目的基因?qū)胧荏w細胞及重組子的篩選

關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細胞及重組子的篩選第一節(jié)受體細胞受體細胞（receptorcell）：又稱宿主細胞或寄主細胞（hostcell），從實驗技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞；從實驗目的上講是有應用價值和理論研究價值的細胞。隨著基因工程的發(fā)展，從低等的原核細胞，到簡單的真核細胞，進一步到結(jié)構(gòu)復雜的高等動、植物細胞都可以作為基因工程的受體細胞。1.受體細胞的概念第2頁,共39頁，2024年2月25日，星期天2.受體細胞選擇所應遵循的原則便于重組DNA分子導入。能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細胞中。（如：限制性內(nèi)切酶缺陷型，避免其對重組DNA分子的降解破壞作用。）便于重組體的篩選。（選擇與載體所含的選擇標記相匹配的受體細胞基因型）遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)或發(fā)酵生長。安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。選用內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的細胞，利于外源基因蛋白表達產(chǎn)物在胞內(nèi)的積累，或促進外源基因的高效分泌表達。第3頁,共39頁，2024年2月25日，星期天受體細胞在遺傳密碼的應用上無明顯的偏倚性。具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機制，便于真核目的基因的高效表達。在理論研究和生產(chǎn)實踐上有較高的應用價值。第4頁,共39頁，2024年2月25日，星期天3.各種類型受體細胞的優(yōu)缺點（1）原核細胞■優(yōu)點大部分原核細胞沒有纖維素組成的堅硬細胞壁，便于外源DNA的進入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩?；蚪M簡單，不含線粒體和葉綠體基因組，便于對引入的外源基因進行遺傳分析。原核生物多數(shù)為單細胞生物，容易獲得一致性的的實驗材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實驗周期短，重復實驗快。第5頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■缺點由于原核細胞缺乏真核生物具有的RNA轉(zhuǎn)錄后加工、修飾系統(tǒng)、蛋白質(zhì)翻譯后加工、修飾、折疊復性系統(tǒng)，使某些真核細胞中編碼蛋白的基因不能夠在原核細胞中表達，甚至即使獲得了表達，也不具有正常的生物學活性?！龀Ｓ米魇荏w細胞的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍藻等。大腸桿菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)簡單。細胞膜間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導致人體熱原反映。目前已實現(xiàn)商品化的基因工程產(chǎn)品中，大部分是由大腸桿菌工程菌生產(chǎn)的?？莶輻U菌：基因背景清楚，繁殖迅速，培養(yǎng)簡單。能將基因第6頁,共39頁，2024年2月25日，星期天表達產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，具有芽孢行成能力，易于保存和培養(yǎng)。藍藻：是一種自養(yǎng)生物，培養(yǎng)簡便易行；可成為植物基因表達的宿主。（2）真菌細胞真菌是低等的真核生物，基因結(jié)構(gòu)簡單，基因表達調(diào)控機制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都有真核生物的特征，因此可用于表達真核生物的基因。常用的真菌細胞有酵母等。（3）植物細胞優(yōu)點：植物細胞具有全能性，一個細胞就能分化成一株完整的植株，這就意味著一個獲得外源基因的植物細胞就能培養(yǎng)成穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物。第7頁,共39頁，2024年2月25日，星期天缺點：具有堅硬的細胞壁，外源基因無法直接導入。方法：（a）經(jīng)纖維素酶處理去掉細胞壁后獲得原生質(zhì)體。（b）不必去掉細胞壁，采用農(nóng)桿菌介導或基因槍等。（4）動物細胞■優(yōu)點：動物細胞具有RNA的轉(zhuǎn)錄后的剪接、加工機制，蛋白質(zhì)翻譯后的加工、修飾機制，蛋白產(chǎn)物的生物學活性及免疫原性好。易被重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復性?？蓪⒈磉_產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于分離、純化?！鋈秉c：不能通過一個細胞的培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因動物。在獲得轉(zhuǎn)基因細胞后，需采用體細胞核移植技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因動物。第8頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)重組DNA分子導入受體細胞1.重組DNA分子導入原核細胞（1）重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌■轉(zhuǎn)化（transformation)：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱之為轉(zhuǎn)化。■轉(zhuǎn)化的方法制備感受態(tài)細胞法感受態(tài)細胞：處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。制備感受態(tài)大腸桿菌一般利用CaCl2處理。第9頁,共39頁，2024年2月25日，星期天電穿孔轉(zhuǎn)化法其基本原理是利用電穿孔儀的高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細胞膜上進行電穿孔，形成可逆的瞬間的通道，從而促進外源DNA的有效吸收。轉(zhuǎn)化效率受電場強度、脈沖時間和外源DNA濃度的影響。三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌原理：是基于可遷移質(zhì)粒的遷移作用（mobilization）而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式。首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細胞中，然后將這種供體細胞與受體細胞進行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導入受體細胞。整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3種有關(guān)的細菌菌株，即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，故稱三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。第10頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化率：DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)化子數(shù)/DNA分子數(shù)（10-5表示105個DNA分子獲得一個轉(zhuǎn)化子）或轉(zhuǎn)化子數(shù)/DNA質(zhì)量（106/μg表示1μgDNA分子得106個轉(zhuǎn)化子）輔助菌（含有結(jié)合型輔助質(zhì)粒）供體菌（含有目的質(zhì)粒）受體菌含有目的基因的非結(jié)合型重組質(zhì)粒遷移輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移第11頁,共39頁，2024年2月25日，星期天影響轉(zhuǎn)化率的因素a：重組DNA分子的大小、構(gòu)型、濃度、純度及載體與受體細胞的親和性。b：菌株類型c：轉(zhuǎn)化方法：電穿孔法最高，CaCl2誘導法居中，三親本雜交接合法最低。（2）重組λ嗜菌體DNA分子轉(zhuǎn)導大腸桿菌■轉(zhuǎn)染（transfection）及轉(zhuǎn)導（transduction）轉(zhuǎn)染：將重組λ噬菌體DNA分子直接導入受體細胞中的過程稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)導：通過λ噬菌體顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)的過程。第12頁,共39頁，2024年2月25日，星期天

