重組子的篩選與鑒定

第七章重組子的篩選與鑒定第一節(jié)遺傳學(xué)檢測(cè)法第二節(jié)核酸分子雜交檢測(cè)法第三節(jié)電泳檢測(cè)法第四節(jié)免疫化學(xué)檢測(cè)法第五節(jié)核酸序列分析及其他方法1編輯ppt將目的DNA片段與載體連接形成重組子，然后通過各種方法將重組子導(dǎo)人宿主細(xì)胞。得到所需要的帶有重組DNA的轉(zhuǎn)化子是基因工程的目的所在。轉(zhuǎn)化子就是導(dǎo)入外源DNA后獲得了新的遺傳標(biāo)志的細(xì)菌細(xì)胞或其他受體細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，并非所有的細(xì)胞都轉(zhuǎn)入重組DNA分子，即使所有的受體細(xì)胞都變?yōu)檗D(zhuǎn)化體，所獲得的轉(zhuǎn)化子仍是多種類型的DNA分子，因?yàn)樵谶B接產(chǎn)物中既有裁體和一個(gè)或數(shù)個(gè)串聯(lián)目的基因的連接，也有載體的自連，還有目的DNA分子的自連，更多的是未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的DNA片段。2編輯ppt因此在成千上萬個(gè)轉(zhuǎn)化子中，真正含有期望的重組DNA分子的比例很少，為了將含有外源DNA的宿主細(xì)胞和不含外源DNA宿主細(xì)胞分開，以及將含有正確重組子的宿主細(xì)胞和含有其他外源DNA的宿主細(xì)胞分開。這就需要設(shè)計(jì)出容易于篩選重組子克隆的方案并加以驗(yàn)證，這就是我們這一章要討論的內(nèi)容。3編輯ppt陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定可以從不同的層次、利用不同的方法進(jìn)行?？偟膩碚f，重組子的鑒定可以從直接和間接兩個(gè)方面分析，可以從DNA、RNA和蛋白質(zhì)三個(gè)不同的水平進(jìn)行鑒定。4編輯ppt5編輯ppt第一節(jié)遺傳學(xué)檢測(cè)法1根據(jù)栽體表型特征的篩選2根據(jù)插入基因遺傳性狀的篩選6編輯ppt1根據(jù)栽體表型特征的篩選根據(jù)載體分子所提供的表型特征，選擇重組體DNA分子的遺傳選擇法，可適用于大量群體的篩選，因此是一種比較簡(jiǎn)單而又十分有效的方法。7編輯ppt含有一個(gè)選擇標(biāo)記:實(shí)際操作中，最典型的方法是使用抗藥性標(biāo)記的插入失活作用，或是β—半乳糖苷酶基因的顯色反應(yīng)，將重組體DNA分子的轉(zhuǎn)化子同非重組的載體轉(zhuǎn)化子區(qū)別開來。對(duì)λ噬菌體的置換型載體來說。λ噬菌體頭部外殼蛋白容納DNA的能力是有一定限度的。其包裝能力應(yīng)控制在野生型λDNA長(zhǎng)度的75％一105％之間(36—51kb)，這樣才能形成噬菌斑。因此，包裝限制這一特性，保證了體外重組所形成的有活性的λ重組體分子，一般都應(yīng)帶有外源DNA的插入片段，λ噬菌斑的形成本身就是對(duì)λ重組體的一種篩選特征。8編輯ppt1.1抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法在PBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗生隸抗性基因，Tetr上有插入位點(diǎn)BamHI和SalI;Ampr上有插入位點(diǎn)PstI。9編輯ppt四環(huán)素：氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生

-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。環(huán)絲氨酸：10編輯ppt當(dāng)外源DNA限制片段插入pBR322質(zhì)粒的BamHI和SalI位點(diǎn)時(shí)，抗四環(huán)素基因失活，重組體轉(zhuǎn)化子必定具有Ampr

