè)組分的中間，但必須和樣品中的所有峰完全分離；D、內(nèi)標(biāo)物的加入量應(yīng)和待測(cè)組分相近。第35頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天

待測(cè)組分(i)的量mi為：設(shè)樣品的總量為m，則待測(cè)組分i的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為第36頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)：★無(wú)歸一化法的限制，即只要被測(cè)組分能出峰，不和其他峰重疊，不管其他組分是否出峰或是否重疊，都可以用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析★定量準(zhǔn)確，受操作條件影響較小

★可部分補(bǔ)償待測(cè)組分在樣品前處理時(shí)的損失★若加入幾種內(nèi)標(biāo)物，還可提高定量分析的精度★內(nèi)標(biāo)物的選擇比較困難，同時(shí)內(nèi)標(biāo)物稱量要求準(zhǔn)確，操作麻煩第37頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法

如果每次稱取同樣量(m)的試樣，每次加入相等量(ms)的內(nèi)標(biāo)物，則上式中m，ms，fi’均為常數(shù)，計(jì)算公式可寫(xiě)為：從內(nèi)標(biāo)公式可知第38頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天第39頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)際色譜圖第40頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天例:取二甲苯生產(chǎn)母液1500mg，母液中合有乙苯、對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯及溶劑和少量苯甲酸，其中苯甲酸不能出峰。以150mg壬烷作內(nèi)標(biāo)物，測(cè)得有關(guān)數(shù)據(jù)如下：物質(zhì)壬烷乙苯對(duì)二甲苯間二甲苯鄰二甲苯Ai/cm298709512080f`m1.020.971.000.960.98求:各組分的含量。第41頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天解：母液中苯甲酸不能出峰，所以只能用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。由各組分的絕對(duì)校正因子計(jì)算得壬烷、乙苯、對(duì)二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的相對(duì)校正因子分別為1.00，0.95，0.98，0.94，0.96。根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計(jì)算公式，對(duì)于乙苯有：同樣可以計(jì)算出對(duì)二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.5%，11.5%，7.84%。第42頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、外標(biāo)法

外標(biāo)法又可分為標(biāo)準(zhǔn)曲線法和外標(biāo)一點(diǎn)法，是色譜定量分析中比較常用的一種方法，是絕對(duì)定量方法。第43頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天計(jì)算方法：用濃度～峰面積（峰高）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其斜率即為絕對(duì)校正因子，應(yīng)該是一條通過(guò)原點(diǎn)的直線。

第44頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)：★簡(jiǎn)便、快速、適合于大量樣品的分析★無(wú)需各組份都被檢出、洗脫★需要標(biāo)樣★標(biāo)樣及樣品測(cè)定的條件要一致★進(jìn)樣體積要準(zhǔn)確，重復(fù)性好★對(duì)樣品前處理過(guò)程中待測(cè)組分的變化無(wú)法補(bǔ)償。第45頁(yè),共51頁(yè)，2024年2月25日，星期天外標(biāo)一點(diǎn)法

利用待測(cè)組分純物質(zhì)配制一個(gè)與待測(cè)組分含量相近的標(biāo)準(zhǔn)樣（設(shè)量為ms），在同一色譜條件下，分別將相同量的待測(cè)組分標(biāo)樣及試樣注入色譜儀，出峰后，測(cè)量其峰面積（或峰高），得相應(yīng)的峰面積As和Ai

第46頁(yè),共51頁(yè)，2024年