采用λ噬菌體DNA直接轉(zhuǎn)染大腸桿菌的效率很低，所以需對重組的λ噬菌體DNA進行體外包裝后，再通過轉(zhuǎn)導的方法感染大腸桿菌?！鲶w外包裝體外包裝：在體外模擬λ噬菌體DNA分子在受體細胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝成成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。原理：根據(jù)λ噬菌體DNA分子體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失D包裝蛋白的λ噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的λ噬菌體突變株。由于兩種突變株均不具有完整的包裝蛋白，都不能單獨的包裝λ噬菌體DNA。但將兩種突變株分別感染大腸桿菌后，從中提取缺失D蛋白的包裝物（含E蛋白）和缺失E蛋白的包裝物（含D蛋白），兩者混合后就能包裝λ噬菌體DNA。第13頁,共39頁，2024年2月25日，星期天2.重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細胞由于真核生物的細胞結(jié)構(gòu)、基因組成和基因表達較為復雜，適用于原核生物的轉(zhuǎn)基因方法大多難以有效的用于真核生物。但近年來經(jīng)過摸索，建立了一系列適用于真核生物的轉(zhuǎn)基因方法，并用這些方法有效的獲得了轉(zhuǎn)基因真核生物。（1）重組DNA分子導入植物細胞■農(nóng)桿菌介導的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌能侵入植物傷口處細胞中，其所具有的內(nèi)源質(zhì)粒-Ti質(zhì)粒的T-DNA能轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)部。因此，將外源基因與Ti質(zhì)粒重組構(gòu)建載體，通過農(nóng)桿菌介導可將外源基因?qū)胫参锛毎?。?4頁,共39頁，2024年2月25日，星期天Fig.4-16T-DNAcanintegratedintothegenomeofplantcell第15頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■多聚物介導法一些多聚物（聚乙二醇、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等）和二價陽離子（Ca2+、Mg2+、Mn2+等）于DNA混合，能在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，通過原生質(zhì)體的內(nèi)吞噬作用而被吸收進入細胞內(nèi)?！鲭姶┛追ㄍ思毎碾姶┛追??！黾す馕⑹┛邹D(zhuǎn)化法利用直徑很小，能量很高的激光微束在細胞膜上造成可逆性微孔，處于細胞周圍的DNA分子隨之進入細胞?！龀暡ń閷мD(zhuǎn)化超聲波處理原生質(zhì)體，使其細胞膜上形成可逆性微孔，使外源DNA進入細胞。第16頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■基因槍法利用高速運行的金屬顆粒轟擊細胞時能進入細胞，將包裹在金屬顆粒表面的外源DNA分子隨之帶入細胞。第17頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■脂質(zhì)體介導法