Tets表型。將轉(zhuǎn)化菌先涂布在含有Ampr的瓊脂平板上并將存活的Ampr菌落原位影印到另一個(gè)含有Tet的瓊脂平板上，凡是在Ampr平板上生長(zhǎng)，而不在Tet平板亡生長(zhǎng)的菌落，就必定是已經(jīng)插入了外源DNA限制片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子克隆。（1）四環(huán)素抗性插入失活11編輯ppt如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，反而被環(huán)絲氨酸殺死。12編輯ppt13編輯ppt（2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。14編輯ppt1.2-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法1.2.1.原理：載體上有一段

-半乳糖苷酶基因（LacZ）的

片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。

受體菌基因組中有突變的

-半乳糖苷酶基因（

片段缺失）?？梢员籌PTG誘導(dǎo)表達(dá)。載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的

-半乳糖苷酶。

-半乳糖苷酶能把無色的化合物Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-氯靛藍(lán)。Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)

-半乳糖苷酶15編輯ppt載體上LacZ’的5’端有一段多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)，本身雖不干擾LacZ’的合成，但插入外源基因就會(huì)阻止LacZ’的合成。不能互補(bǔ)。16編輯ppt2根據(jù)插入基因遺傳性狀的篩選重組體DNA分子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌受體細(xì)胞之后，如果插入在載體分子上的外源基因能夠?qū)崿F(xiàn)其功能性的表達(dá)，而且表達(dá)的產(chǎn)物能與大腸桿菌菌株的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變形成互補(bǔ)，那么就可以利用營(yíng)養(yǎng)突變株進(jìn)行篩選。17編輯ppt營(yíng)養(yǎng)缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于發(fā)生基因突變，致使合成途徑中某一步驟發(fā)生缺陷，從而喪失了合成某些物質(zhì)的能力，必須在培養(yǎng)中外源補(bǔ)加該營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才能生長(zhǎng)的突變型菌株。

例如．當(dāng)外源目的基因?yàn)楹铣闪涟彼岬幕驎r(shí)，將該基因重組后轉(zhuǎn)入缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在僅僅缺少亮氨酸的基本培養(yǎng)基上篩選，只有能利用表達(dá)產(chǎn)物亮氨酸合成酶的菌株存活。18編輯ppt第二節(jié)核酸分子雜交檢測(cè)法

1原理

2核酸雜交檢測(cè)方法19編輯ppt利用堿基配對(duì)的原理進(jìn)行分子雜交是核酸分析的重要手段，也是鑒定基因重組體的常用方法。雜交的雙方是待測(cè)的核酸序列和由插入片段基因制備的DNA或RNA探針。這些方法都是通過一定的物理方法將菌落(噬菌斑)或提取的DNA從平板或凝膠上轉(zhuǎn)移到固體支持物上，然后同液體中的探針進(jìn)行雜交。菌落(噬菌斑)或DNA從平板或凝膠向?yàn)V膜轉(zhuǎn)移的過程稱為印跡，故這些雜交又都稱為印跡(blotting)雜交。20編輯ppt1.1核酸雜交1、原理：重組克隆與探針雜交。1.3識(shí)別標(biāo)記32P或3H35S。（1）放射性同位素1.2檢測(cè)用的探針與外源DNA插入片斷互補(bǔ)的序列。（2）非放射性標(biāo)記熒光素21編輯ppt根據(jù)待測(cè)核酸的來源以及將其分子結(jié)合到固體支持物上的不同，核酸雜交主要有菌落印跡原位雜交斑點(diǎn)(dot)印跡雜交Southern印跡雜交Northernblotting2、核酸雜交檢測(cè)方法22編輯ppt2.1SouthernblottingSouthern印跡雜交是由ESouthern于1975年首先建立并使用的，故名之。它是根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過與已標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用以檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。Southern印跡雜交是針對(duì)DNA分子進(jìn)行的印跡雜交技術(shù)，有時(shí)又稱為DNA印跡雜交或SouthernDNA印跡雜交等。23編輯pptSouthernblotting過程①將進(jìn)行DNA電泳分離的瓊脂糖凝膠，經(jīng)過堿變性等預(yù)處理之后平鋪在用電泳緩沖液飽和了的兩張濾紙上，在凝膠上部覆蓋一張硝酸纖維素濾膜，接著加上一疊干燥濾紙或吸水紙，最后再壓上一重物。②在80℃下烘烤1-2h,使DNA片段穩(wěn)定地固定在硝酸纖維素濾膜上。24編輯ppt由于干燥濾紙或吸水紙的虹吸作用，凝膠中的單鏈

