植物組織培養(yǎng)技術(shù)課件

馬鈴薯的組織培養(yǎng)

微型薯

馬鈴薯是一種全球性的重要經(jīng)濟(jì)作物。適應(yīng)性廣，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，耐貯藏適運(yùn)輸，既是一種重要的糧食作物也是一種調(diào)節(jié)市場(chǎng)供應(yīng)的重要蔬菜。馬鈴薯原產(chǎn)于拉丁美洲，當(dāng)被發(fā)現(xiàn)可以食用后，很快傳到世界各地，成為栽培很廣的一種作物。但是，當(dāng)發(fā)現(xiàn)從外地引種栽培1~2個(gè)周期后，明顯發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量降低，植株變矮，并有卷葉的現(xiàn)象產(chǎn)生，經(jīng)檢測(cè)證明這是由于病毒引起的退化現(xiàn)象。

危害馬鈴薯的病毒有17種之多，如X病毒、S病毒、Y病毒、M病毒、A病毒、花葉病毒、紡錘形塊莖病毒等。由于馬鈴薯是無性繁殖作物，病毒逐代積累，日益嚴(yán)重，引起嚴(yán)重退化。馬鈴薯病毒可使塊莖產(chǎn)量減少50%~80%。法國(guó)Morel和他的同事們，1955年從患病馬鈴薯植株中選取到了無病植株，為治療作物病毒開辟了新途徑。一、特性和生物學(xué)習(xí)性1、馬鈴薯的形態(tài)特性根馬鈴薯的根系由出生根和匍匐根兩部分組成。莖馬鈴薯分地上部分和地下部分，地上主莖在形成16片葉子后，由花芽封頂，并在花的下部發(fā)生兩個(gè)側(cè)枝，從而構(gòu)成馬鈴薯的主要同化系統(tǒng)。地下莖包括主莖的地下部分、匍匐莖和塊莖。（3）葉馬鈴薯先出土的葉是初生葉，全緣，心臟形。以后發(fā)生的葉奇數(shù)羽狀全裂單葉，在葉柄基部與主莖相連處著生有托葉。（4）花馬鈴薯的花為聚傘花序，第一或第二花序開放，恰是塊莖強(qiáng)盛膨大之時(shí)，此時(shí)是需要不斷澆水的形態(tài)標(biāo)志。

(5)果實(shí)、種子馬鈴薯果實(shí)為球形或橢圓形漿果。種子小。扁平腎形。種子可用來繁殖，但后代性狀分離大。2、生物學(xué)習(xí)性馬鈴薯性喜冷氣候，不耐高溫和霜凍，解除休眠的塊莖4℃下發(fā)芽，發(fā)芽適溫為12~18℃。地上莖葉生長(zhǎng)溫度為17~21℃，25℃以上時(shí)生長(zhǎng)不良，葉變小，超過30℃和7℃以下莖葉停止生長(zhǎng)，-1℃時(shí)受凍。塊莖形成要求晝溫14~24℃，夜溫12~14℃，土溫16~18℃。土溫20℃以上時(shí)塊莖形成緩慢，而且容易引起退化，高溫下養(yǎng)分多用于芽和匍匐莖生長(zhǎng)不易形成塊莖，25~30℃時(shí)已經(jīng)長(zhǎng)成的塊莖也變成細(xì)長(zhǎng)莖，結(jié)薯期要求12h左右的短日照和疏松、濕潤(rùn)、肥沃以及通氣良好的土壤條件。土壤板結(jié)，薯塊表面粗糙和薯形不整。馬鈴薯生產(chǎn)中普遍存在有種性退化問題，表現(xiàn)為植株長(zhǎng)勢(shì)衰弱，株形矮化，分枝變少，薯塊變小，產(chǎn)量逐降低，造成退化的原因和學(xué)說多種，綜合而言，主要是薯塊生長(zhǎng)錐細(xì)胞發(fā)生階段性衰老而導(dǎo)致種性退化，而病毒和細(xì)菌病害的侵染，以及肥水、營(yíng)養(yǎng)條件不良等都會(huì)加劇其退化程度。二、馬鈴薯脫毒技術(shù)馬鈴薯在營(yíng)養(yǎng)繁殖時(shí)易受病毒的浸染，當(dāng)條件適合時(shí)，病毒就會(huì)在植株內(nèi)增殖，轉(zhuǎn)運(yùn)和積累，隨著世代傳遞，病毒危害逐年加重，一般可造成減產(chǎn)50％以上。研究發(fā)現(xiàn)，有30多種病毒易感染馬鈴薯，并引起品種退化，嚴(yán)重影響馬鈴薯的生產(chǎn)。通過微莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)能從馬鈴薯體內(nèi)脫除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。因此，采用組織培養(yǎng)技術(shù)，通過一定良種繁殖體系，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種薯，是保證馬鈴薯高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的一項(xiàng)有效措施。全國(guó)現(xiàn)有馬鈴薯播種面積300多萬公頃，且有逐步增加的趨勢(shì)，每年需合格種薯45億公斤，脫毒原種4億公斤，脫毒小薯或微型薯45億粒。因此，脫毒馬鈴薯推廣具有廣闊的市場(chǎng)前景，對(duì)于增加農(nóng)民收入和發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)具有十分重要的意義。我國(guó)的馬鈴薯平均單產(chǎn)僅為13.60噸/公頃，是世界單產(chǎn)最高國(guó)這瑞士（48.80噸/公頃）的1/4。造成如此大的差別，最主要的因素就是種薯質(zhì)量差，品種布局不合理。采用脫毒快繁技術(shù)，種用脫毒種薯，一般可增產(chǎn)30-50%，甚至成倍增產(chǎn)，充分發(fā)揮品種的潛能，提高馬鈴薯生產(chǎn)能力。如果我國(guó)現(xiàn)有馬鈴薯播種面積的1/3（即114萬公頃）用脫毒種薯，就可年增產(chǎn)糧食100多億公斤。我國(guó)在70年代用莖尖組織培養(yǎng)方法得到脫毒馬鈴薯試管苗，并成功地獲得脫毒復(fù)壯的馬鈴薯，開始了脫毒種薯的生產(chǎn)和推廣。"八五"期間，農(nóng)業(yè)部在全國(guó)范圍內(nèi)設(shè)立了6個(gè)馬鈴薯原原種基地建設(shè)和種薯生產(chǎn)項(xiàng)目，初步形成了脫毒草種薯生產(chǎn)體系。共推廣脫毒種薯36.5-40萬公頃，獲經(jīng)濟(jì)效益近30.8億元。我國(guó)已有許多科研、推廣單位開展了脫毒馬鈴薯的研究和生產(chǎn)，在生產(chǎn)上產(chǎn)生了一定的經(jīng)濟(jì)效益和增產(chǎn)效果，但由于長(zhǎng)期以來各自為政，技術(shù)方法和脫毒標(biāo)準(zhǔn)不盡統(tǒng)一，未能發(fā)揮出脫毒種薯應(yīng)有的增產(chǎn)潛力。到目前為止，我國(guó)仍未建立國(guó)家級(jí)的脫毒種薯質(zhì)量監(jiān)督和病毒檢測(cè)制度。

