生物化學(xué)蛋白質(zhì)

關(guān)于生物化學(xué)蛋白質(zhì)一.蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)各個(gè)解離基團(tuán)的pK值與游離氨基酸的不完全相同。短肽的等電點(diǎn)和凈電荷量可以根據(jù)pK值計(jì)算，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)要用等電聚焦等方法測(cè)定。第2頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天二.蛋白質(zhì)分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量假定某種微量成分只有一個(gè)，測(cè)出其百分含量后，可用比例式算出最低相對(duì)分子質(zhì)量。若測(cè)出兩種微量成分的百分含量，分別用比例式算出的最低相對(duì)分子質(zhì)量不相同時(shí)，可計(jì)算兩個(gè)最低相對(duì)分子質(zhì)量近似的最小公倍數(shù)。第3頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天例題：一種純酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含異亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相對(duì)分子質(zhì)量。解：按照Leu的百分含量計(jì)算，最低MrX1：X1=(100

131)/1.65=7939.4按照Ile的百分含量計(jì)算最低MrX2：X2=(100

131)/2.48=5282.3由于X1和X2數(shù)字差異較大，提示這種酶含Leu和Ile不止1個(gè)，為了估算Leu和Ile的個(gè)數(shù)，首先計(jì)算：X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5

這種酶含任何氨基酸的個(gè)數(shù)均應(yīng)是整數(shù)，說(shuō)明該酶至少含有2個(gè)Leu，3個(gè)Ile，其最低相對(duì)分子質(zhì)量為：7939.4

2=15878.8或5282.3×3=15846.9第4頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量第5頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）沉降分析法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量第6頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天基本原理：⒈離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）：當(dāng)一個(gè)粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時(shí)，此離心力“Fc”由下式定義：F=m*a=m*ω2ra—粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，m—沉降粒子的有效質(zhì)量，ω—粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，r—粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)。第7頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天⒉相對(duì)離心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

由于各種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。

。第8頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天G＝1.11×(10-5)×R×[rpm]２離心半徑為10厘米，轉(zhuǎn)速為8000，其離心力為：

G＝1.11*10-5*10*（8000）２＝7104

即離心力為7104g.而當(dāng)離心力為8000g時(shí)，其轉(zhuǎn)速應(yīng)為：8489即約為8500rpm第9頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天⒊沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，s）：1924年Svedberg對(duì)沉降系數(shù)下的定義為顆粒在單位離心力場(chǎng)中移動(dòng)的速度。S：沉降系數(shù)，時(shí)常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個(gè)Svedberg單位，簡(jiǎn)寫S，量綱為秒。例如，動(dòng)物原生質(zhì)核糖體的沉降系數(shù)等于80S，它的含義就是：80×10-13s。細(xì)胞及細(xì)胞的各組分的沉降系數(shù)有很大的差異，所以可以利用生物樣品沉降系數(shù)的差異采用離心技術(shù)將他們彼此分開。第10頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第11頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天沉降法:又稱超速離心法。基本原理：蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強(qiáng)大離心力的作用時(shí)，其密度大于溶劑而沉降。在沉降過程中，分子量相同的蛋白質(zhì)顆粒以相同的速度沉降，在介質(zhì)中會(huì)形成一條清晰的條帶，用特制的光學(xué)儀器掃描記錄，可以顯示出所有蛋白質(zhì)條帶位置及沉降速度。物質(zhì)顆粒在單位離心力場(chǎng)中的沉降速度為恒定值，稱沉降系數(shù)，用S表示，一個(gè)S單位為1×10－13s。蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)S（20℃水中）大約為1×10－13-200×10－13s即1S-200S。用沉降法求出S值并計(jì)算出分子量。注意。文獻(xiàn)中經(jīng)常出現(xiàn)以S為單位描述蛋白質(zhì)。第12頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天（四）凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量

當(dāng)含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，向下移動(dòng)的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對(duì)分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。第13頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第14頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天若以組分的洗脫體積(Ve)對(duì)組分相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lgMr)作圖，可得一曲線，其中主要部分成直線關(guān)系。以此為標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以通過測(cè)定某一未知組分的洗脫體積，而從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得其相對(duì)分子質(zhì)量。在實(shí)際應(yīng)用中多以相對(duì)洗脫體積Kav(Kav=Ve/Vt)對(duì)lgMr作曲線，稱為選擇曲線，曲線的斜率說(shuō)明凝膠的特性。每一類型的化合物，如球蛋白類、右旋糖酐類、酶與清蛋白類等都有各自特定的選擇曲線。測(cè)定時(shí)，未知相對(duì)分子質(zhì)量的組分應(yīng)位于直線部分為宜。若不在直線部分，可選用另一種凝膠重新試驗(yàn)。第15頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第16頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天（五）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量

