第十章 微生物分離純化與菌種保藏技術(shù)

第十章微生物分離純化與菌種保藏技術(shù)第十章微生物分離純化與菌種保藏技術(shù)了解微生物分離純化及微生物純培養(yǎng)原理與方法理解并熟悉微生物分離純化常用方法了解菌種退化的原因與影響因素能開(kāi)展菌種復(fù)壯不同方法的操作理解微生物菌種保藏的原理及方法，能進(jìn)行多種方法的菌種保藏學(xué)習(xí)目標(biāo)第十章微生物分離純化與菌種保藏技術(shù)微生物菌種分離純化與保存菌種的衰退與復(fù)壯菌株的保存和使用

授課內(nèi)容授課內(nèi)容第一節(jié)微生物菌種分離純化與保存微生物分離與純化概念微生物分離與純化技術(shù)菌種保存方法簡(jiǎn)介微生物菌種的分離與純化 為了研究某微生物的特性，或者要大量地培養(yǎng)和利用某微生物，需要從自然界混雜的微生物群中分離單一的菌種，這種獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱(chēng)為微生物菌種的分離與純化。一、微生物菌種的分離與純化概述第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存自然界中，微生物都是以群居的方式存在的。在人為條件下培養(yǎng)的微生物群體稱(chēng)為培養(yǎng)物(culture)只有一種微生物的培養(yǎng)物稱(chēng)作純培養(yǎng)物(pureculture)第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存固體培養(yǎng)基單個(gè)微生物只在固體培養(yǎng)基上形成菌落.菌落是在固體培養(yǎng)基上（內(nèi)）以微生物母細(xì)胞為中心的一團(tuán)肉眼可見(jiàn)的、有一定形態(tài)、構(gòu)造等特征的子細(xì)胞的集團(tuán)。一個(gè)菌落是一個(gè)純種，也是一個(gè)純培養(yǎng)； 菌落形態(tài)

包括菌落的大小、形狀、邊緣、光澤、質(zhì)地、顏色和透明程度等

鑒定菌種的重要依據(jù)同一細(xì)菌在不同的培養(yǎng)平板上形成不同的特征菌落第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存顯微鏡下的菌落第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存液體培養(yǎng)基

變渾濁（某些菌培養(yǎng)后液面有菌膜，或有皺醭） 不會(huì)形成菌落出發(fā)菌株的確定采樣富集培養(yǎng)分離純化菌種鑒定性能確定毒性測(cè)試第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存二、微生物菌種的分離與純化技術(shù)菌株保存微生物菌種篩選純化流程（一)菌株的篩選途徑向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株向自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體等，從中分離篩選從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存從土壤中采樣根據(jù)土壤特點(diǎn)采樣根據(jù)微生物營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)采樣特殊環(huán)境下采樣局部環(huán)境的影響極端環(huán)境條件的影響（二)含微生物樣品的富集培養(yǎng)第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存

富集培養(yǎng)就是給混合菌群提供一些有利于所需菌株生長(zhǎng)或不利于其他菌型生長(zhǎng)的條件，以促使目標(biāo)菌株大量繁殖，從而有利于分離它們。控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分（唯一碳源或氮源）控制培養(yǎng)條件（pH、溫度及通氣量等）極端環(huán)境條件的影響（高溫、高壓、加入抗生素等）富集培養(yǎng)選擇培養(yǎng)基分離目的菌驗(yàn)證例一：從土壤中分離能產(chǎn)生?－半乳糖苷酶的微生物第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存例二：分離篩選產(chǎn)高溫淀粉酶（65℃）細(xì)菌單細(xì)胞選擇培養(yǎng)基平板（淀粉為唯一C源）65℃培養(yǎng)淀粉水解透明圈目的菌菌落營(yíng)養(yǎng)選擇因子：淀粉環(huán)境選擇因子：65℃高溫第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存（三)微生物的分離純化技術(shù)第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存用固體培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)傾注平板法涂布平板法平板劃線(xiàn)法稀釋搖管法用液體培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)單孢子分離選擇培養(yǎng)分離1、用固體培養(yǎng)基分離純種微生物樣品多種混雜某種方法分散成單個(gè)微生物平板培養(yǎng)單菌落每個(gè)菌落為純種（純培養(yǎng)）單菌落轉(zhuǎn)接培養(yǎng)純種（純培養(yǎng)）第一節(jié)微生物的分離與純化原理圖解（2）涂布平板法（1）傾注平板法涂布傾注梯度稀釋過(guò)程10-110-210-310-410-510-6第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存傾注平板平板涂布