DNA便隨著電泳緩沖液一起轉(zhuǎn)移，一旦同硝酸纖維素濾膜接觸，就會(huì)牢固地結(jié)合在它的上面，這樣在凝膠中的DNA片段就會(huì)按原譜帶模式吸印到濾膜上。25編輯ppt③然后將此濾膜移放在加有放射性同位素標(biāo)記探針的溶液中進(jìn)行核酸雜交。這些探針是同被吸印的DNA序列互補(bǔ)的RNA或單鏈DNA。一旦同濾膜上的單鏈DNA雜交之后，可以牢固結(jié)合。

④漂洗去除游離的沒有雜交上的探針分子，經(jīng)放射自顯影后，便可鑒定出與探針的核昔酸序列同源的待測(cè)DNA片段。據(jù)此可以將含有外源DNA片段的重組子篩選出來。26編輯ppt27編輯ppt酶切前酶切后插入片斷載體28編輯pptSouthernblot篩選結(jié)果29編輯ppt2.2菌落印跡原位雜交是直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，不必進(jìn)行核酸分離純化、內(nèi)切酶酶解及電泳分離等操作，而是經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結(jié)合，再與特異性DNA或RNA探針雜交，篩選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。由于生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平極上的菌落或噬菌斑，是按照其原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，所以菌落雜交或噬菌斑雜交隸屬原位雜交范疇。以菌落原位雜交為例，操作步驟如下:30編輯ppt①將硝酸纖維素濾膜鋪放在生長(zhǎng)著轉(zhuǎn)化菌落的平板表面，使其中的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上。②作好標(biāo)記，小心取出濾膜，將吸附菌體的一面朝上放置在預(yù)先被強(qiáng)堿溶液浸濕的普通濾紙上進(jìn)行溶菌和堿變性處理。強(qiáng)堿可以裂解細(xì)菌，釋放細(xì)胞內(nèi)含物，降解RNA，并使蛋白和DNA變性。③將濾膜轉(zhuǎn)移至預(yù)先被中性緩沖液浸濕的普通濾紙上，中和NaOH。④將濾膜轉(zhuǎn)移到清洗緩沖液中短暫浸泡，洗去菌體碎片和蛋白質(zhì)。31編輯ppt⑤取出濾膜晾干，置于80℃下干燥，使單鏈DNA牢固地結(jié)合在硝酸纖維素濾膜上。⑥將濾膜轉(zhuǎn)入探針溶液中，進(jìn)行雜交反應(yīng)。⑦雜交反應(yīng)結(jié)束后，清洗濾膜，除去未特異性雜交的探針，然后晾干。⑧將濾膜與X線片壓緊置于暗箱內(nèi)曝光，由膠片上感光斑點(diǎn)的位置，在原始平板上挑出相應(yīng)的陽(yáng)性重組子菌落

32編輯ppt特點(diǎn)：對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。33編輯ppt34編輯ppt35編輯ppt2.3斑點(diǎn)印跡雜交