SDS即十二烷基硫酸鈉是陰離子去污劑，在水溶液中，以單體和分子團(tuán)的混合形式存在，單體和分子團(tuán)的濃度與SDS總濃度、離子強(qiáng)度及溫度有關(guān)，為了使單體和蛋白質(zhì)結(jié)合生成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，需要采取低離子強(qiáng)度，使單體濃度有所升高。在單體濃度為0.5mmol/L以上時(shí)，蛋白質(zhì)和SDS就能結(jié)合成復(fù)合物；當(dāng)SDS單體濃度大于1mmol/L時(shí)，與大多數(shù)蛋白質(zhì)平均結(jié)合比為1.4gSDS/g蛋白質(zhì)；在低于0.5mmol/L濃度時(shí)，其結(jié)合比一般為0.4gSDS/g蛋白質(zhì)。第17頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)，所帶的負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用Mr差異將各種蛋白質(zhì)分開。在蛋白質(zhì)溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使多肽分成單個(gè)亞單位。SDS可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。此復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)均表明，它們?cè)谒芤褐械男螤罱蒲┣研蔚拈L(zhǎng)橢圓棒。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸相同，約1.8nm，而長(zhǎng)軸則與蛋白質(zhì)的Mr成正比。第18頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天

測(cè)定未知蛋白質(zhì)Mr時(shí)，可選用相應(yīng)的一組標(biāo)準(zhǔn)蛋白及適宜的凝膠濃度，同時(shí)進(jìn)行SDS，則可根據(jù)已知Mr蛋白質(zhì)的電泳遷移率和Mr的對(duì)數(shù)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得Mr。它不僅用于蛋白質(zhì)Mr測(cè)定，還可用于蛋白混合組分的分離和亞組分的分析，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來(lái)，除去SDS，還可進(jìn)行氨基酸順序、酶解圖譜及抗原性質(zhì)等方面的研究。第19頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第20頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第22頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)大小在1-100nm范圍內(nèi)；同種電荷互相排斥；質(zhì)點(diǎn)外圍有水化層。（二）蛋白質(zhì)的沉淀1.鹽析法2.有機(jī)溶劑沉淀法3.重金屬鹽沉淀法4.生物堿試劑和某些酸類沉淀法5.加熱變性沉淀法第23頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則1.前處理要選擇合適的材料;合適的破碎方法;合適的提取液。2.粗分級(jí)分離要方法簡(jiǎn)便，處理量大。常用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法，有時(shí)可用超過濾或凝膠過濾等方法。3.細(xì)分級(jí)分離主要使用各種層析、電泳，方法要精心選擇，巧妙配合。后期可用結(jié)晶法。第24頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超濾(1)透析透析是把待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進(jìn)行的，透析液可以更換，直至透析袋內(nèi)無(wú)機(jī)鹽等小分子物質(zhì)降到最小值為止。原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無(wú)機(jī)鹽、單糖等分開。

第25頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第26頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2).超濾：利用壓力或離心力，強(qiáng)行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達(dá)到濃縮和脫鹽的目的。

超濾是一種膜分離技術(shù)第27頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第28頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.密度梯度離心第29頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第30頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.凝膠過濾

第31頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天(二)利用溶解度差別的純化方法1.等電點(diǎn)沉淀和pH控制

利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)一這特性，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化的方法稱為等電點(diǎn)沉淀法。

第32頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，消除了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機(jī)溶劑沉淀法聯(lián)合使用。單獨(dú)使用等電點(diǎn)法主要是用于去除等電點(diǎn)相距較大的雜蛋白。在加酸或加堿調(diào)節(jié)pH的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加入，以防止局部過酸或過堿。第33頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；而當(dāng)鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達(dá)到彼此分離的目的。原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從溶液中析出。第34頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第35頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天鹽的選擇：蛋白質(zhì)的鹽析通常采用中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨。硫酸銨是一中性鹽，對(duì)蛋白質(zhì)有相當(dāng)好穩(wěn)定作用。又因?yàn)槠潆x子容積較大，吸走水分子的能力也大，成為有效的鹽析工具。

第36頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天硫酸銨濃度的計(jì)算與調(diào)整方法

通常硫酸銨的添加以百分飽和度來(lái)表示(不是濃度百分比)，例如大部分蛋白質(zhì)可在80%硫酸銨飽和度下沉淀。因?yàn)榱蛩徜@加入的體積很大，會(huì)改變最后的總體積，很難由濃度百分比來(lái)計(jì)算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。

第37頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨濃度的調(diào)整方法主要有二種：

（1）加入飽和溶液法要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高

V=V0(S2-S1)/（1-S2）

V:所需加進(jìn)的飽和硫酸銨溶液的體積；V0:原溶液的體積；S2：所需達(dá)到的硫酸銨飽和度；S1:原溶液的硫酸銨飽和度。飽和硫酸銨的配制方法：在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至50－60℃，趁熱濾去沉淀，再在0℃或室溫平衡1－2天，有固體析出時(shí)達(dá)100％飽和度。第38頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)

