《分析化學(xué)》第十二章-液相色譜法

第十二章液相色譜法第一節(jié)概述第二節(jié)柱色譜法第三節(jié)平面色譜法思考與練習(xí)2024/4/81第一節(jié)概述色譜法(chromatography)又稱層析法，是一種依據(jù)物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)的不同(如溶解性、極性、離子交換能力、分子大小等)而進行的分離分析方法。一、色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展二、色譜法的分類三、色譜法的基本原理2024/4/82一、色譜法的產(chǎn)生和發(fā)展俄國植物學(xué)家茨維特在1906年使用的裝置，如圖：起分離作用的柱子叫色譜柱，其中的一相固定不動，稱為固定相；另一相是攜帶試樣混合物流過此固定相的流體(氣體或液體)，稱為流動相。色譜法是一種分離技術(shù)2024/4/83小結(jié)：色譜過程組分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)微小差異與固定相作用差異隨流動相移動的速度不等差速遷移色譜分離。兩相及兩相的相對運動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)；色譜過程就是組分的分子在流動相和固定相間多次“分配”產(chǎn)生“差速遷移”的過程。2024/4/86（二）分配系數(shù)K被分離組分以不同的程度分布在兩相中，溶質(zhì)既可進入固定相，也可進入流動相，這個過程叫分配分配系數(shù):在一定的溫度和壓力下，某組分在兩相間的分配達到平衡時濃度（或溶解度）之比。組分在流動相中的濃度cm組分在固定相中的濃度csK=K吸附色譜：吸附平衡常數(shù)分配色譜：分配系數(shù)離子交換色譜：交換系數(shù)凝膠色譜：滲透系數(shù)(吸附系數(shù))2024/4/87（三）保留值某組分從開始洗脫到從柱中被洗脫下來所需要的時間稱為保留時間(retentiontime)，通常用符號“tR”表示。某組分從開始洗脫到從柱中被洗脫下來所需要的流動相的體積稱為保留體積(retentionvolume)，通常用符號“VR”表示。保留值是色譜法定性分析的基本參數(shù)。2024/4/88（四）分配系數(shù)與保留值的關(guān)系K值越大，移動速度越慢，tR越長，后出柱K值越小，移動速度越快，tR越短，先出柱混合物中各組分間的分配系數(shù)K相差越大，各組分越容易被分離2024/4/89第二節(jié)柱色譜法一、液-固吸附柱色譜法二、分配柱色譜法三、離子交換柱色譜法四、凝膠柱色譜法2024/4/810一、液-固吸附柱色譜法（一）原理利用吸附劑對不同組分的吸附能力的差異進行分離的一種色譜法。吸附作用與吸附平衡吸附平衡常數(shù)（吸附系數(shù)）組分在流動相中的濃度組分在吸附劑中的濃度=K影響K的因素:吸附劑的活性、組分和流動相的性質(zhì)K的意義:組分的吸附系數(shù)K越大，表示越容易被吸附，保留時間越長，流出色譜柱就越慢。2024/4/811（二）吸附劑1.對吸附劑的基本要求是：(1).具有較大的表面積和足夠的吸附能力。(2).在所用的溶劑和洗脫劑中不溶解；不與試樣各組分、溶劑和洗脫劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(3).顆粒較均勻，有一定的細度，在使用過程中不易破碎。(4).具有較為可逆的吸附性，既能吸附試樣組分，又易于解吸。目前最常用的吸附劑是硅膠和氧化鋁，其次是聚酰胺、活性炭，還有大孔吸附樹脂等。2024/4/8122.常用的吸附劑硅膠：多孔性微粒，表面帶有硅醇基，呈弱酸性。原理:硅醇基(吸附中心)與極性基團形成氫鍵(吸附性),組分與硅醇基形成氫鍵(被吸附)的能力不同而分離。應(yīng)用:酸性和中性物質(zhì)的分離，如有機酸、酚類、醛類.2024/4/813硅膠活度與含水量的關(guān)系：含水量高，活度低?；罨杭訜嶂?00℃左右，除去吸附水提高活度分離效率：與其粒度及表面積等有關(guān)。常用硅膠：硅膠H，不含黏合劑硅膠G，含煅石膏硅膠GF254，含煅石膏和一種無機熒光劑，即錳激活的硅酸鋅，在254nm紫外光下呈強烈黃綠色熒光背景。硅膠含水量%活性級別氧化鋁含水量%0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ152024/4/814氧化鋁種類堿性氧化鋁(pH9～10):適用于分離堿性或中性化合物酸性氧化鋁(pH5～4.5):適用于分離酸性化合物中性氧化鋁(pH7～7.5):適用于分離酸性、中性和堿性化合物活性與含水量的關(guān)系含水量高，活性級高，活度低硅膠含水量%活性級別氧化鋁含水量%0Ⅰ05Ⅱ315Ⅲ625Ⅳ1038Ⅴ152024/4/815其它吸附劑聚酰胺是一類由酰胺聚合而成的高分子化合物結(jié)構(gòu)特點：存在許多酰胺鍵，可與酚類、酸類、硝基化合物、醌類等形成氫鍵。活性碳：屬于非極性吸附劑，吸附能力強，適合于水溶性物質(zhì)的分離大孔吸附樹脂：不含交換基團，具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附劑。用于皂苷及苷類化合物的分離2024/4/816（三）流動相(洗脫劑)