1．脫毒種薯生產(chǎn)程序采用微莖尖組織培養(yǎng)的方法，誘導(dǎo)出苗，采用聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法或指示植物方法鑒定馬鈴薯病毒和類病毒，經(jīng)鑒定后，無主要病毒及類病毒的試管苗可定為脫毒試管基礎(chǔ)苗。試管基礎(chǔ)苗在無菌條件下，采用固體、液體培養(yǎng)基相結(jié)合的方法，進(jìn)行擴(kuò)繁基礎(chǔ)苗，在防蟲網(wǎng)室栽植或封閉溫室扦插，生產(chǎn)出原原種（或稱脫毒小薯）。用原原種在一定隔離條件下產(chǎn)生原種1代，以后逐級(jí)稱為原種2代、良種1代、良種2代。2．莖尖培養(yǎng)脫毒（1）取材和培養(yǎng)一般多采用在室內(nèi)發(fā)芽，芽經(jīng)熱處理（38℃）2周。然后取頂芽或側(cè)芽1厘米的莖尖，在自來水下沖洗干凈，無菌條件下先用70％的酒精浸潤(rùn)組織15-20秒，再用2％的次氯酸鈉溶液浸泡4--5min，然后用無菌水沖洗3次。把消毒好的芽放在解剖鏡下仔細(xì)剝離，逐層剝?nèi)ビ兹~，露出圓滑的生長(zhǎng)點(diǎn)，可以留1-2個(gè)葉原基，0.2—0.3毫米，隨即接種于MS液體培養(yǎng)基上，每升加0.1mgNAA、0.2mgGA3、0.5BA，2%蔗糖，pH值5.8。培養(yǎng)條件：21~25℃、2000-3000lx、12h/d。2-3周愈傷，4-5周綠點(diǎn)，3--6月長(zhǎng)成2-3厘米小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。（2）繼代和生根培養(yǎng)成功的馬鈴薯脫毒苗，經(jīng)ELISA（試劑盒）鑒定后（試管苗應(yīng)每3月檢測(cè)一次，每年4次）鑒定后，采用固體、液體培養(yǎng)基相結(jié)合方法擴(kuò)繁。取試管苗單節(jié)切段扦插在（或平放）固體培養(yǎng)基上，每瓶可插20個(gè)左右莖段，經(jīng)20d左右發(fā)育成5~10cm高小植株，繼續(xù)進(jìn)行切段繁殖，此法速度快，每月可繁殖5~8倍，試管苗多節(jié)接種在液體培養(yǎng)基上，進(jìn)行淺層靜止液體培養(yǎng)。培養(yǎng)基：MS+NAA0.2-0.5+D-泛酸鈣10，3%蔗糖，20-25度，3000-4000LX，14-16小時(shí)光照，每3周繼代一次，單芽莖段約1厘米，可插也可平放，原則試管苗用2年—3年。

(3)馴化為增強(qiáng)試管苗對(duì)溫室內(nèi)環(huán)境條件的適應(yīng)能力，移植前對(duì)試管苗要進(jìn)行光、溫鍛煉。煉苗期溫室內(nèi)的溫度：白天23~27℃，夜間不低于14℃。煉苗的具體方法是：移植前7d左右，將長(zhǎng)有3~5片葉、高2~3cm的試管苗，在不開瓶口的狀態(tài)下，從培養(yǎng)室移至溫室排好。為防止強(qiáng)光、高溫灼傷試管苗，在溫室頂上加蓋一層黑色遮陽網(wǎng)。3.脫毒苗切繁基礎(chǔ)苗成活進(jìn)入正常后便可切繁，但切繁量的多少和質(zhì)量的高低，除與前邊提到的水與溫濕度條件有關(guān)外，能否掌握正確的切繁方法和適宜的切繁苗齡也是非常重要的。脫毒苗切繁主要是剪取頂部芽尖莖段（主莖芽尖和腋芽芽尖）直接扦插。微型薯生產(chǎn)：網(wǎng)室內(nèi)，鋪6厘米蛭石，3%撒可富稀釋一倍，噴潮濕即可。插前澆水濕潤(rùn)，插后澆透。覆膜一周（但不要壓緊），濕度80%以上，期間噴水2次。揭膜后噴營(yíng)養(yǎng)液撒可富3%，噴水沖洗（每周2次），每周噴一次0.5%硫酸銅（葉面），中后期噴藥防病，防早疫、晚疫病，連續(xù)噴2-3-4次。噴辛硫磷防害蟲。苗高6—8厘米培蛭石防綠薯，1-2厘米厚，約35-40天出現(xiàn)氣生薯，不斷蓋蛭石。四、馬鈴薯無病毒苗的鑒定材料1、指示植物鑒定在馬鈴薯的病毒鑒定中，汁液鑒定是最常用的方法，Ｘ病毒、Ｓ病毒和紡錘塊狀病毒很容易通過汁液來接種。2、鑒定寄主的準(zhǔn)備馬鈴薯常用的鑒定寄主植物有莧科的千日紅，茄科的洋酸漿、毛曼佗羅等。寄主植物應(yīng)在無蟲網(wǎng)室中培養(yǎng)。３.接種液制備及接種葉片洗凈后。在消毒的研缽中研成糊狀，用紗布濾出汁液，再用蒸餾水稀釋１０倍作為接種物，在鑒定寄主植物的葉面，６００目的金剛砂混入接種物中，然后用左手心緊靠在寄主的背面，以右手實(shí)指蘸取接種液，均勻的在葉背面擦過，以不造成葉片產(chǎn)生傷痕為度，最后把葉面上多余的接種物用清水沖洗干凈，放置在１５～２４的防蟲室中，一般５－１０天可發(fā)病。

五、馬鈴薯無病毒株的繁殖和保存1．無病毒株的繁殖通過莖尖培養(yǎng)只能得到很少的無病毒植株，而生產(chǎn)上需要數(shù)以萬計(jì)的健康種薯。同時(shí)無病毒植株并沒有對(duì)該病毒獲得免疫能力，仍會(huì)在繁殖中再次侵染。如何在以后繁殖中防止受病毒再侵染是很關(guān)鍵的一環(huán)。目前在生產(chǎn)上來用的方法很多，下面介紹主要的幾種。（１）直接塊莖繁殖（２）扦插繁殖（３）組織培養(yǎng)切段繁殖

A：繼代培養(yǎng)

B：低溫保存復(fù)習(xí)思考題（１）對(duì)馬鈴薯脫毒苗的培養(yǎng)大致分幾個(gè)階段？各階段是怎樣操作的？（２）馬鈴薯的生物學(xué)習(xí)性有哪些？培養(yǎng)苗木的不良表現(xiàn)及改進(jìn)措施

捕蠅草原產(chǎn)于北美洲東南部，首先在美國(guó)北卡羅來納州被發(fā)現(xiàn)。進(jìn)化論的創(chuàng)始人達(dá)爾文曾描述過這種有趣的植物，稱其為“愛神的蒼蠅夾子”。在市場(chǎng)上，一盆捕蠅草價(jià)格達(dá)200多元，比一般的花卉價(jià)格高出許多。該草高不過15厘米，兩片酷似蚌殼的綠色葉瓣每片長(zhǎng)約5厘米，內(nèi)側(cè)有三跟尖銳的“硬刺”，排列成三角形。當(dāng)蚊蠅爬入葉內(nèi)觸動(dòng)“硬刺”時(shí)，“硬刺”不僅能運(yùn)動(dòng)，還能引起葉瓣閉合，而葉瓣邊緣長(zhǎng)滿的小毛刺則能防止蚊蠅逃走。隨后，葉面和葉緣的腺毛產(chǎn)生感應(yīng)運(yùn)動(dòng)，閉合的葉片產(chǎn)生黏液，將蚊蠅消滅后再打開。