脂質(zhì)體（liposome）是由人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜狀結(jié)構(gòu)，可以將DNA包在其中，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源DNA轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)?！鲲@微注射法

顯微注射法是一種利用顯微操作儀，通過機械的方法把外源DNA直接注入細胞質(zhì)或細胞核的基因轉(zhuǎn)移方法。早期該技術(shù)主要用于動物細胞的基因轉(zhuǎn)化等方面，現(xiàn)在逐步應用到植物細胞的轉(zhuǎn)化操作中，成為一種重要的植物轉(zhuǎn)基因手段。■花粉管通道法此法是將外源DNA涂于授粉的枝頭上，使DNA沿花粉管通道或傳遞組織通過珠心進入胚囊，轉(zhuǎn)化還不具正常細胞壁的卵、合子及早期的胚胎細胞。第18頁,共39頁，2024年2月25日，星期天3.重組DNA分子導入哺乳動物細胞

哺乳動物的細胞很難捕獲外源DNA，這明顯影響了哺乳動物基因工程的發(fā)展。近年來通過探索已建立了幾種能有效地將外源DNA導入哺乳動物細胞的方法。■病毒顆粒轉(zhuǎn)導法■磷酸鈣轉(zhuǎn)染法哺乳動物的細胞能捕獲黏附在細胞表面的DNA-磷酸鈣沉淀物，使DNA轉(zhuǎn)入細胞。■DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法二乙胺乙基葡聚糖是一種高分子質(zhì)量的多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞捕獲外源DNA，實現(xiàn)短時間的有效表達。第19頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■聚陽離子-DMSO轉(zhuǎn)染法此方法采用聚陽離子poly-brene處理哺乳動物細胞，增加細胞表面對DNA的吸附能力，然后再用25%-30%DMSO短暫處理細胞，增加膜的通透性，提高對DNA的捕獲量。■顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)■電穿孔DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)■脂質(zhì)體介導法第20頁,共39頁，2024年2月25日，星期天活化菌種，擴大培養(yǎng)，使其處于對數(shù)生長后期（OD600=0.4）3-4ml菌液冰水浴中10分鐘，4℃離心集菌菌體懸浮于含CaCl2的預冷緩沖液中，冰水浴15min，4℃離心集菌，棄上清，沉淀物重懸于CaCl2的預冷緩沖液中，4℃下放置12-14h0.2ml新制備好的感受細胞中加入緩沖液溶解的重組DNA，置于冰水浴中1h以上，期間輕搖幾次轉(zhuǎn)入42℃水浴上2min，使感受態(tài)細胞吸收重組DNA。轉(zhuǎn)入37℃水浴上5min，加入1ml不含選擇性藥物的LB培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子37℃震蕩培養(yǎng)30-60min鋪板培養(yǎng)圖6.1感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化第21頁,共39頁，2024年2月25日，星期天圖6.2電穿孔儀及電擊杯第22頁,共39頁，2024年2月25日，星期天圖6.2λ噬菌體的體外包裝第23頁,共39頁，2024年2月25日，星期天圖6.3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法第24頁,共39頁，2024年2月25日，星期天1、傳代細胞準備：細胞在轉(zhuǎn)染前24ｈ傳代,待細胞密度達50%～60%滿底時即可進行轉(zhuǎn)染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。2、DNA沉淀液的準備：首先將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于5μL無菌水中，加50μL2.5mol/LCaCl2。3、用巴斯德吸管在500μL

2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個過程需緩慢進行，至少需持續(xù)1～2min。4、室溫靜置30min,出現(xiàn)細小顆粒沉淀。5、將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動。6、在標準生長條件下培養(yǎng)細胞4～16h。除去培養(yǎng)液，用5ml

1×HeBS洗細胞2次，加入10ml完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。7收集細胞或分入培養(yǎng)皿中選擇培養(yǎng)。第25頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共39頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)重組子的篩選