如果只要檢測(cè)克隆菌株、動(dòng)植物細(xì)胞株或轉(zhuǎn)基因個(gè)體、器官、組織提取的總DNA或RNA樣品中是否含有目的基因，則可采用斑點(diǎn)印跡雜交(dotblotting)或狹線印跡雜交(slotblotting)進(jìn)行檢測(cè)，它們是在

Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的兩種相似的快速檢測(cè)特異核酸(DNA或RNA)分子的核酸雜交技術(shù)。

36編輯ppt斑點(diǎn)雜交法與菌落原位雜交的原理一樣，但方法更簡(jiǎn)單、迅速，可直接將噬菌體的上清液或是由轉(zhuǎn)化子提取的DNA(RNA)樣品直接點(diǎn)在硝酸纖維素濾膜等固體支持物上，與探針進(jìn)行分子雜交。通過放射自顯影，從底片中找出黑點(diǎn)即為陽(yáng)性斑點(diǎn)。此方法常用于病毒核酸的定量檢測(cè)。37編輯ppt2.4NorthernblottingNorthern

印跡雜交是指將RNA分子變性及電泳分離后，從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上進(jìn)行核酸雜交的方法，又稱為NorthernRNA印跡雜交等。該法是在Southern

blotting雜交基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要針對(duì)RNA分子的檢測(cè)，基本步驟與Southern印跡雜交相似。但RNA分子與

DNA分子有所不同，

一般不能采用堿變性處理，同時(shí)，在RNA電泳時(shí)必須解決兩個(gè)問題：一是防止單鏈RNA形成高級(jí)結(jié)構(gòu)，故必須采用變性凝膠電泳；二是電泳過程中始終要有效抑制RNase的作用，防止RNA分子的降解破壞。38編輯ppt用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。39編輯ppt第三節(jié)電泳檢測(cè)法1直接凝膠電泳檢測(cè)法

2切酶酶切片段電泳分析法3

PCR擴(kuò)增檢測(cè)法40編輯ppt利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。1、直接電泳檢測(cè)法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。出現(xiàn)滯后，稱滯后現(xiàn)象分子量Marker載體重組克隆41編輯ppt2限制性核改內(nèi)切酶酶切片段電泳分析法2.1原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長(zhǎng)度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。42編輯pptABA或B43編輯ppt44編輯ppt不同克隆的酶切結(jié)果45編輯ppt篩選過程46編輯ppt3、PCR擴(kuò)增檢測(cè)法3.1原理PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷。3.2過程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是否與外源基因一致。47編輯ppt第四節(jié)免疫化學(xué)檢測(cè)法免疫化學(xué)檢測(cè)法是一種間接的篩選方法，它利用特異性抗體與外源DNA編碼的抗原的相互作用進(jìn)行篩選，特別適用于檢測(cè)不為宿主提供任何檢測(cè)標(biāo)志的基因。使用該方法的前提是插入的外源基因必須在受體細(xì)胞中表達(dá)，必須具有目的蛋白質(zhì)的抗體。常見的有放射性抗體檢測(cè)法、免疫沉淀檢測(cè)法、wetem印跡分析法等48編輯ppt第四節(jié)免疫化學(xué)檢測(cè)法