據(jù)悉，屠墚和妻子胡玲兩年前畢業(yè)于金華生物工程學(xué)院園藝專業(yè)，去年兩人放棄外地舒適的工作，回家進(jìn)行植物組織培養(yǎng)，先后投入20余萬元購(gòu)置實(shí)驗(yàn)設(shè)備，目前已成功培育出捕蠅草，預(yù)計(jì)今年夏季就可裝盆供應(yīng)市場(chǎng)。初始培養(yǎng)階段

1.培養(yǎng)物水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯

可能原因：表面殺菌劑過量，消毒時(shí)間過長(zhǎng)，外植體選用不當(dāng)（部位或時(shí)期）。

改進(jìn)措施：

調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度，縮短消毒時(shí)間，試用其他部位，生長(zhǎng)初期取材。

2.培養(yǎng)物長(zhǎng)期培養(yǎng)幾乎無反應(yīng)

可能原因：基本培養(yǎng)基不適宜，生長(zhǎng)素不當(dāng)或用量不足，溫度不適宜。

改進(jìn)措施：更換基本培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分，尤其是調(diào)整鹽離子濃度，增加生長(zhǎng)素用量，試用2,4-D，調(diào)整培養(yǎng)溫度。3.愈傷組織生長(zhǎng)過旺、疏松，后期水浸狀

可能原因：激素過量，溫度偏高，無機(jī)鹽含量不當(dāng)。

改進(jìn)措施：減少激素用量，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整無機(jī)鹽（尤其是銨鹽）含量，適當(dāng)提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度。4.愈傷組織太緊密、平滑或突起，粗厚，生長(zhǎng)緩慢

可能原因：細(xì)胞分裂素用量過多，糖濃度過高，生長(zhǎng)素過量。

改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，調(diào)整細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例，降低糖濃度。

5.側(cè)芽不萌發(fā),皮層過于膨大,皮孔長(zhǎng)出愈傷組織

可能原因:枝條過嫩,生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素用量過多。

改進(jìn)措施：減少激素用量，采用較老化枝條。

繼代培養(yǎng)階段

1.苗分化數(shù)量少、速度慢、分枝少、個(gè)別苗生長(zhǎng)細(xì)高

可能原因：細(xì)胞分裂素用量不足，溫度偏高，光照不足。

改進(jìn)措施：增加細(xì)胞分裂素用量，適當(dāng)降低溫度，改善光照，改單芽繼代為團(tuán)塊（叢芽）繼代。2.苗分化過多，生長(zhǎng)慢，有畸形苗，節(jié)間極短，苗叢密集，微型化

可能原因：細(xì)胞分裂素用量過多，溫度不適宜。

改進(jìn)措施：減少或停用細(xì)胞分裂素一段時(shí)間，調(diào)節(jié)溫度。

3.分化率低,畸形,培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)苗再次愈傷組織化

可能原因:生長(zhǎng)素用量偏高,溫度偏高。

改進(jìn)措施：減少生長(zhǎng)素用量，適當(dāng)降溫。4.葉粗厚變脆

可能原因：生長(zhǎng)素用量偏高，或兼有細(xì)胞分裂素用量偏高。

改進(jìn)措施：適當(dāng)減少激素用量，避免葉片接觸培養(yǎng)基。

5.再生苗的葉緣、葉面等處偶有不定芽分化出來

可能原因：細(xì)胞分裂素用量偏高，或表明該種植物適于該種再生方式。

改進(jìn)措施：適當(dāng)減少細(xì)胞分裂素用量，或分階段地利用這一再生方式。6.叢生苗過于細(xì)弱，不適于生根或移栽

可能原因：細(xì)胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當(dāng)，溫度過高，光照短，光強(qiáng)不足，久不轉(zhuǎn)移，生長(zhǎng)空間窄。

改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，免用赤霉素，延長(zhǎng)光照時(shí)間，增強(qiáng)光照，及時(shí)轉(zhuǎn)接，降低接種密度，更換封瓶紙的種類。7.幼苗淡綠，部分失綠

可能原因：無機(jī)鹽含量不足，PH值不適宜，鐵、錳、鎂等缺少或比例失調(diào)，光照、溫度不適。

改進(jìn)措施：針對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素虧缺情況調(diào)整培養(yǎng)基，調(diào)好PH值，調(diào)控溫度、光照。8.幼苗生長(zhǎng)無力、發(fā)黃落葉、有黃葉、死苗夾于叢生苗中

可能原因：瓶?jī)?nèi)氣體狀況惡化，PH值變化過大，久不轉(zhuǎn)接導(dǎo)致糖已耗盡，營(yíng)養(yǎng)元素虧缺失調(diào)，溫度不適，激素配比不當(dāng)。

改進(jìn)措施：及時(shí)轉(zhuǎn)接、降低接種密度，調(diào)整激素配比和營(yíng)養(yǎng)元素濃度，改善瓶?jī)?nèi)氣體狀況，控制溫度。生根階段

1.培養(yǎng)物久不生根，基部切口沒有適宜的愈傷組織

可能原因：生長(zhǎng)素種類、用量不適宜；生根部位勇氣不良；生根程序不當(dāng)；PH值不適，無機(jī)鹽濃度及配比不當(dāng)。

改進(jìn)措施：改進(jìn)培養(yǎng)程序，選用適宜的生長(zhǎng)素或增加生長(zhǎng)素用量，適當(dāng)降低無機(jī)鹽濃度，改用濾紙橋液培養(yǎng)生根等。2.愈傷組織生長(zhǎng)過快、過大，根莖部腫脹或畸形，幾條根并聯(lián)或愈合。

可能原因：生長(zhǎng)素種類不適，用量過高，或伴有細(xì)胞分裂素用量過高，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)程序不對(duì)。

