植物組織培養(yǎng)

關于植物組織培養(yǎng)一、實驗室設置及儀器設備實驗室是進行組培研究的主要場所，應能滿足清洗、培養(yǎng)基制備、儲藏、無菌操作、培養(yǎng)、鑒定等多方面的工作。（一）實驗室設置組織培養(yǎng)實驗室設置的總體要求：便于隔離便于操作便于滅菌便于觀察第2頁,共107頁，2024年2月25日，星期天基本實驗室輔助實驗室實驗室組成準備室緩沖室無菌操作室培養(yǎng)室細胞生物學實驗室溫室生化分析實驗室第3頁,共107頁，2024年2月25日，星期天1、基本實驗室實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室基本實驗室布局平面圖第4頁,共107頁，2024年2月25日，星期天組織培養(yǎng)準備實驗室第5頁,共107頁，2024年2月25日，星期天緩沖室第6頁,共107頁，2024年2月25日，星期天無菌室（一）第7頁,共107頁，2024年2月25日，星期天無菌室（二）第8頁,共107頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)室第9頁,共107頁，2024年2月25日，星期天2、輔助實驗室

（1）細胞生物學實驗室

其功能是對培養(yǎng)材料進行細胞學鑒定和研究。要求清潔、明亮、干燥，使各種光學儀器不受潮濕和灰塵污染。應配置各種顯微鏡、照相系統(tǒng)等。

（2）生化分析室在以培養(yǎng)細胞產(chǎn)物為主要目的的實驗室，應建立相應的分析化驗實驗室，以便對培養(yǎng)物的有效成分隨時進行取樣檢查。離心機、酶聯(lián)免疫檢測儀、天平、PCR儀等。第10頁,共107頁，2024年2月25日，星期天為試管苗提供滿足生長的適宜環(huán)境條件。（3）溫室第11頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（二）儀器與設備1、基本設備

冰箱

電爐

酸度計

純水器

天平

培養(yǎng)基分裝器

攪拌器等第12頁,共107頁，2024年2月25日，星期天冰箱酸度計電爐第13頁,共107頁，2024年2月25日，星期天天平純水器第14頁,共107頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基分裝器攪拌器第15頁,共107頁，2024年2月25日，星期天2、滅菌設備

蒸汽壓力滅菌鍋

干熱消毒柜

過濾滅菌裝置

噴霧消毒器

紫外燈第16頁,共107頁，2024年2月25日，星期天蒸汽壓力滅菌鍋第17頁,共107頁，2024年2月25日，星期天干熱消毒柜第18頁,共107頁，2024年2月25日，星期天無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器（參考圖）（參考圖）第19頁,共107頁，2024年2月25日，星期天3、無菌操作設備

超凈工作臺第20頁,共107頁，2024年2月25日，星期天無菌接種箱第21頁,共107頁，2024年2月25日，星期天4、細胞培養(yǎng)設備

搖床第22頁,共107頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)架第23頁,共107頁，2024年2月25日，星期天HZC-250恒溫振蕩培養(yǎng)箱

150C

250D

光照培養(yǎng)箱

第24頁,共107頁，2024年2月25日，星期天5、細胞學鑒定設備倒置顯微鏡光學顯微鏡第25頁,共107頁，2024年2月25日，星期天1、玻璃器皿（三）培養(yǎng)器皿及實驗用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶第26頁,共107頁，2024年2月25日，星期天2、金屬材質(zhì)用具鑷子解剖刀接種針第27頁,共107頁，2024年2月25日，星期天1、洗滌液的配制二、實驗基本操作技術（一）洗滌技術第28頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（1）玻璃器皿洗滌

A、新購買的玻璃器皿

表面常附著有游離的堿性物質(zhì)，可先用0.5％的去污劑洗刷，再用自來水洗凈，然后浸泡在1％～2％鹽酸溶液中過夜（不可少于四小時），再用自來水沖洗，最后用無離子水沖洗兩次，在100℃～120℃烘箱內(nèi)烘干備用。2、洗滌方法第29頁,共107頁，2024年2月25日，星期天先用自來水洗刷至無污物，再用合適的毛刷沾去污劑（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗劑中超聲清洗（比色皿決不可超聲），然后用自來水徹底洗凈去污劑，用無離子水洗兩次，烘干備用（計量儀器不可烘干）。清洗后器皿內(nèi)外不可掛有水珠，否則重洗，若重洗后仍掛有水珠，則需用洗液浸泡數(shù)小時后（或用去污粉擦洗），重新清洗。