1放射性抗體檢測(cè)法

2免疫沉淀檢測(cè)法

3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）4

western印跡分析法49編輯ppt利用抗體作為“探針”來檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：1.1抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。蛋白——蛋白“雜交”1放射性抗體檢測(cè)法50編輯ppt待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I標(biāo)記的二抗結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗51編輯ppt1.2基本原理及操作步驟首先將長(zhǎng)有轉(zhuǎn)化子菌落的瓊脂平板影印復(fù)制，備用。把原平板放置在氯仿蒸汽中，使細(xì)菌菌落裂解，釋放出抗原。將吸附有抗體的固體支持物聚乙烯薄膜輕輕放在先前裂解的菌落上，相互接觸，以利于個(gè)別菌落的抗原吸附到抗體上，形成抗原-抗體復(fù)合物。取出含有抗原-抗體復(fù)合物的聚乙烯薄膜，放入預(yù)先用同位素125I標(biāo)記的抗體溶液中溫浴，薄膜上的抗原就會(huì)與125I標(biāo)記的抗體相結(jié)合。最后經(jīng)放射自顯影，顯示出抗原與125I標(biāo)記的抗體結(jié)合的位置，并由此確定復(fù)制平板上能夠合成抗原的菌落，即重組體菌落52編輯ppt1.2.放射性抗體檢測(cè)法過程53編輯ppt1.3.Broome-Gilbert雙位點(diǎn)檢測(cè)法質(zhì)?；駻插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白檢測(cè)融合蛋白。既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物。54編輯ppt固相支持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的抗B抗體質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光55編輯ppt56編輯ppt將補(bǔ)加有抗體和溶菌酶的瓊脂，小心傾注到菌落的上面，并使之凝固。在溶菌酶的作用下，菌落表面的細(xì)菌發(fā)生溶菌反應(yīng)，逐步釋放出細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)。如果有某些菌落的細(xì)胞能夠分泌出目的基因編碼的蛋白質(zhì)，它們就會(huì)同包含在瓊脂培養(yǎng)基中的抗體發(fā)生反應(yīng)，在菌落周圍產(chǎn)生白色的沉淀圈。2.1.原理抗原——抗體凝集反應(yīng)。是在平板培養(yǎng)基上直接進(jìn)行免疫反應(yīng)，以鑒定產(chǎn)生蛋白質(zhì)的重組菌落，檢測(cè)分泌型產(chǎn)物。2.2.方法2、免疫沉淀檢測(cè)法57編輯ppt對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。58編輯pptEnzyme-linkedimmunosorbantassay3.1.原理：一抗（primaryantibody）:

與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。二抗（secondaryantibody）：與一抗的特異性結(jié)合。酶連（enzyme-linke）：二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩奈镔|(zhì)（或發(fā)光），再通過比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。3酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）59編輯ppt待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶

待測(cè)基因產(chǎn)物蛋白一抗二抗無色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶

1960編輯ppt3.2.ELISA檢測(cè)的一般步驟（1）固定樣品將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板（microtiterplate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎?1編輯ppt加入一抗，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。（2）一抗結(jié)合一抗62編輯ppt加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗結(jié)合二抗63編輯ppt加入無色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。（4）顯色反應(yīng)64編輯ppt65編輯ppt在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。（5）比色66編輯ppt3.3.ELISA的局限性有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特異性）。必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonalantibody）67編輯ppt臨床檢驗(yàn)常用的單抗68編輯ppt4.1.原理：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶。（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。①SDS:（SDS）：4免疫印跡（westernblotting）法69編輯ppt②聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：（Polyacrylamidegelelectrophoresis）在電場(chǎng)的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動(dòng)，移動(dòng)的速率主要取決于其分子量大小（鏈的長(zhǎng)短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer70編輯ppt點(diǎn)樣電泳方向71編輯ppt③蛋白質(zhì)電泳的分子量標(biāo)準(zhǔn)已知分子量的蛋白質(zhì)混合液，與待測(cè)樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位,等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。一克約為6×1023道爾頓72編輯pptDaltonSDSPAGE73編輯ppt④凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。1）直接染色74編輯ppt直接染色電泳結(jié)果75編輯ppt（2）Westernblotting電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。①Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場(chǎng)的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白76編輯pptWestern裝置77編輯ppt②Blotting原理與ELISA相同。待測(cè)蛋白硝酸纖維素膜一抗二抗辣根過氧化物酶底物產(chǎn)物，并發(fā)出光PAGE膠待測(cè)蛋白底片曝光辣根過氧化物酶：HRPO78編輯ppt79編輯ppt1）先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。③Blotting過程ImmunoBlotting80編輯ppt④結(jié)果多克隆抗體Blotti