改進(jìn)措施：調(diào)換生長(zhǎng)素種類或幾種生長(zhǎng)素配合使用，降低使用濃度，附加VB2或PG等減少愈傷，改變生根培養(yǎng)程序等。水果作物的組織培養(yǎng)第一節(jié)草莓的組織培養(yǎng)一、形態(tài)特性和生物學(xué)特性草莓為重要的漿果植物，栽培分布很廣，其總產(chǎn)量在漿果類中僅次于葡萄，居世界第二位。草莓果實(shí)柔軟多汁，含豐富的糖、酸、礦物質(zhì)，維生素等。草莓可鮮食，也可加工成果醬，果酒等。其顏色鮮艷，是良好的配餐食品。草莓繁殖容易，結(jié)果早，收效快。尤其是近年的促成栽培，利用塑料大棚、日光溫室，使草莓的成熟期大大縮短，從11月份到次年的6月份，都有新鮮的草莓上市，填補(bǔ)了水果的淡季市場(chǎng)。1.形態(tài)特性草莓屬多年生草本植物，植株矮小，呈半平臥叢狀生長(zhǎng)，須根系，在土壤中分布較淺。草莓的莖呈短縮狀，分地上和地下部分，地上短縮莖節(jié)間極短，節(jié)密集，其上密集輪生葉片，葉腋部位著生腋芽。地下短縮莖為多年生，是貯藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的器官，也可發(fā)育成不定根。匍匐莖是草莓的特殊地上莖，是其營(yíng)養(yǎng)繁殖器官，莖細(xì)，節(jié)間長(zhǎng)，一般座果后期發(fā)生。葉屬于基生三出復(fù)葉，呈螺旋狀排列，在當(dāng)年生新莖上總?cè)~柄部與新莖連接部分，有兩片托葉頂端膨大，圓錐形且肉質(zhì)化。離生雄蕊20~35枚。雌蕊離生，呈螺旋狀排列在花托上，數(shù)目從60~600不等?；ㄐ?yàn)槎缇蹅慊ㄐ蛑炼嗥缇蹅慊ㄐ颉９麑?shí)為假果，主要是花托膨大肉質(zhì)化形成，瘦果以聚合果形成生于花托上。果實(shí)成熟時(shí)果肉紅色，粉紅色或白色。2.生物學(xué)習(xí)性草莓根系在土壤溫度達(dá)到2℃時(shí)開始活動(dòng)，在10℃時(shí)開始形成新根，根系生長(zhǎng)的最適溫度為15~20℃，秋季溫度降低到7~8℃時(shí)生長(zhǎng)減弱。春季氣溫達(dá)5℃時(shí)植株開始萌芽，莖葉開始生長(zhǎng)。草莓的根系分布較淺，加上植株矮小，葉片較大，因此蒸發(fā)量大。在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)，葉片幾乎都在不斷地進(jìn)行老葉死亡、新葉發(fā)生的過程，葉片更新頻繁。