B、使用過的玻璃器皿的清洗第30頁,共107頁，2024年2月25日，星期天新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗烘干備用已用過的玻璃器皿第31頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（2）塑料器皿的清洗新的塑料器皿打開即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%—5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用第32頁,共107頁，2024年2月25日，星期天

金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌（新的可以用熱洗衣粉水洗凈），需要清洗時，一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。

（3）金屬用品洗滌（4）除菌過濾器洗滌

用清水沖洗后，用洗液沖洗，再用清水沖洗，最后用蒸餾水沖洗，晾干備用。第33頁,共107頁，2024年2月25日，星期天

（二）滅菌技術1、滅菌的方法（具體參見第二章）干熱滅菌玻璃器皿、金屬器械濕熱滅菌培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌培養(yǎng)材料燒灼滅菌器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌

接種室、培養(yǎng)間第34頁,共107頁，2024年2月25日，星期天**外植體滅菌流水沖洗10—20min或更長時間70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗4—5次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用第35頁,共107頁，2024年2月25日，星期天人為因素（工作人員本身）：工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿玻璃器皿接種用具培養(yǎng)基：濕熱培養(yǎng)材料外部細菌：用水沖洗→化學藥劑處理內(nèi)部細菌莖尖培養(yǎng)加抗生素：青霉素、利福平操作的空氣：洗刷地板、95%酒精擦超凈工作臺用化學試劑薰蒸污染來源（三）無菌操作技術第36頁,共107頁，2024年2月25日，星期天1、實驗器具和材料的準備

2、用75%的酒精擦拭超凈工作臺，然后室內(nèi)及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30min。注意：臺面上的用品不要放置太多或重疊放置，以免降低滅菌效果。

3、關紫外燈、打開風機，過5-10min進入緩沖間，以75%洗手和手臂，更換無菌服、帽子和口罩。進入接種室。（注：沒有特別情況，盡量不要下工作臺）

第37頁,共107頁，2024年2月25日，星期天4、用70－75％的酒精拭擦臺面并消毒雙手。試驗用具也應該用酒精消毒。點燃酒精燈，將金屬器械在其火焰上灼燒，冷卻待用。

注意：所有操作應在火焰近處并經(jīng)過灼燒進行。金屬器械不能過度灼燒，以防退火。移液管不能灼燒，培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時間太長。第38頁,共107頁，2024年2月25日，星期天5、取流水沖洗（至少30min）過的外植體，用一定的消毒劑浸泡消毒，用無菌水沖洗3~4次，放入無菌培養(yǎng)皿中，置于酒精燈火焰下方，用無菌的接種器械進行分離、切割或其他處理。第39頁,共107頁，2024年2月25日，星期天6、打開培養(yǎng)瓶，瓶口在燈焰處旋轉灼燒，用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上，灼燒鑷子放回，灼燒瓶口，蓋上瓶塞。

7、用酒精擦洗工作臺和手。進行下一輪操作。第40頁,共107頁，2024年2月25日，星期天接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中。正

確

錯

誤第41頁,共107頁，2024年2月25日，星期天整個接種操作應在近火焰處進行，且動作要迅速。正

確

錯

誤第42頁,共107頁，2024年2月25日，星期天接種過程中盡可能達到懸空要求正

確

錯

誤第43頁,共107頁，2024年2月25日，星期天接種時不得用手接觸瓶蓋內(nèi)壁或瓶口正

確

錯

誤第44頁,共107頁，2024年2月25日，星期天瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

確

錯

誤第45頁,共107頁，2024年2月25日，星期天接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產(chǎn)生

第46頁,共107頁，2024年2月25日，星期天接種莖段：注意形態(tài)學下端插入培養(yǎng)基內(nèi)，而形態(tài)學上端露于空氣中正

確

錯

誤第47頁,共107頁，2024年2月25日，星期天用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來源：一是生長在自然環(huán)境下的植物；二是在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物；三是無菌環(huán)境下已經(jīng)過離體培養(yǎng)的植物。（四）外植體的選擇與處理技術第48頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（1）選擇優(yōu)良的基因型

試驗首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應選擇當?shù)卦耘啻_認的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料，并且品種一定要可靠。花卉、觀賞植物的快繁，也應選擇有價值的植物。

（2）取材

從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。母株代謝旺盛期切取的外植體再生能力強，試驗容易成功。1、外植體的選擇第49頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（3）外植體大小選擇

因外植體不同而不同。如利用莖尖培養(yǎng)，莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。（以后具體講）