操作示意圖操作要點(diǎn)：1、梯度稀釋度的確定：取決于需分離微生物在樣品中的數(shù)量2、選擇菌落接種的依據(jù)：a、菌落特征；b、菌體的特征3、微生物純培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)：菌落特征一致性4、注意無(wú)菌操作（2）平板劃線(xiàn)法平板劃線(xiàn)分離的方法1.斜線(xiàn)法2.曲線(xiàn)法3.方格法4.放射法5.四格法用接種環(huán)沾少許待分離的材料，在培養(yǎng)基表面進(jìn)行多次平行劃線(xiàn)，使微生物細(xì)胞分開(kāi)生長(zhǎng)以獲得微生物純培養(yǎng)的過(guò)程。第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存分區(qū)劃線(xiàn)法適用于濃度較大的樣品1234第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存平板分區(qū)劃線(xiàn)法連續(xù)劃線(xiàn)法適用于濃度較小的樣品平板連續(xù)劃線(xiàn)法第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存（3）稀釋搖管法第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存稀釋搖管法：是對(duì)氧氣特別敏感的厭氧菌的一種純培養(yǎng)方法。操作：先將一系列盛無(wú)菌瓊脂培養(yǎng)基的試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并保持在50℃左右然后將待分離材料用這些試管進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)嚬苎杆贀u動(dòng)均勻，冷凝后，在瓊脂柱表面倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟混合物，將培養(yǎng)基和空氣隔開(kāi)。（3）稀釋搖管法

第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存培養(yǎng)后，菌落形成在瓊脂柱的中間。2、用液體培養(yǎng)基分離純種適用范圍個(gè)別細(xì)胞較大的細(xì)菌原生動(dòng)物、藻類(lèi)如何分離純培養(yǎng)？——接種物液體培養(yǎng)基順序稀釋法分離營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板不能長(zhǎng)菌落第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存培養(yǎng)物在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行高度順序稀釋?zhuān)绻?jīng)稀釋后的同一稀釋度的大多數(shù)（95%以上）試管中沒(méi)有微生物生長(zhǎng)，有微生物生長(zhǎng)的試管得到的培養(yǎng)物可能就是純培養(yǎng)物。接種物液體培養(yǎng)基順序稀釋法分離第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存3、單細(xì)胞（單孢子）分離定義：采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)個(gè)體進(jìn)行培養(yǎng)以得到純培養(yǎng)。操作特點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上不能形成菌落分離難度與細(xì)胞或個(gè)體的大小成反比個(gè)體較小的微生物需采用顯微操作儀較大的微生物可使用毛細(xì)管提取第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存4、選擇培養(yǎng)分離第一節(jié)微生物的分離與純化特點(diǎn)：創(chuàng)造適于目的微生物生長(zhǎng)條件促使目的微生物快速生長(zhǎng)呈優(yōu)勢(shì)菌抑制非目的微生物生長(zhǎng)從混雜微生物中分離目的微生物操作方案：利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離富集培養(yǎng)法二元培養(yǎng)物（1）利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離選擇培養(yǎng)基:只允許特定微生物生長(zhǎng)，而同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基土壤目的菌優(yōu)勢(shì)非目的菌選擇培養(yǎng)基直接分離選擇培養(yǎng)基平板（含牛奶或酪蛋白唯一C、N源）37℃培養(yǎng)菌落周?chē)型该鞯鞍姿馊渭?xì)胞目的菌落例：分離篩選蛋白酶產(chǎn)生細(xì)菌第一節(jié)微生物的分離與純化含牛奶選擇培養(yǎng)基目的菌生長(zhǎng)平板營(yíng)養(yǎng)選擇因子：牛奶或酪蛋白只允許分解利用蛋白質(zhì)的目的菌生長(zhǎng)，淘汰非目的菌長(zhǎng)出的目的菌并不一定是同種細(xì)菌，但皆產(chǎn)蛋白酶。（1）利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離例：分離篩選蛋白酶產(chǎn)生細(xì)菌第一節(jié)微生物的分離與純化。（2）富集培養(yǎng)法人為創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長(zhǎng)，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長(zhǎng)能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他微生物只允許特定微生物生長(zhǎng)，而同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基富集培養(yǎng)是分離微生物菌種最強(qiáng)有力的技術(shù)之一營(yíng)養(yǎng)選擇因子和生理?xiàng)l件選擇因子可無(wú)窮盡組合，可從自然界選擇分離各類(lèi)特異微生物第一節(jié)微生物的分離與純化（3）二元培養(yǎng)物如果培養(yǎng)物中只含有兩種微生物，而且是有意識(shí)的保持兩者之間的特定關(guān)系的培養(yǎng)物稱(chēng)為二元培養(yǎng)物。病毒和宿主細(xì)胞纖毛蟲(chóng)、變形蟲(chóng)和粘細(xì)菌第一節(jié)微生物的分離與純化微生物純培養(yǎng)分離方法的比較方法應(yīng)用范圍稀釋倒平板法