草莓是喜光植物但又比較耐陰。光照充足，植物生長(zhǎng)旺盛，葉片顏色深，花芽發(fā)育好，能獲得較高的產(chǎn)量。相反光照不良，植株生長(zhǎng)勢(shì)弱，葉柄及花序柄細(xì)。葉片色淺，花朵小，果實(shí)小，著色不良。這些特點(diǎn)，決定了草莓對(duì)水分要求較高，但在不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，對(duì)水分的要求不同。開花期土壤的含水量應(yīng)不低于最大田間持水量的70%。果實(shí)膨大及成熟期土壤含水量應(yīng)不低于80%，而秋季9，10月份，土壤持水量達(dá)60%即可，草莓不耐澇，要求土壤既有充足的水分供應(yīng)，又要有良好的通氣條件。草莓對(duì)土壤適應(yīng)性強(qiáng)，在各種土壤上都能生長(zhǎng)。但由于是淺根性作物，要求肥沃、疏松、透水、通氣的中性微酸性或微堿性土壤。二、草莓脫毒苗的培養(yǎng)1.熱處理脫毒將草莓植株在40~41℃溫度下處理4~6周，然后取微莖尖培養(yǎng)。2.微莖尖脫毒(1)初代培養(yǎng)：下午取草莓匍匐莖上的頂芽，用自來水流水沖洗2~4h，然后剝?nèi)ネ鈱尤~片，在無菌條件下，用0.5%次氯酸鈉溶液表面消毒5min，并不停地?cái)噭?dòng)促進(jìn)藥液的滲透。在無菌條件和解剖顯微鏡下剝?nèi)∏o尖分生組織，以帶有一個(gè)葉原基的莖尖為度。0.2mm的莖尖無病毒率可達(dá)到100%，但接種后的成活率下降，并延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。莖尖分離后，迅速接入MS+BA0.25+NAA0.25或MS+BA0.5+NAA0.2培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為22~25℃，光照16~18h，3000lx。經(jīng)2~3個(gè)月的培養(yǎng)，可生長(zhǎng)分化出芽叢。注意在低溫和短日照下，莖尖有可能進(jìn)入休眠，所以較高的溫度和充足的光照時(shí)間必須保證。(2)繼代培養(yǎng)把芽叢割成芽叢小塊，轉(zhuǎn)入MS+BA0.5+NAA0.01培養(yǎng)基中,待苗長(zhǎng)大到1~2cm時(shí)，可將芽叢小塊分成單株，再轉(zhuǎn)入前述的分化培養(yǎng)基中，又會(huì)重復(fù)上述過程，達(dá)到擴(kuò)大繁殖的目的。(3)生根培養(yǎng)1/2MS+IBA0.1生根。(4)馴化：用鑷子把草莓苗從試管瓶中取出，洗掉根系附帶瓊脂培養(yǎng)基。事先備好8×8cm或6×6cm的塑料營(yíng)養(yǎng)缽，內(nèi)裝等量的腐殖土和河砂。栽前壓實(shí)，澆透水，用竹簽在缽中央打一小孔，將試管苗插入其中，壓實(shí)苗基部周圍基質(zhì)，栽后輕澆薄水，以利幼苗基部和基質(zhì)密合。要“深栽淺埋”，即根要深栽、根莖略高于地面。栽后的試管苗要培養(yǎng)在濕度較大的空間內(nèi)，一般加設(shè)小拱棚保濕，并經(jīng)常澆水，以增加棚內(nèi)濕度，以見到塑料薄膜內(nèi)表面分布均勻的小水珠為宜。約過7~10d后。當(dāng)檢查有一定的根系生出，可逐漸降低濕度和土壤含水量，進(jìn)入正常幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育管理階段。3．花藥培養(yǎng)花藥培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，因經(jīng)愈傷組織途徑，再分化得到的即為無病毒苗，所以可免去病毒鑒定工作。（1）取材與培養(yǎng)取花粉發(fā)育單核期的花蕾，置于潔凈培養(yǎng)皿中，內(nèi)放一層濾紙，滴蒸餾水?dāng)?shù)滴保濕。將處理放入3~4℃冰箱中低溫保存3~4d。經(jīng)預(yù)處理的花蕾先在70%酒精中浸泡半分鐘，取出放入新配制的飽和漂白粉上清液中消毒10min，用無菌水沖洗3次。然后在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)』ㄋ?，立即接種?；ǚ郯l(fā)育時(shí)期可采用醋酸洋紅壓片鑒定。培養(yǎng)基為MS+2，4-D0.4+IAA2。去分化階段培養(yǎng)條件為24~26℃，10h/d，1500lx,20d后可產(chǎn)生乳白色的愈傷組織。（2）植株分化將誘導(dǎo)出的花藥愈傷組織轉(zhuǎn)移到1/2MS基本培養(yǎng)基，添加GA0.5，BA0.5和三十烷醇4。愈傷組織經(jīng)培養(yǎng)后很快轉(zhuǎn)綠，以后微帶淡紫紅色，15d后在表面分化出半球形小突起，轉(zhuǎn)為綠色。20d后分化出幼葉、幼莖，并有不少突起物，以后陸續(xù)分化出新梢。四、草莓無病毒苗的鑒定草莓花藥培養(yǎng)得到的為無病毒苗，而用生長(zhǎng)點(diǎn)培養(yǎng)得到的植株，則必須經(jīng)過病毒鑒定，確定其不帶病毒，才可以大量繁殖，用于生產(chǎn)。1.草莓病毒的種類草莓病毒主要有四種，為斑駁病毒，皺葉病毒，脈結(jié)病毒和輕型黃邊病毒。2.草莓病毒的鑒定方法因草莓的病毒通過汁液接種不感染，所以通常采用小葉嫁接法來進(jìn)行鑒定。首先從被鑒定的草莓采集長(zhǎng)成不久的新葉，除去兩邊的小葉，中央的小葉帶1~1.5cm的葉柄，把它削成楔形作接穗。而指示植物則除去中間的小葉，在葉柄的中央用刀切入1~1.5cm，再插入接穗，用線把接合部位包扎好。為了防止干燥，在接合部位涂上少量的凡士林。為保證成活，在2周內(nèi)，可罩上塑料袋，置于半見光的場(chǎng)所。約經(jīng)2周時(shí)間，撤去塑料袋。若帶有病毒，嫁接后1~2個(gè)月，在新展開的葉、匍匐莖或老葉上會(huì)出現(xiàn)病癥。指示植物待鑒定植物嫁接后的植物指示植物接穗五、草莓無病毒苗的繁殖和利用1.防止蚜蟲的危害草莓無病毒苗的繁殖重要的是要防止無病毒苗的再度污染。由于草莓病毒主要是蚜蟲傳播的，所以要搞好防蚜蟲工作。草莓病毒通過蚜蟲吸吮汁液而得到傳播，短時(shí)間即可完成。防治時(shí)可使用馬拉松乳劑，氧化樂果乳劑等接觸殺蟲劑，防治期5~6月，9~10月，特別是9~10月一次，可防止蚜蟲的越冬。為保證種苗的無病毒，在原種種苗生產(chǎn)階段，應(yīng)在隔離網(wǎng)室中進(jìn)行。傳播草莓病毒的蚜蟲較小，可以通過大于1mm網(wǎng)眼，故應(yīng)采用0.4~0.5mm大小的規(guī)格，其中以300號(hào)防蟲網(wǎng)為好。2．繁殖程序及提高繁殖率的措施草莓無病毒苗的繁殖程序可分五步，包括：脫病毒鑒定生產(chǎn)出無毒苗、原種種苗培養(yǎng)、原種種苗繁殖、良種種苗繁殖，生產(chǎn)用苗繁殖和栽培苗繁殖，前四步在隔離室中進(jìn)行，后一步在露地進(jìn)行。為提高無病毒母株的繁殖株數(shù)可采用赤霉素處理和摘蕾的方法。在5月上旬和6月上旬分兩次進(jìn)行。摘蕾可減輕母株的營(yíng)養(yǎng)負(fù)擔(dān)，促進(jìn)匍匐莖的大量發(fā)生，田間地每一株可繁殖150~200株。第二節(jié)葡萄的組織培養(yǎng)組培苗一、形態(tài)特征和生物學(xué)習(xí)性葡萄在全世界的果品生產(chǎn)中，產(chǎn)量及栽培面積一直居于首位。其果實(shí)除作為鮮果食用外，主要用于釀酒，還可制成葡萄汁、葡萄干和罐頭等加工品。葡萄不僅味美可口，而且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。成熟的漿果中含有15%~25%的葡萄糖和果糖以及多種對(duì)人體有益的礦物質(zhì)和維生素。(1)形態(tài)特性。葡萄屬落葉木質(zhì)藤本植物，葡萄地上部分的莖細(xì)長(zhǎng)柔弱，髓部較大，組織較疏松。節(jié)上具有卷須，使新梢可以纏繞其他樹木或支架上向上攀援。葉近圓型或卵型，3~5裂，基部心形。圓錐花序。(2)生物學(xué)習(xí)性：葡萄是深根性作物，大多數(shù)情況下，根系垂直分布最密集的范圍，是在20~80cm的深度內(nèi)，但在不同的栽培管理?xiàng)l件下，根系的分布也將隨著發(fā)生變化。葡萄的根富含肉質(zhì)，髓射線發(fā)達(dá)，能貯藏大量的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如糖、蛋白質(zhì)和單寧等。葡萄的枝蔓上很容易產(chǎn)生不定根，故在生產(chǎn)上多采用扦插法繁殖。在大氣潮濕的情況下，枝蔓上往往長(zhǎng)出氣生根。葡萄原產(chǎn)于溫帶地區(qū)，不太抗寒。葡萄的根系抗寒力很弱，大部分歐洲種葡萄的根系在－5~－7℃時(shí)即受凍，某些美洲種能忍受－11~－12℃左右的低溫。二、葡萄的組織培養(yǎng)1.選材接種從田間生長(zhǎng)旺盛的葡萄新梢頂端取1~2㎝的莖尖。除去幼葉后在5%次氯酸鈉溶液中浸泡2~3min，消毒滅菌，以后用無菌水沖洗3次，再在0.1%升汞溶液中浸泡約2min，以后用無菌水沖洗4次。在無菌條件下分離出約2㎜長(zhǎng)的莖尖，接種到培養(yǎng)基上。2.培養(yǎng)基葡萄莖尖分化培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基（無機(jī)鹽減半為好），再添加BA1~2，NAA0.01，LH100，蔗糖2%，瓊脂0.6%。3.莖尖的分化葡萄1~2㎜莖尖接種后成活率較高，接種成活的莖尖1個(gè)月左右開始分化幼葉和側(cè)芽，2個(gè)月左右，由于側(cè)芽的不斷增生，形成芽叢。由于不同品種對(duì)BA和NAA的反應(yīng)不同，故生長(zhǎng)有明顯區(qū)別，巨峰、大粒白香蕉、赤霞珠等品種，由于頂端優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，側(cè)芽生長(zhǎng)勢(shì)弱，故增殖率低，但成苗率高；白羽、貴人香等大多數(shù)品種側(cè)芽分生能力強(qiáng)，可在幼莖上多次分枝，故成苗率低。4.