在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導過程中，并非所有的受體細胞都能被導入重組DNA分子，一般僅有少數(shù)重組DNA分子能進入受體細胞。再者，在這些被轉(zhuǎn)化的受體細胞中，除部分含有我們期待的DNA分子外，另外一些還可能是由于載體自身或一個載體與多個外源DNA片段形成的非期待重組DNA分子導入所致。因此，需要采取必要的方法將重組子從大量的受體細胞中篩選出來。■轉(zhuǎn)化子：導入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細胞稱為轉(zhuǎn)化子?！鲋亟M子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子稱為重組子。第27頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■陽性克隆子（期望重組子）：含有外源目的基因的重組子稱為陽性克隆子或期望重組子?！龊Y選（選擇）：經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導入受體細胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選或選擇。1.遺傳表型直接篩選法

在構(gòu)建基因工程載體時，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標記基因，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞后可以使后者呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學特征，據(jù)此可進行轉(zhuǎn)化子或重組子的初步篩選。一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的菌液（包括對照處理）適量涂布在選擇培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一段時間，觀察菌落生長情況，即可挑選出轉(zhuǎn)化子。第28頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■抗藥性篩選氨芐青霉素（Amp）、氯霉素（Cmp）、卡那霉素（Kan）、四環(huán)素（Tet）、鏈霉素（Str）主要用于重組質(zhì)粒DNA分子的轉(zhuǎn)化子的篩選。在含相應抗生素的培養(yǎng)基上，含重組質(zhì)粒的受體菌能存活，不含重組質(zhì)粒的受體菌不能存活。■插入失活篩選法外源DNA的插入特定載體后導致遺傳標記基因失活，借此篩選重組子?！霾迦氡磉_篩選法與插入失活策略向相反，插入表達法是利用外源DNA插入特定載體后導致遺傳標記基因表達，借此篩選重組子。第29頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■顯色互補篩選法

LacZ’基因的藍白斑篩選■形成嗜菌斑篩選法對于λDNA載體系統(tǒng)，只有在外源DNA插入載體后，重組的λDNA分子大小在野生型λDNA分子的78%-105%范圍內(nèi)時，才能在體外包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒。后者在轉(zhuǎn)導受體菌后，轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)基上被裂解形成嗜菌斑，而非轉(zhuǎn)化子能正常生長，兩者很容易區(qū)分。2.DNA電泳檢測法■直接電泳檢測法重組的質(zhì)粒DNA分子由于有外源DNA的插入，比未插入外源DNA的質(zhì)粒載體大，通過凝膠電泳就可將重組子篩選出來。第30頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■酶切電泳篩選法通過直接電泳檢測法篩選出來的重組子，插入的外源DNA不一定是目的DNA片段。通過將重組子中的質(zhì)粒進行酶切，然后再進行電泳，就可將陽性克隆子篩選出來?！鯬CR檢測法外源DNA的兩側(cè)序列多為已知序列，通過PCR擴增外源DNA，然后對擴增產(chǎn)物進行電泳，就可篩選出陽性克隆子。3.核酸分子雜交檢測法4.免疫化學檢測法

基本過程與核酸分子雜交檢測法相似，不同的是該法使用抗體探針，而非DNA探針來鑒定目的基因表達產(chǎn)物。因而其前提第31頁,共39頁，2024年2月25日，星期天條件是克隆基因可在宿主細胞內(nèi)表達，并且有目的蛋白的抗體。■放射性抗體檢測法■免疫沉淀檢測法■酶聯(lián)免疫檢測法（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）采用非放射性標記物（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）偶合第二抗體，然后與目的蛋白抗原-抗體復合物結(jié)合，通過檢測非放射性標記物從而檢測到相應的蛋白抗原。5.轉(zhuǎn)譯篩選法

轉(zhuǎn)譯篩選法是通過體外轉(zhuǎn)譯的手段鑒定陽性克隆的方法，可分為雜交抑制轉(zhuǎn)譯和雜交選擇轉(zhuǎn)譯兩種檢測方法。第32頁,共39頁，2024年2月25日，星期天■雜交抑制轉(zhuǎn)譯要求：被研究的目的基因編碼有豐富的mRNA。原理：DNA蛋白質(zhì)mRNA蛋白質(zhì)×雜交轉(zhuǎn)化菌落提取重組DNA與總mRNA雜交形成DNA-RNA雜種分子將總mRNA（包