涂布平板法平板劃線(xiàn)法稀釋搖管法液體稀釋法單細(xì)胞分離法選擇培養(yǎng)分離即可定性,又可定量,用途廣泛用得最多方法簡(jiǎn)便,多用于分離細(xì)菌主要分離嚴(yán)格厭氧菌適用于培養(yǎng)細(xì)胞較大的微生物局限于高等專(zhuān)業(yè)化的科學(xué)研究適用于分離某些生理類(lèi)型較特殊的微生物第一節(jié)微生物的分離與純化生化特性（免疫學(xué)特性）生產(chǎn)性能測(cè)定毒性試驗(yàn)據(jù)有的國(guó)家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無(wú)須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過(guò)兩年以上的毒性試驗(yàn)（四)微生物性能測(cè)定第一節(jié)微生物的分離與純化（五)菌株的保存第一節(jié)微生物菌種的分離純化與保存要求：在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死亡、不變異、不受污染。原理：人為地創(chuàng)造有利于微生物長(zhǎng)期休眠的條件，主要是低溫、干燥、缺氧。方法：生活態(tài)休眠態(tài)培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)寄主傳代培養(yǎng)冷凍干燥斜面、平板液氮低溫冰箱、真空冷凍干燥法等液氮超低溫保藏法保藏時(shí)間達(dá)2-15年適用于各種微生物菌種的保藏設(shè)備和操作費(fèi)用要求高液氮超低溫冰箱砂土管保藏法1.適用于保藏能產(chǎn)生孢子的微生物2.保藏時(shí)間因菌種而異3.對(duì)干燥敏感的細(xì)菌、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，不宜選擇此法保藏第一節(jié)微生物的分離與純化（五)菌株的保存斜面低溫保藏法方法簡(jiǎn)單、便于操作菌種易變異、退化及污染保藏時(shí)間一般為1-6個(gè)月液體石蠟覆蓋保藏法適用于酵母、霉菌和好氧性細(xì)菌的保藏皰肉培養(yǎng)基可用此法保存厭氧菌保存時(shí)間可達(dá)1年以上方法簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求不高第一節(jié)微生物的分離與純化（五)菌株的保存真空冷凍干燥保藏法將菌種在極低溫度下快速冷凍，然后在低溫下真空干燥、封裝，隔絕空氣，使菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分保持原來(lái)狀態(tài)，達(dá)到長(zhǎng)期保藏的目的。適用于各類(lèi)微生物時(shí)間長(zhǎng)達(dá)10年以上第一節(jié)微生物的分離與純化（五)菌株的保存冷凍干燥機(jī)授課內(nèi)容第二節(jié)菌種的衰退與復(fù)壯菌種的衰退菌種的復(fù)壯菌種衰退（degeneration）：是指菌種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期人工培養(yǎng)或保藏，由于自發(fā)突變的作用而引起某些優(yōu)良特性變?nèi)趸蛳У默F(xiàn)象。一、菌種衰退第二節(jié)菌種的衰退與復(fù)壯性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無(wú)法正常進(jìn)行。c）死亡.（一）菌種衰退的具體表現(xiàn)第二節(jié)菌種的衰退與復(fù)壯原有形態(tài)形狀變得不典型；生長(zhǎng)速度變慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越??；代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降，即出現(xiàn)負(fù)突變；致病菌對(duì)宿主侵襲力下降；對(duì)外界不良環(huán)境（包括低溫、高溫或噬菌體侵染等）的抵抗力下降?？傊嘶前l(fā)生在群體細(xì)胞中的一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程，由于個(gè)別突變細(xì)胞表現(xiàn)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致在群體中最后數(shù)量占優(yōu)勢(shì)第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯（二）菌種衰退的原因1、基因突變有關(guān)基因發(fā)生負(fù)突變導(dǎo)致菌種衰退