1.對流動相的基本要求是：(1).對試樣組分的溶解度要足夠大。(2).不與試樣組分和吸附劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(3).粘度小，易流動。(4).有足夠的純度。2.溶劑的極性由弱到強的順序：石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<苯<甲苯<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水2024/4/817(四）被分離的物質(zhì)(1)烷烴系非極性化合物,一般不被吸附或吸附不牢固.(2)不飽和烴分子中雙鍵越多或共軛鏈越長,其極性越強,被吸附力亦越強.(3)當形成分子內(nèi)氫鍵時,被吸附力減弱.(4)同系物中,分子量越大,極性越小,被吸附力越弱.(5)基本母核相同的化合物,分子中官能團極性越大或極性官能團越多,則分子的極性越大,被吸附力越強.常見官能團的極性由小到大的順序：烷烴<烯烴<醚類<硝基化合物<酯類<酮類<醛類<硫醇<胺類<醇類<酚類<羧酸類2024/4/818(1)吸附劑的活性與被分離組分極性的關(guān)系分離極性小的組分，選擇吸附性能大的吸附劑，以免組分流出太快，難以分離；分離極性大的組分，宜選用吸附性能小的吸附劑，以免吸附過牢，不易洗脫。2024/4/819(2)流動相的極性與被分離組分極性的關(guān)系分離極性較大的組分時，宜選擇極性大的溶劑作洗脫劑；而分離極性小的組分時，宜選擇極性較小的溶劑作洗脫劑.2024/4/820(五)選擇色譜分離條件的一般原則被分離組分的極性較小，應(yīng)選擇吸附活性較大的吸附劑和極性較小的洗脫劑.2024/4/821（六）操作方法1.裝柱2.加樣3.洗脫2024/4/822二、液－液分配柱色譜法（一）分離機理利用混合物中不同組分在兩相溶劑中溶解性不同(分配系數(shù)不同)，當流動相攜帶樣品流經(jīng)固定相時，各組分在兩相間不斷進行溶解、萃取，再溶解、再萃取。樣品在色譜柱內(nèi)經(jīng)過無數(shù)次分配之后，而使分配系數(shù)稍有差異的組分得到分離。正相色譜：流動相的極性比固定相的極性弱反相色譜：流動相的極性比固定相的極性強2024/4/823(二)固定相載體（擔(dān)體）載體的作用在分配色譜中，載體起著負載或支持固定液的作用對載體的要求：惰性、純凈、顆粒大小適宜；既能吸附固定液，又不吸附被分離的組分和流動相常用的載體：吸水硅膠、多孔硅藻土、纖維素粉、濾紙2024/4/824(二)固定相固定相是液體，涂布或吸附在載體表面。正相色譜中固定相主要有：水、稀酸、甲醇、甲酰胺等強極性溶劑；反相色譜中為石蠟油等非極性液體。2024/4/825（三）流動相對流動相的要求：流動相的極性與固定相的極性應(yīng)相差很大，才能互不相溶。柱色譜中的固定相的極性都較大，因而流動相應(yīng)選擇極性較小的溶劑常用的流動相：正相色譜中有石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷、苯或混合溶劑；反相色譜中有水、稀醇溶液等。2024/4/826(四)操作方法1.預(yù)處理將固定液與流動相混合，相互飽和，靜置后分離固定液涂布在載體上2.裝柱3.加樣4.洗脫2024/4/827三、離子交換色譜法分離原理：固定相：離子交換樹脂流動相：水、酸或堿溶液分離對象：離子型化合物利用離子交換劑與溶液中的離子發(fā)生交換作用而使離子分離的方法.當被分離的離子隨著流動相流經(jīng)色譜柱時，與離子交換樹脂上可被交換的離子連續(xù)進行競爭交換，由于不同離子與交換樹脂的競爭交換能力不同，因而在柱內(nèi)的移動速度也不同，交換能力弱的離子移動速度快，保留時間短，先流出色譜柱。2024/4/828（一）離子交換樹脂的分類離子交換樹脂是具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的復(fù)雜的有機高分子聚合物。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架部分一般很穩(wěn)定，不溶于酸、堿和一般溶劑。在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架上有許多可被交換的活性基團。根據(jù)活性基團的不同、離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂兩大類。2024/4/829（一）離子交換樹脂的分類1.陽離子交換樹脂陽離子交換樹脂具有酸性基團，如應(yīng)用最廣泛的強酸性磺酸型聚苯乙烯樹脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，經(jīng)濃硫酸磺化而制得的聚合物。這種樹脂的化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定，具有耐強酸、強堿、氧化劑和還原劑的性質(zhì)，因此應(yīng)用非常廣泛。2024/4/830各種陽離子交換樹脂含有不同的活性基團、常見的有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)和酚羥基(-OH)等。根據(jù)活性基團離解出H+能力的大小不同，陽離子交換樹脂分為強酸性和弱酸性兩種。例如含-SO3H的為強酸性陽離子交換樹脂，常用R-SO3H表示(R表示樹脂的骨架)，含-COOH和-OH的弱酸性陽離子交換樹脂，分別用R-COOH和R-OH表示。陽離子交換反應(yīng)-++--++-+-==+-ClHMSORClMHSOR332024/4/8312.陰離子交換樹脂所連的活性基團為堿性基團如含季胺(-N(CH3)3)的樹脂稱為強堿性陰離子交換樹脂，含伯胺基(-NH2)、仲胺基(-NHCH3)和叔胺基(-N(CH3)2)的樹脂為弱堿性陰離子交換樹脂。樹脂水化后分別形成R-NH3OH、R-NH2CH3OH、R-NH(CH3)2OH和R-N(CH3)3OH等氫氧型陰離子交換樹脂，所連的OH-可被陰離子交換和洗脫。陰離子交換反應(yīng)---+==+OHXOH)CH(RN33RN(CH3)3+X-+2024/4/832樹脂的再生