莖尖苗的生長(zhǎng)在莖尖分化培養(yǎng)中產(chǎn)生的成苗率低和成苗困難，密集生長(zhǎng)的芽叢，可將分化培養(yǎng)基中的BA濃度減低至0.5，同時(shí)添加GA30.2，則經(jīng)1個(gè)月的培養(yǎng)，就可長(zhǎng)成2~3㎝高的幼莖。此外黑暗處理對(duì)幼莖的伸成，提高成苗率，也有明顯的效果。5、生根與移栽切取2~3cm的莖尖苗，接種到MS+IAA0.4+NAA0.05培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，1~~2周后幼苗開始生根，1個(gè)月形成完整的根系，同時(shí)具備5~6片新葉。移栽時(shí)洗去根上的培養(yǎng)基，栽到蛭石基質(zhì)內(nèi)，使根系具有良好的通氣條件，蓋上塑料薄膜，經(jīng)7~10d鍛煉適應(yīng)后可去掉，移栽成活率在90%左右。提高葡萄試管苗移栽成活率要注意：1、幼苗生長(zhǎng)要健壯；2、要保持空氣濕度；3、根際通氣良好；4、要盡量減少雜菌污染；5、澆灌的溶液濃度不能過高。三、葡萄無病毒苗的培養(yǎng)葡萄受到26種病毒的危害。由于病毒的危害，葡萄的長(zhǎng)勢(shì)減弱，產(chǎn)量降低，果實(shí)的糖分含量減少，風(fēng)味變劣。葡萄卷葉病是危害最大的病毒病，在不同品種上表現(xiàn)不同，但多數(shù)葉片變紅，自基部起向內(nèi)卷，似革質(zhì)增厚，粗糙易脆；有的葉脈綠色，葉肉黃色；有的品種則表現(xiàn)矮化。此病可減產(chǎn)10~50%，造成果實(shí)糖分含量降低，成熟期推遲2周，紫葡萄果色變綠。現(xiàn)在已廣泛用莖尖組織培養(yǎng)和熱處理結(jié)合的方法來培育葡萄無病毒苗。莖尖脫毒的方法也兼有短期大量繁殖的作用，所以應(yīng)用上具有很大的意義。1、熱處理理脫毒2、組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)從被病毒感染的植株上取材，在5℃下冷藏保存。以后在25℃，相對(duì)濕度80%，16h的長(zhǎng)日照條件下水培。再?gòu)拈L(zhǎng)出新芽經(jīng)消毒后切取莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，大小約0.2~0.3mm（帶一個(gè)葉原基）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以1/2MS，添加NAA0.1，BA1.0，Kt0.5，腺嘌呤4.0，蔗糖30g/L，瓊脂6.0，pH5.8為好。無病毒苗的大量繁殖處于小葉展開期的材料，莖葉常集中在一起，成為叢狀，可以一個(gè)個(gè)進(jìn)行分離，再接種到1/2MS培養(yǎng)基上，添加IAA0.2，BA1，KT0.6，腺嘌呤4.0，蔗糖15g/L的培養(yǎng)基，即可使小葉展開、伸長(zhǎng)，得到植株。這樣反復(fù)繼代培養(yǎng)，可繁殖得到大量的無病毒苗。第三節(jié)無花果的組織培養(yǎng)新疆無花果一、特性和生物學(xué)習(xí)性1、形態(tài)特征無花果為?？啤o花果屬的落小喬木，是一種亞熱帶果樹，葉掌狀3~5裂，大而粗糙，背面被柔毛。花單性，隱于囊狀總花花托內(nèi)，果實(shí)由總花托和其他花器官組成，呈扁圓狀或卵形，成熟后頂端開裂，肉質(zhì)柔軟，味甜。具有觀賞和藥用兼?zhèn)涞膬r(jià)值。2、生物學(xué)特性用無性繁殖法繁殖的無花果，通常于栽植后2~3年開始結(jié)果。6~7年進(jìn)入盛果期。以后樹冠不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量逐漸增長(zhǎng)，經(jīng)濟(jì)年限可延續(xù)40~70年，甚至100年。無花果的生長(zhǎng)勢(shì)很強(qiáng)。幼樹的新梢或徒長(zhǎng)枝年生長(zhǎng)量可達(dá)到2m以上。無花果不耐寒，冬季溫度達(dá)-12℃時(shí)新梢頂端就開始受凍死亡。無花果能耐較高的溫度而不致受害二．無花果的莖段培養(yǎng)由于無花果扦插繁殖成活率低，用帶腋芽的莖段培養(yǎng)成完整植株，可以為大量繁殖提供途徑。無花果繁殖的方法是將采來的健壯的嫩莖削去大葉片，留下帶腋芽的莖段，切成3~4cm長(zhǎng)的小段，用流水沖洗3h,以清除表面污染物。然后放入75%酒精中，再用0.1%氯化汞消毒7~10分鐘，最后用無菌水沖洗4~5次，在無菌條件下將莖段橫切成長(zhǎng)約1cm，按原生長(zhǎng)方向接種到MS+BA0.5~1.0長(zhǎng)芽培養(yǎng)基中。8天后外植體接觸培養(yǎng)基的一端切口周圍長(zhǎng)出嫩綠色、質(zhì)地緊密的愈傷組織，同時(shí)腋芽展開，愈傷組織和腋芽的誘導(dǎo)率均為100%。叢生芽增殖培養(yǎng)基MS+BA1~2+NAA0.1-0.2中。腋芽萌生成綠色簇生狀，每個(gè)腋芽上可生出15~28個(gè)芽叢，逐漸長(zhǎng)成苗叢。當(dāng)一部分芽長(zhǎng)高至2~3cm時(shí)，切取單苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上MS+NAA0.2上，11天左右開始生根。20d左右長(zhǎng)成具有根系的完整植株，這時(shí)可取出移栽，成活率達(dá)98%。培養(yǎng)溫度23~31℃，12~14h/d，光照強(qiáng)度為1700~2400LX左右。若要繼代培養(yǎng)，只需將小苗剪下，用莖尖或帶腋芽的莖段接種到叢生芽增殖培養(yǎng)基上，即可得到以上的結(jié)果。環(huán)境條件在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、pH值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組織培養(yǎng)育苗的生長(zhǎng)和發(fā)育。溫度(temperature)因?yàn)闇囟仁侵参锝M織培養(yǎng)中的重要因素，所以植物組織培養(yǎng)在最適宜的溫度下生長(zhǎng)分化才能表現(xiàn)良好，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)都是在23～27℃之間進(jìn)行，一般采用25±2℃。低于15℃℃時(shí)培養(yǎng)，植物組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)停止，高于35℃時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同，百合的最適溫度是20℃、月季足25-27℃、番茄是28℃。溫度不僅影響植物組織培養(yǎng)育苗的生長(zhǎng)速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以28℃為最好，在120℃以下，33℃以上形成率皆最低。不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在30℃以下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25℃以下的高。桃胚在2—5℃條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35℃處理草莓的莖尖分生組織3—5d，可得到無病毒苗。光照(light)組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面1．光照強(qiáng)度(lightintensity)光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植體及細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。2．光質(zhì)(lightwave)光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，8周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15d后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。3．光周期(lightperiod)試管苗培養(yǎng)時(shí)要選用一定的光暗周期來進(jìn)行組織培養(yǎng)，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。研究表明，對(duì)短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長(zhǎng)日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時(shí)需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏飯樹的愈傷組織。濕度(humidity)濕度的影響包括培養(yǎng)容器保持和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉性較高的封口材料易引起透氣性受阻，也會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受影響。環(huán)境的相對(duì)濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求70%—80%的相對(duì)濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。濕度過低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高，進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行。濕度過高時(shí)，易引起棉塞長(zhǎng)霉，造成污染。滲透壓(penetratingpressure)