菌種衰退的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變表型延遲造成菌種衰退

如：在誘變育種過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)某菌株初篩時(shí)產(chǎn)量較高，進(jìn)行復(fù)篩時(shí)產(chǎn)量卻下降了質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退

質(zhì)粒脫落導(dǎo)致菌種衰退的情況在抗生素生產(chǎn)中較多，不少抗生素的合成是受質(zhì)粒控制的第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯（二）菌種衰退的原因2、連續(xù)傳代

這是加速菌種衰退的一個(gè)重要原因。一方面，傳代次數(shù)越多，發(fā)生自發(fā)突變（尤其是負(fù)突變）的幾率越高另一方面，傳代次數(shù)越多，群體中個(gè)別的衰退型細(xì)胞數(shù)量增加并占據(jù)優(yōu)勢(shì)越快，致使群體表型出現(xiàn)衰退。第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯（二）菌種衰退的原因3、不適宜的培養(yǎng)和保藏條件

這是加速菌種衰退的另一個(gè)重要原因。不良的培養(yǎng)條件（營(yíng)養(yǎng)成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等）不良的保藏條件（營(yíng)養(yǎng)、含水量、溫度、氧氣等）不僅會(huì)誘發(fā)衰退型細(xì)胞的出現(xiàn)，還會(huì)促進(jìn)衰退細(xì)胞迅速繁殖，在數(shù)量上大大超過(guò)正常細(xì)胞，造成菌種衰退1、控制傳代次數(shù)即盡量避免不必要的移種和傳代，將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的機(jī)率第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯（三）菌種衰退的防治2、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性菌株在保藏培養(yǎng)基中應(yīng)添加相應(yīng)藥物，及時(shí)淘汰回復(fù)突變細(xì)胞基因工程菌添加抗生素于培養(yǎng)基中防止質(zhì)粒的丟失培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株時(shí)應(yīng)保證適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)成分，尤其是生長(zhǎng)因子控制好碳源、氮源等培養(yǎng)基成分和pH、溫度等培養(yǎng)條件，使之有利于正常菌株生長(zhǎng)，限制退化菌株的數(shù)量，防止衰退。第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯（三）菌種衰退的防治3、利用不易衰退的細(xì)胞移種傳代在放線(xiàn)菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含幾個(gè)細(xì)胞核，甚至是異核體，因此用菌絲接種就會(huì)出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時(shí)，就不會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象另外，有些霉菌（如構(gòu)巢曲霉）若用其分生孢子傳代就易衰退，而改用子囊孢子移種則能避免衰退。第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯（三）菌種衰退的防治4、采用有效的菌種保藏方法有效的菌種保藏方法是防止菌種衰退極其必要的措施。 在實(shí)踐中，應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性的選擇菌種保藏的方法 例如，釀酒酵母，保持其優(yōu)良發(fā)酵性能最有效的保藏方法是－70℃低溫保藏，其次是4℃低溫保藏，而冷凍干燥保藏法和液氮保藏法并不理想短期保藏——一般斜面冰箱保藏法長(zhǎng)期保藏——砂土保藏法、冷凍干燥保藏法及液氮保藏法等方法對(duì)于比較重要的菌種，盡可能采用多種保藏方法（長(zhǎng)期/短期）。第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯（三）菌種衰退的防治6、講究菌種選育技術(shù)在菌種選育時(shí)，應(yīng)盡量使用單核細(xì)胞或孢子，并采用較高劑量使單鏈突變而使另一單鏈喪失作為模板的能力,避免表型延遲現(xiàn)象。同時(shí)，在誘變處理后應(yīng)進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證菌種的純度。第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯（三）菌種衰退的防治5、定期進(jìn)行分離純化定期進(jìn)行分離純化，對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢查，也是有效防止菌種衰退的方法。第二節(jié)菌種的衰退和復(fù)壯狹義的復(fù)壯：菌種已經(jīng)發(fā)生衰退后，再通過(guò)純種分離和性能的測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出尚未衰退的少數(shù)個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌種原有典型性狀的一種措施廣義的復(fù)壯：一種積極的措施，即在菌種的生產(chǎn)性能尚未衰退前經(jīng)常有意識(shí)地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測(cè)定工作，使菌種地生產(chǎn)性能逐步提高二、菌種的復(fù)壯復(fù)壯措施方法純種分離法