陽離子交換樹脂用HCl溶液處理

陰離子交換樹脂用NaOH溶液處理-++--++-+-==+-ClMHSORClHMSOR33-++==+OH)CH(RNNaOHX－)CH(RN3333+Na+X-2024/4/833(二）離子交換樹脂的性能1.交聯(lián)度交聯(lián)度：樹脂中交聯(lián)劑的含量。常以重量百分比表示交聯(lián)度對樹脂性質(zhì)的影響：（1）交聯(lián)度大，形成的樹脂結(jié)構(gòu)緊密，機械強度高；（2）交聯(lián)度大，孔徑就小，交換體積大的離子進入樹脂受阻，因而提高了交換的選擇性；（3）但交聯(lián)度過大，網(wǎng)眼過小，會使交換速度減慢，交換容量下降。陽離子交換樹脂交聯(lián)度8%，陰離子交換樹脂交聯(lián)度4%。2024/4/8342.交換容量理論上的交換容量是指每克干樹脂所含活性基團的物質(zhì)的量，而實際交換容量是指在實驗條件下，每克干樹脂能交換離子的物質(zhì)的量。單位：mmol/g顯然交換容量的大小取決于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)所含活性基團的數(shù)目。交換容量可通過實驗測得。樹脂的交換容量一般為1～10mmol/g交換容量反映了樹脂交換反應(yīng)的能力2024/4/835（三）離子交換柱色譜的操作方法1.樹脂的預(yù)處理目的（1）除去雜質(zhì)（2）進行轉(zhuǎn)型商品樹脂往往含有無機或有機雜質(zhì)，使用前必須用酸、堿處理以除去雜質(zhì)。處理方法：先將樹脂在水中浸泡使其充分膨脹。市售陽離子交換樹脂為Na型，一般用鹽酸浸泡以除去雜質(zhì)，然后用水洗至中性，這樣可使Na型轉(zhuǎn)化為H型。陰離子交換樹脂可用氫氧化鈉溶液浸泡沖洗轉(zhuǎn)變?yōu)镺H型。2.裝柱3.交換與洗脫2024/4/836（四）離子交換法的應(yīng)用1.純水的制備天然水中常含一些無機鹽類，為了除去這些無機鹽類以便將水凈化，可將水通過氫型強酸性陽離子交換樹脂，除去各種陽離子。如以CaCl2代表水中的雜質(zhì)，則交換反應(yīng)為：