培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透壓的變化。通常1—2個(gè)大氣壓對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，2個(gè)大氣壓以上就對(duì)植物生長(zhǎng)有阻礙作用，而5—6個(gè)大氣壓植物生長(zhǎng)就會(huì)完全停止，6個(gè)大氣壓植物細(xì)胞就不能生存。pH值(pHvalue)不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適pH值的要求也是不同的(表2—1)，大多在5、6．5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。pH值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。以硝態(tài)氮作氮源和以銨態(tài)氮作氮源就不一樣，后者較高一些。一般來說當(dāng)pH值高于6．5時(shí)，培養(yǎng)基全變硬；低于5時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。因?yàn)楦邷販缇鷷?huì)降低pH值(約0.2—0.3個(gè)pH值)因此在配制時(shí)常提高pH值0．2—0．3單位。pH值大小調(diào)整可用0．1M的NaOH和0．IM的HCI來調(diào)整。lml的NaOH可使pH值升高0．2單位，lml的HCl可使pH值降低0．2單位。調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆?。種類最適pH值種類最適pH值杜鵑4.0月季5.8越桔4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄5.7

不同植物的最適pH值

氧氣(oxygen)氧氣是組織培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時(shí)要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進(jìn)活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時(shí)，要考慮振蕩的次數(shù)、振幅等，同時(shí)要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等第二節(jié)培養(yǎng)基的制備一、母液(stocksolution)的配制和保存在植物組織培養(yǎng)工作中，配制培養(yǎng)基是日常必備的工作。為簡(jiǎn)便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取，而且還便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，會(huì)產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液時(shí)要用蒸餾水或重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級(jí)較高的化學(xué)純或分析純。藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。母液的配制方法：?jiǎn)闻浞ǎ簩⑴囵B(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)?；炫浞ǎ簩最悹I(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可用amg/L表示，即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液aml.生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量95%酒精助溶。2，4—D可用O．1mol／L的NaOH或KOH助溶，加入溫水定容。生長(zhǎng)素常配成1mg／ml的溶液貯于冰箱中備用。細(xì)胞分裂素類一般先用少量1N鹽配溶解后，再加入溫水冷卻后定容，鐵鹽配法（MS為例）：在裝有400ml蒸餾水的燒杯中加入2粒苛性鈉，溶解后加入3.73gEDTA-Na2，加熱使其全部溶解，然后邊攪拌邊慢慢加入2.78gFeSO4.7H2O直至全部溶解，冷卻后定容至500ml，置于冰箱中備用。第三節(jié)培養(yǎng)基的選擇在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基(如Ms培養(yǎng)基或B5培養(yǎng)基)開始。當(dāng)通過一系列的實(shí)驗(yàn)，對(duì)這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后，即有可能得到一種能滿足實(shí)驗(yàn)需要的新培養(yǎng)基，選擇最佳培養(yǎng)基。常用試驗(yàn)方法主要有單因子試驗(yàn)、多因子試驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等。一、單因子試驗(yàn)在單因子試驗(yàn)中．由于培養(yǎng)基中其他成分都維持在一般水平上，所以只變動(dòng)一個(gè)因子，就可以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度。例如Ms基本培養(yǎng)基的其他成分和用量都不變，只變動(dòng)NAA用量對(duì)某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個(gè)因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。生物學(xué)試驗(yàn)不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗(yàn)中必需設(shè)置對(duì)照組與試驗(yàn)組，試驗(yàn)組可以有一組或幾組，隨試驗(yàn)的復(fù)雜性而設(shè)置，對(duì)照組也可能有一組以上。試驗(yàn)中要求對(duì)照組與試驗(yàn)組中的試驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊或其他培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗(yàn)結(jié)果是來源于試驗(yàn)因子，而不是由于試驗(yàn)材料的不一致導(dǎo)致的。試驗(yàn)中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。隨試驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)項(xiàng)目要有4—10瓶，每瓶至少3塊培養(yǎng)物或3叢小幼苗。2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合6-BAmg/L）00.52.5510NAA012345(mg/L)0.56789102.5111213141551617181920102122232425對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全試驗(yàn)方案具有均衡完全的特點(diǎn)，各個(gè)因子的每個(gè)水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究NAA和6—BA的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè)5個(gè)濃度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有25項(xiàng)處理的試驗(yàn)見表3—3。二、多因子試驗(yàn)完全試驗(yàn)方案試驗(yàn)因子越多，處理數(shù)越多，試驗(yàn)越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。為了減少試驗(yàn)處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗(yàn)信息，通常采用正交試驗(yàn)。例如，采用正交設(shè)計(jì)，在使用此表時(shí)就可以安排4個(gè)因子，3種水平的試驗(yàn)，一共做9種不同搭配的試驗(yàn)，其結(jié)果相當(dāng)于做了27次種種搭配的試驗(yàn)。正交試驗(yàn)雖然是多因素搭配在一起的試驗(yàn)，但是在試驗(yàn)結(jié)果的分析中，每一種因素所起的作用卻又能夠明白無誤地表現(xiàn)出來。因此，一次系統(tǒng)的試驗(yàn)結(jié)果，就可以把問題分析得清清楚楚，用有限的時(shí)間取得成倍的收獲。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時(shí)探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、糖和其他成分的用量。三、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法在植物組織分化與再生的研究中，在沒有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。在逐步添加時(shí)是使試驗(yàn)成功，在逐步減少時(shí)是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實(shí)用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡(jiǎn)化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡(jiǎn)單方法。四、廣譜實(shí)驗(yàn)法在廣譜實(shí)驗(yàn)法中，把培養(yǎng)基中所有組分分為4大類：無機(jī)鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素。對(duì)每一類物質(zhì)選定低(L)、中(M)、和高(H)3個(gè)濃度。4類物質(zhì)各3種濃度的自由組合即構(gòu)成了一項(xiàng)包括81個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)。在這81個(gè)處理中最好的一個(gè)可用4個(gè)字母表示。例如，一個(gè)包含中等濃度無機(jī)鹽，低等濃度生長(zhǎng)素、中等濃度細(xì)胞分裂素和高等濃度有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的處理即可表示為MLMH。達(dá)到這個(gè)階段，再試用不同類型的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素即可找到培養(yǎng)基的最佳配方。這是因?yàn)椴煌愋偷纳鶮素和細(xì)胞分裂素對(duì)不同植物的活性有所不同。第四章操作技術(shù)

第一節(jié)滅菌和接種滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點(diǎn)，無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺(tái)表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時(shí)不有，無孔不人。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體(當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的)，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小得多。菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴(yán)格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺(tái)、等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無菌操作。常用的滅菌方法常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。濕熱滅菌（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在o．1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O．05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0．1MPa時(shí)壓力0．1-0．15MPa，20min。對(duì)高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長(zhǎng)滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨意延長(zhǎng)時(shí)間。對(duì)于一些布制品，如實(shí)驗(yàn)服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌前后的培養(yǎng)基，其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。在高壓滅菌前用堿調(diào)高pH值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于2個(gè)pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會(huì)使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0．43倍。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5，其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng)，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達(dá)5%。防止高壓滅菌培養(yǎng)基變化的方法：(1)經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，及時(shí)采取有效措施。(2)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意pH值對(duì)高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。(3)配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。(4)注意高壓滅菌后培養(yǎng)基pH值的變化及回復(fù)動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。這樣在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。灼燒滅菌（用于無菌操作的器械）在無菌操作時(shí)，把鑷子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180~C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱水平，通常采用170℃持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到頂定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對(duì)流和穿透，到指定時(shí)間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)）一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45μm以下，當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。使用前對(duì)其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，將待過濾的液體裝入注射器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。紫外線和熏蒸滅菌（空間）(1)紫外線滅菌在接種室、超凈臺(tái)上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長(zhǎng)為200—300nm，其中以260nm的殺菌能力最強(qiáng)，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。(2)熏蒸滅菌用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡(jiǎn)便，只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按5—8ml／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛?；瘜W(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競(jìng)爭(zhēng)其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%—1%的新潔爾滅也可以。植物材料表面用消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)—吐溫。第二步是對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌。要在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤(rùn)時(shí)間不能過長(zhǎng)。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長(zhǎng)的時(shí)間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1—2種使用見表。滅菌劑使用濃度(%)持續(xù)時(shí)間（min）去除的難易效果次氯酸鈣9~105~30易很好次氯酸鈉25~30易很好氯化汞0.1~15~8較難最好抗菌素4~50mg/L30~60中較好常用滅菌劑使用濃度及效果比較表上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達(dá)到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗3—4次即可；由于用升汞液滅菌的材料，難以對(duì)升汞殘毒較難去除，所以應(yīng)當(dāng)用無菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。滅菌時(shí)，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒人消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前1—2min，開始把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時(shí)間是從倒人消毒液開始，至倒入無菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。在滅菌溶液中加吐溫—80或TntonX效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸人到滅菌的材料表面。但吐溫加人后對(duì)材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的O.5%，即在100ml加入15滴。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。二、無菌操作接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%—3%的高錳酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進(jìn)行：(1)在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌；(2)在接種前20min，打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；(3)接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等；(4)上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺(tái)面；(5)先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿要過火烤干；(6)接種時(shí)，接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；(7)接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外燈滅菌30min。若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。三、接種(1)將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或?yàn)V紙上。(2)材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓琹—2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(3)用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管囗靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1—3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，通過統(tǒng)計(jì)認(rèn)為：對(duì)外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培養(yǎng)基和人力，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄，接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包囗紙里面也要過火。第二節(jié)培養(yǎng)和馴化指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長(zhǎng)，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。1．培養(yǎng)方法