（4）選擇外植體的時期

外植體的生長動態(tài)往往與該物種的生長規(guī)律（生物鐘）有關。因此，最好在植物生長的最適宜時期取材培養(yǎng)，會得到較好的結果。

第50頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（1）外植體休眠的處理

有些植物的種子、幼胚、或芽，存在休眠。為了打破休眠，可利用低溫處理，或赤霉素等化學物質(zhì)處理。因植物不同處理溫度和時間有所不同。

（2）組織內(nèi)生菌的處理

A.加入抗生素，注意抗生素的用量，高濃度容易造成培養(yǎng)物的死亡。

B.取生長期旺盛的生長點部位作為起始培養(yǎng)的外植體。

C.取被內(nèi)生菌污染的培養(yǎng)物的莖尖不停的轉接。

2、外植體的處理第51頁,共107頁，2024年2月25日，星期天三、培養(yǎng)基的成分及其配制（一）培養(yǎng)基的成分及其作用1、無機營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)的植物組織、器官、細胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無機化學物質(zhì)，除了C、H、O之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量營養(yǎng)元素。第52頁,共107頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。

培養(yǎng)基中加入量最多的是N，N一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結合的鹽提供。大量元素第53頁,共107頁，2024年2月25日，星期天微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co，Cl。

其他一些化學藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微量元素的用量不能過多，多會引起生長抑制等毒害現(xiàn)象。

微量元素第54頁,共107頁，2024年2月25日，星期天2、有機化合物（1）維生素類物質(zhì)維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素；而鹽酸吡哆醇（VB6）促進根的生長，煙酸（VB3，又稱維生素PP）促進胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12），VC等。第55頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（2）AA類物質(zhì)

絕大多數(shù)AA適量時對培養(yǎng)效果都有正向效應。常用的有Gly（甘氨酸）、Asn（天冬酰胺）、Gln（谷氨酰胺）。在植物組織培養(yǎng)中，有時也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。

第56頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（3）糖類

糖在培養(yǎng)基中的作用：

1）為細胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架

2）為細胞的呼吸代謝提供底物和能量

3）維持滲透壓

蔗糖是廣泛應用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。

第57頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（4）其它有機物質(zhì)

1）肌醇（環(huán)己六醇）

肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細胞壁的構建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽離子結合或形成磷脂，參與細胞膜的組成。利于胚和芽的形成

2）天然有機物

一些天然的有機物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進作用。

第58頁,共107頁，2024年2月25日，星期天植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對植物生長發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機物，而植物生長調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。無機元素和有機營養(yǎng)構成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動，只有加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導細胞分裂、脫分化和再分化。3、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)第59頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（1）生長素類

1）吲哚類：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）

2）萘酸類：NAA（萘乙酸）

3）苯氧羧酸類：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強的生長素。

第60頁,共107頁，2024年2月25日，星期天

生長素的生理作用

1、促進細胞生長和細胞分裂

2、誘導受傷組織表面細胞恢復分裂能力

3、形成愈傷組織，促進生根

4、與一定量的細胞分裂素配合共同誘導不定芽的分化、側芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘導。

第61頁,共107頁，2024年2月25日，星期天A：NAA0mg/L，芽（少），根（無）

B：NAA0.1mg/L，芽（少），根（無），愈傷組（少量）

C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量）

AB

C第62頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（2）細胞分裂素是一類腺嘌呤衍生物。主要有6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-芐基氨基嘌呤。功能：促進細胞的分裂和分化誘導芽的分化促進側芽的萌發(fā)和生長抑制衰老第63頁,共107頁，2024年2月25日，星期天ABA：BA(0mg/L)，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）

B：BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）

第64頁,共107頁，2024年2月25日，星期天控制植物細胞分化分裂素/生長素的比例是控制芽和根形成的一個重要條件比例高時——產(chǎn)生芽,比例低時——產(chǎn)生根第65頁,共107頁，2024年2月25日，星期天生理作用：

1、誘導莖的細胞伸長，對矮生型植物恢復成高生型特別有效，對根無效。

2、對形成層的細胞分化有影響，往往同生長素有協(xié)同作用。IAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。

3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。

4、對生長素和細胞分裂素的活性有增效作用。

注：不耐熱，應采用過濾滅菌加入。（3）赤霉素（GA3）第66頁,共107頁，2024年2月25日，星期天生理作用：

1、抑制蛋白質(zhì)的合成

2、抵消和抑制生長素、細胞分裂素、GA的作用

3、誘導休眠、促進衰老和脫落

（4）脫落酸（ABA）第67頁,共107頁，2024年2月25日，星期天以上四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類用的多，后兩類只是補充，對某些植物有利、對某些植物不僅沒有利，還有害，實際工作中要具體分析。