2R-SO3H+Ca2+＝(R-SO3)2Ca+2H+再通過氫氧型強堿性陰離子交換樹脂，除去各種陰離子。

RN(CH3)3OH+C1-＝RN(CH3)3Cl+OH-交換下來的H+和OH-結(jié)合成H2O，這樣就可以得到相當純凈的所謂“去離子水”，可以代替蒸餾水使用。2024/4/837（四）離子交換法的應(yīng)用2.干擾離子的分離

(1)陰陽離子的分離在分析測定過程中，其他離子的存在常有干擾。對不同電荷的離子，用離子交換分離的方法排除干擾最為方便。例如用BaSO4重量沉淀法測定黃鐵礦中硫的含量時，由于大量Fe3+、Ca2+的存在，造成BaSO4沉淀的不純，因此可先將試液通過氫型強酸性陽離子交換樹脂除去干擾離子，然后再將流出液中的SO42-沉淀為BaSO4進行硫的測定，這樣便可以大大提高測定的準確度。2024/4/838（四）離子交換法的應(yīng)用(2)同性電荷離子的分離如果要使幾種陽離子或幾種陰離子分離開，可以根據(jù)各種離子對樹脂的親和力不同，將它們彼此分離。例如欲分離Li+、Na+、K+三種離子，將試液通過陽離子樹脂交換柱，則三種離子均被交換在樹脂上,然后用稀HCl洗脫，交換能力最小的Li+先流出柱外，其次是Na+而交換能力最大的K+最后流出來。2024/4/8393.微量組分的富集以測定礦石中的鉑、鈀為例來說明。由于鉑、鈀在礦石中的含量一般為10-5-10-6％，即使稱取10克試樣進行分析，也只含鉑、鈀0.1微克左右。因此，必須經(jīng)過富集之后才能進行測定。富集的方法是：稱取10-20克試樣，在700℃灼燒之后用王水溶解，加濃HCl蒸發(fā)，鉑、鈀形成PtCl62-和PdCl42-配陰離子。稀釋之后，通過強堿性陰離子交換，即可將鉑富集在交換柱上。用稀HCl將樹脂洗凈，取出樹脂移入瓷鉗鍋中，在700℃灰化，用王水溶解殘渣，加鹽酸蒸發(fā)。然后在8mol/LHCl介質(zhì)中，鈀(II)與雙十二烷基二硫代乙二酰胺(DDO)生成黃色配合物，用石油醚-三氯甲烷混合溶劑萃取，用比色法測定鈀。鉑(IV)用二氯化錫還原為鉑(II)，與DDO生成櫻紅色螯合物可進行比色法測定。2024/4/840四、凝膠柱色譜凝膠是一種由有機物制成的分子篩，為多孔性的化學(xué)惰性物質(zhì)。分離機理用凝膠作固定相，利用凝膠對分子大小不同的組分有著不同的阻滯作用(或滲透作用)來進行的分離分析方法。2024/4/841分離機理在洗脫過程中，各組分在柱中的保留時間取決于分子的大小。由于小分子可以完全滲透進入凝膠內(nèi)部孔穴中而被滯留，中等分子可以部分的進入較大的一些孔穴中，大分子則完全不能進入孔穴中，而只能沿凝膠顆粒之間的空隙隨流動相向下流動。樣品中各組分按大分子在前，中等分子在中，小分子在后的順序依次從色譜柱中流出，從而得到分離2024/4/842固定相和流動相固定相多孔凝膠：軟質(zhì)、半軟質(zhì)和硬質(zhì)流動相要求：能溶解試樣、潤濕凝膠，粘度要低水溶性試樣選擇水溶液為流動相(稱為凝膠過濾色譜）；非水溶性試樣選擇四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機溶劑為流動相(凝膠滲透色譜）。2024/4/843第三節(jié)平面色譜法一、薄層色譜法二、紙色譜法2024/4/844一、薄層色譜法