(1)固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡(jiǎn)單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長(zhǎng)速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。(2)液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動(dòng)或振動(dòng)培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復(fù)式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行培養(yǎng)，其速度一般為50-100r／min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。2．培養(yǎng)步驟

(1)初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時(shí)，常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細(xì)胞分裂素和少量的生長(zhǎng)素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為：1)頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細(xì)胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動(dòng)生長(zhǎng)，從而形成一個(gè)微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個(gè)月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個(gè)枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復(fù)芽——苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進(jìn)行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時(shí)，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進(jìn)行接種。在實(shí)際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長(zhǎng)，有直立向上的莖梢，擴(kuò)繁時(shí)主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會(huì)生出不定芽，形成芽叢。2)不定芽的發(fā)育在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細(xì)胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性(這與胚狀體不同)。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個(gè)器官上長(zhǎng)出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當(dāng)在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營(yíng)養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲(chǔ)藏器官能強(qiáng)烈地發(fā)生不定芽，用臼合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。在不定芽培養(yǎng)時(shí)，也常用誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進(jìn)行繁殖，如非洲菊、草莓等。3)體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細(xì)胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形、心形、魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時(shí)期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細(xì)胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細(xì)胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生。(2)繼代培養(yǎng)在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需要進(jìn)一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢(shì)。繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴(kuò)繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當(dāng)數(shù)量的無根苗，最后能達(dá)到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級(jí)數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng)10代將生成210株苗。繼代培養(yǎng)中擴(kuò)繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長(zhǎng)的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡(jiǎn)便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MS0基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小，可先切成芽叢小塊，放人MS0培養(yǎng)基中，待到稍大時(shí)，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。增殖使用的培養(yǎng)基對(duì)于一種植物來說每次幾乎完全相同．由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競(jìng)爭(zhēng)，所以能夠按幾何級(jí)數(shù)增殖；；在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個(gè)必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進(jìn)行過程。但在達(dá)到相當(dāng)?shù)臄?shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是貯備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)的問題及解決方法初代培養(yǎng)外植體的褐變外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時(shí)甚至?xí)拐麄€(gè)培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細(xì)胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會(huì)產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，就會(huì)抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。褐變的主要原因①植物品種研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對(duì)不同的品種分別進(jìn)行處理。②生理狀態(tài)由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴(yán)重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴(yán)重。③培養(yǎng)基成分濃度過高的無機(jī)鹽會(huì)使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細(xì)胞分裂素的水平過高也會(huì)刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。④培養(yǎng)條件不當(dāng)如果光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法①選擇合適的外植體一般來說，最好選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。②合適的培養(yǎng)條件無機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。③使用抗氧化劑在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。④連續(xù)轉(zhuǎn)移對(duì)容易褐變的材料可間隔12~24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。繼代培養(yǎng)時(shí)材料的玻璃化實(shí)踐表明，當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會(huì)使試管苗生長(zhǎng)緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。因?yàn)槌霈F(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為：

①增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢(shì)；

②減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；

③增加光照；④增加容器通風(fēng)，最好進(jìn)行CO2施肥，這對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；

⑤降低培養(yǎng)溫度，進(jìn)行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生；

⑥降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。

3．生根培養(yǎng)當(dāng)材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時(shí)將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去，就會(huì)使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費(fèi)。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個(gè)過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)可采用1／2或者1/4MS培養(yǎng)基，全部去掉細(xì)胞分裂素，并加入適量的生長(zhǎng)素(NAA、IBA等)。誘導(dǎo)生根方法：①將新梢基部浸入50或100×10-6IIBA溶液中處理4—8h；②在含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6d；③直接移入含有生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基中。上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根，但前二種方法對(duì)新生根的生長(zhǎng)發(fā)育則更為有利。而第三種對(duì)幼根的生長(zhǎng)有抑制作用。其原因是當(dāng)根原始體形成后較高濃度生長(zhǎng)素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長(zhǎng)發(fā)育。不過這種方法比較可行。另外也可采用下列方法就可生根：①延長(zhǎng)在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間；②有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量(即將增殖與生根合并為一步)；③切割粗壯的嫩枝在營(yíng)養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段。可以省去一次培養(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長(zhǎng)素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。另外少數(shù)植物生根比較困難時(shí)，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營(yíng)養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。從胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先已分化的根，這種根可以不經(jīng)誘導(dǎo)生根階段而生長(zhǎng)。但因經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗數(shù)特別多，并且個(gè)體較小，所以也常需要一個(gè)低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。試管內(nèi)生根壯苗的階段，為了成功地將苗移植到試管外的環(huán)境中，以使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18～20℃為宜。實(shí)踐證明植物生長(zhǎng)的溫度過高不但會(huì)牽涉到蒸騰加強(qiáng)。而且還牽涉到菌類易滋生的問題。溫度過低使幼苗生長(zhǎng)遲緩，或不易成活。春季低溫時(shí)苗床可加設(shè)電熱線，使墓質(zhì)溫度略高于氣溫2～3℃，這不但有利于生根和促進(jìn)根系發(fā)達(dá)，而且還有利于提前成活。移植到試管外的植物苗光強(qiáng)度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強(qiáng)度較高的漫射光，(約4000h左右)，以維持光合作用所需光照強(qiáng)度。但光線過強(qiáng)刺激蒸騰加強(qiáng)，會(huì)使水分平衡的矛盾更尖銳。二、試管苗移栽馴化

試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié)，這個(gè)工作環(huán)節(jié)做不好，就會(huì)造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)選擇合適的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才能確保整個(gè)組織培養(yǎng)工作的順利完成。試管苗由于是在無菌、有營(yíng)養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近100%的相對(duì)濕度環(huán)境條件下生長(zhǎng)的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長(zhǎng)的正常小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，葉片通常沒有表皮毛，