生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一般用ppm表示

1ppm=1mg/L第68頁,共107頁，2024年2月25日，星期天(1)固化劑

瓊脂、瓊脂糖（用于原生質(zhì)體、細胞培養(yǎng)及某些作物的花藥培養(yǎng)）

瓊脂的用量一般在4-10g/L，所購回的瓊脂要先試一下它的凝固力，一般只要能穩(wěn)定的凝固就不要多加。瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。

(2)懸浮劑

Ficoll（聚蔗糖）

4、固化劑和懸浮劑第69頁,共107頁，2024年2月25日，星期天1、根據(jù)無機鹽的濃度，培養(yǎng)基分為：

（1）高無機鹽含量培養(yǎng)基

鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，比例適當，離子平衡性好，具有較強的緩沖性，養(yǎng)分數(shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基。（二）培養(yǎng)基的種類第70頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（2）高硝態(tài)氮培養(yǎng)基

硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的VB1。主要適合于十字花科植物、單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基。

第71頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（3）中等無機鹽含量培養(yǎng)基

大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較MS的高，維生素種類比MS多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有Nitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基。第72頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（4）低無機鹽含量培養(yǎng)基

大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機含量相對也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有White、Heller、WS、HE、HB培養(yǎng)基。

第73頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（1）初代培養(yǎng)基

用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。

（2）繼代培養(yǎng)基

用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為：第74頁,共107頁，2024年2月25日，星期天3、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為：

（1）誘導培養(yǎng)基

（2）增殖培養(yǎng)基

（3）生根培養(yǎng)基第75頁,共107頁，2024年2月25日，星期天4、根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為：

（1）基本培養(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）

主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。

（2）完全培養(yǎng)基

就是基本培養(yǎng)基的基礎上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復雜有機物質(zhì)等。第76頁,共107頁，2024年2月25日，星期天1、無機營養(yǎng)成分：一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇。可以參考前人的經(jīng)驗，例如：MS是廣譜性培養(yǎng)基，N6用于單子葉植物的培養(yǎng)。豆科多用B5培養(yǎng)基。

2、植物生長調(diào)節(jié)劑：必須進行篩選試驗?？傮w原則-當誘導愈傷組織形成時，細胞分裂素和生長素相對平衡；誘導芽分化時，細胞分裂素水平應高于生長素，誘導根則要低。

3、有機成分：要根據(jù)培養(yǎng)類型考慮，如進行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復雜有機成分，而進行細胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加。（三）培養(yǎng)基的篩選第77頁,共107頁，2024年2月25日，星期天

貯備液（母液）的配制

為什么要配制母液？

1）方便

2）準確（有些成分量太?。?/p>

（四）培養(yǎng)基的配制第78頁,共107頁，2024年2月25日，星期天1、大量元素母液的配制

各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴大10倍，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到1000mL的容量瓶中，即為10倍的大量元素母液。倒入細口瓶，貼好標簽保存于冰箱中。

配制培養(yǎng)基時，每配1L培養(yǎng)基取此液100mL。第79頁,共107頁，2024年2月25日，星期天注意：(1)某些無機成分如Ca2+、SO42-、Mg2+和H2PO4-等在一起可能發(fā)生化學反應，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級較高的分析純，各種化學藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時應注意先后順序。特別應將Ca2+、SO42-、Mg2+和H2PO4-等離子錯開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。

(2)CaCl2·2H2O要在最后單獨加入，在溶解CaCl2·2H2O時，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl2·2H2O放入沸水中易沸騰，操作時要防止其溢出。

第80頁,共107頁，2024年2月25日，星期天２、微量元素母液的配制

MS培養(yǎng)基的微量元素無機鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別

是

CuSO4·5H2O、

CoCl2·6H2O

，因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制。按照表2，表3配方，用感量為0.0001g的分析天平稱量，其它同大量元素。配制培養(yǎng)基時，每配制1L培養(yǎng)基，取微量Ⅰ10mL，微量Ⅱ１mL。第81頁,共107頁，2024年2月25日，星期天第82頁,共107頁，2024年2月25日，星期天3、鐵鹽母液的配制

鐵鹽不是都需要單獨配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時，配制1L取此液10mL。第83頁,共107頁，2024年2月25日，星期天在配制鐵鹽時，如果加熱攪拌時間過短，會造成FeSO4和Na2EDTA鰲合不徹底，此時若將其冷藏，F(xiàn)eSO4會結晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時，F(xiàn)eSO4和Na2EDTA應分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20-30min)，調(diào)pH值至5.5，室溫放置冷卻后，再冷藏。第84頁,共107頁，2024年2月25日，星期天4、有機母液的配制