(thinlayerhromatography；TLC)薄層色譜法：將固定相涂布成一均勻薄層，在此薄層上進行分離樣品的方法。薄板：鋪好固定相的板稱為薄板。

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分類吸附薄層色譜法;分配薄層色譜法;離子交換薄層色譜法;凝膠薄層色譜法薄層色譜流動相的移動是依靠毛細作用。將試樣點在薄板的一端，并將該端浸在作為流動相的溶劑（展開劑）中，隨著溶劑向上的移動，經(jīng)過試樣點時，帶動試樣向上運動。（一）、基本原理2024/4/8461.分離原理（吸附薄層色譜法）固定相——吸附劑流動相——液體，又稱展開劑操作方式——薄層板上原理組分在薄層板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的過程。吸附系數(shù)不等產(chǎn)生差速遷移，K值大的組分隨展開劑移動速度慢，在后；K值小的組分隨展開劑移動速度快，在前。故薄層色譜又稱敞開的柱色譜2024/4/8472.比移值和相對比移值比移值Rf原點到溶劑前沿的距離原點到斑點中心的距離=fRcbR乙=caR)甲(f=2024/4/848比移值R意義：（1)可定性分析：條件一定時，Rf是一常數(shù)，結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)，性質(zhì)不同，其Rf值不同。（2)各組分的Rf值差越大，分離得越開。Rf與分配系數(shù)K的關(guān)系:K大，組分在固定相中濃度大，移動速度慢，Rf小。要求：各組分的Rf在0.2～0.8之間，兩種組分的Rf差值大于0.052024/4/849Rf的影響因素Rf的影響因素（1)吸附劑的吸附性能（2)展開劑的極性（3)薄層板中吸附劑的厚度（4)展開的時間（5)色譜缸中蒸氣的飽和程度

Rf的缺點：影響因素很多，很難得到重復(fù)的值2024/4/850相對比移值（Rs）Rf小于1，但Rs不一定Rs在0~∞之間若Rs=1，試樣與對照品一致原點到對照品斑點中心的距離原點到樣品組分斑點中心的距離=fRbaRs=2024/4/851(二)吸附劑的選擇與柱色譜中的吸附劑相似，只是顆粒更細。分離效率比柱色譜高常用的吸附劑有硅膠和氧化鋁，顆粒在200目(顆粒直徑在10～40μm)左右2024/4/852(三)展開劑的選擇薄層色譜中展開劑的選擇原則與柱色譜中的洗脫劑的選擇原則相似。在薄層分離中一般各斑點的在0.2～0.8之間，各組分值之間應(yīng)相差0.05以上，否則易造成斑點重疊。薄層色譜法中常用的溶劑，按極性由弱到強的順序石油醚＜環(huán)己烷＜二硫化碳＜四氯化碳＜三氯乙烷＜苯＜甲苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜乙醇＜甲醇＜吡啶＜水2024/4/853混合溶劑先用單一溶劑展開，若Rf值太小，則加入一定量極性強的溶劑，如乙醇、丙酮等，如果Rf值太大，則加入適量極性弱的溶劑(如環(huán)己烷、石油醚等)，以降低極性。還可加入一定比例的酸或堿,使斑點集中。若要改變比移值時，除了改變展開劑的極性外，還可通過改變吸附劑的活性來調(diào)節(jié)。2024/4/854(四)操作方法制板均勻點樣距底邊1.5～2cm處畫一條起始線,試樣點的直徑一般應(yīng)小于0.5mm展開(多種方式)預(yù)飽和顯色定性、定量分析2024/4/855展開展開的過程就是混合物分離的過程。展開方式(1)上行法；(2)近似水平法；(3)多次展開法(4)雙向展開法2024/4/856顯色（斑點定位）1.直接觀察:有色斑點2.有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點描繪出來。3.化學(xué)顯色:常用的方法有噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等2024/4/857通用型硫酸乙醇溶液:對大多數(shù)有機物能顯示出不同顏色碘:對許多有機物可顯色，如生物堿、氨基酸0.05%熒光黃甲醇溶液：對芳香族與雜環(huán)化合物顯色專屬型茚三酮是氨基酸專用顯色劑三氯化鐵－鐵氰化鉀是含酚羥基物質(zhì)的顯色劑溴甲酚綠是酸性化合物的顯色劑顯色劑類型顯色方式浸漬法:適用于軟板直接噴霧法:適用于硬板2024/4/858定性與定量分析定性比移值定量分析目視法斑點洗脫法薄層掃描法2024/4/859薄層色譜法的優(yōu)缺點優(yōu)點薄層色譜法簡單、方便、及操作費用低可以在一塊薄板上同時展開多個試樣。采用方形薄層板還可以方便的進行二維展開，即按一般方法展開后，改變方向和展開劑再次展開，進一步改善分離效果。試樣一般不需要經(jīng)過預(yù)處理即可分離。缺點分離效率較低，不適用揮發(fā)性試樣分離。2024/4/860（五）、應(yīng)用薄層色譜法在染料、農(nóng)藥、醫(yī)藥、有