MS培養(yǎng)基的有機成分有甘氨酸、肌醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。培養(yǎng)基中的有機成分原則上應分別單獨配制。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時用電子分析天平。并貯存在棕色無菌瓶中。

配制生物素、葉酸，用稀氨水溶解，然后定容。第85頁,共107頁，2024年2月25日，星期天一般植物生長調(diào)節(jié)劑母液配制的終濃度以0.5mg/mL為好，需要注意的是：

（１）配制生長素類例如IAA（吲哚乙酸）、NAA（萘乙酸）、2,4-D、IBA（吲哚丁酸），應先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。以后者效果好。

（２）細胞分裂素應先用少量95%乙醇或無水乙醇加3-4滴1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/LHCl溶解，再用蒸餾水定容。

（３）GA3(赤霉素)以95%酒精溶解（不耐高溫，過濾滅菌）

保存在棕色試劑瓶中。

5、植物生長調(diào)節(jié)劑母液配制第86頁,共107頁，2024年2月25日，星期天

注意：

所有母液都要貼上標簽，注明名稱、配制倍數(shù)、日期，所有的母液都應保存在0-4℃冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團則不能繼續(xù)使用。第87頁,共107頁，2024年2月25日，星期天在培養(yǎng)基的配制過程中，常需要用氫氧化鉀或氫氧化鈉和鹽酸來調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度：

（1）1摩爾/升KOH液的配制:稱取57.1克KOH,加蒸餾水至1000毫升.

2）1摩爾/升NaOH液的配制:稱取40克NaOH,加蒸餾水至1000毫升.

3）1摩爾/升HCl液的配制:取濃鹽酸(比重1.19)、82.5毫升加蒸餾水至1000毫升.配制時先將濃鹽酸緩緩加入約800毫升的蒸餾水中,然后用蒸餾水補足至1000毫升.第88頁,共107頁，2024年2月25日，星期天1、計量

根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計算需要吸取母液的量，計算公式：吸取量mL=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）×1000mL/母液濃度（mg/L）。

2、移液

取醫(yī)用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。

培養(yǎng)基配制過程第89頁,共107頁，2024年2月25日，星期天注意：

（1）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。

（2）量取母液時，不要漏掉或多加。

（3）移液管不能混用。

第90頁,共107頁，2024年2月25日，星期天3、稱取瓊脂、蔗糖備用

4、融化

用搪瓷量杯量取600～700mL的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。

大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。第91頁,共107頁，2024年2月25日，星期天5、混合

將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000ml，來回混合幾次。

6、調(diào)pH

用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙(5.4～7.0)測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達到要求為止(在調(diào)制時要比目標pH值偏高0.2～0.5個單位，因為培養(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會下降0.2～0.5個單位左右)。

第92頁,共107頁，2024年2月25日，星期天7、分裝

溶化的培養(yǎng)基應該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝20～30瓶。

8、包扎

用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號。

9、培養(yǎng)基的滅菌第93頁,共107頁，2024年2月25日，星期天溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學環(huán)境條件都會影響組織培養(yǎng)。四、培養(yǎng)條件的選擇第94頁,共107頁，2024年2月25日，星期天（一）光照的影響培養(yǎng)中光照是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強、光質(zhì)、以及光周期等方面：

光周期：黑暗與光照交替的時間

光強：光照強度

光質(zhì)：光的波長第95頁,共107頁，2024年2月25日，星期天例1：黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥，其胚狀體的分化與幼植物的生長，同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多

例2：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條件下才能分化成根

例3：對日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成根

結論：光周期的需要與否，應根據(jù)植物種類、培養(yǎng)的目的來決定

1、光周期對植物細胞脫分化和再分化的效應第96頁,共107頁，2024年2月25日，星期天

最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。

愈傷組織誘導階段：一般采用三種做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類不同做法不同，多數(shù)植物適合全暗或周期性光照。

器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。

離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)第97頁,共107頁，2024年2月25日，星期天光照強度對培養(yǎng)細胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強度對外植體、細胞的最初分裂有明顯的影響。

一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯；而光照強度較弱，幼苗容易徒長。

離體培養(yǎng)條件下常用的光量，一般為1000-4000

lx（勒克斯）。離體培養(yǎng)中通常難以達到4000lx，一般光量在2000-3000

lx。光照強度的高低直接影響器官分化的頻率