加入固體鹽法要求：飽和度高，不增大溶液體積

t=G(S2-S1)/（1-AS2）

S2，S1:分別代表所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原溶液的硫酸銨飽和度；t：將1LS1飽和度的溶液提高到S2飽和度時(shí)所需加進(jìn)的硫酸銨克數(shù)；G和A為常數(shù)，與溫度有關(guān)。實(shí)際使用時(shí)，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃兩張表，室溫用25℃）第39頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.pH和溫度對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響pH的影響

大多數(shù)蛋白質(zhì)在等點(diǎn)電時(shí)，在鹽溶液中的溶解度最低。所以鹽析時(shí)溶液pH值調(diào)到等電點(diǎn)效果最好。第40頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天溫度的影響

a.在低離子強(qiáng)度或純水中，溫度升高，溶解度增加；

b.在高鹽溶液中，溫度升高，溶解度降低。一般在室溫下進(jìn)行鹽析，溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫4℃進(jìn)行，也有個(gè)別酶在低溫時(shí)失活，高溫有活性，如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25℃比0℃時(shí)溶解度低，更容易鹽析。第41頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法（1）作用機(jī)理：

a.降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)溶解度降低；

b.破壞大分子周圍水膜，使溶解度降低。

利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，稱為有機(jī)溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機(jī)溶劑是乙醇和丙酮。第42頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）優(yōu)點(diǎn)：比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去。（3）缺點(diǎn)：

有機(jī)溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)和酶變性，所以操作必須在低溫條件下進(jìn)行。蛋白質(zhì)和酶沉淀分離后，應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機(jī)溶劑濃度，避免變性。

有機(jī)溶劑沉淀法一般與等電點(diǎn)沉淀法聯(lián)合使用。即操作時(shí)溶液的pH值應(yīng)控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。第43頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第44頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天注意：（1)低溫操作（2）樣品濃度過大，易變性，共沉淀作用大，分離效果差；過小，易產(chǎn)生變性，回收率低。（3）樣品穩(wěn)定結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)，選擇溶解度最低處的pH，即與等電點(diǎn)共沉淀結(jié)合使用。（4)注意離子強(qiáng)度，離子種類的影響。第45頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天(三)根據(jù)電荷不同的純化方法1.電泳

帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度稱遷移率或泳動(dòng)度(mobility)，可用下式表示：

U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt式中，U(也可以用m表示)為泳動(dòng)度(cm2/Vs)；v為顆粒泳動(dòng)速度(cm/s)；E為電場(chǎng)強(qiáng)度(V/cm)；d為顆粒移動(dòng)的距離；l為支持物的有效長(zhǎng)度(cm)；V為實(shí)際電壓(V)；t為通電時(shí)間(s或min)。電泳后通過側(cè)量V,t,d,l，即可計(jì)算出被分離物質(zhì)的泳動(dòng)度。

泳動(dòng)度與帶電顆粒所帶凈電荷的數(shù)量，顆粒大小和形狀有關(guān)。一般說(shuō)，凈電荷數(shù)量愈多，顆粒愈小，愈接近球形，泳動(dòng)度愈大。被分離的球形分子在電場(chǎng)中所受的力(F)為：F=EQ式中，E為電場(chǎng)強(qiáng)度，即每厘米支持物的電位降，Q為被分離物所帶凈電荷。根據(jù)Stoke定律，一球形分子在液體中泳動(dòng)所受的阻力(摩擦力)F′為：

F′=6πrηv式中，η為介質(zhì)粘度，r為分子半徑，v為分子移動(dòng)速度。當(dāng)平衡時(shí)：F=F′，即EQ=6πrηv∴v=EQ/6πrη∵U=v/E∴U=Q/6πrη由上式可見泳動(dòng)度與球形分子半徑、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷有關(guān)。第46頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡(jiǎn)稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡(jiǎn)稱PAGE)。

凝膠的聚合常用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。TEMED的堿基可催化AP水溶液產(chǎn)生游離氧原子，激活A(yù)cr單體，使其聚合成單體長(zhǎng)鏈，在Bis作用下，聚合成網(wǎng)狀凝膠。堿性條件下凝膠易聚合，室溫下7.5%的凝膠在pH8.8時(shí)30min聚合，在pH4.3時(shí)約需90min。此外，核黃素亦可為催化劑，聚合需光照，故使用不多。第47頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第48頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點(diǎn)：(1)在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好。(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(3)對(duì)pH和溫度變化較穩(wěn)定。(4)幾乎無(wú)電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好。(5)樣品不易擴(kuò)散，且用量少，其靈敏度可達(dá)10-6g。(6)凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。PAGE應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等。第49頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.等電聚焦

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)pH＞pI時(shí)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)；當(dāng)pH＜pI時(shí)帶正電荷，在電場(chǎng)中向負(fù)極移動(dòng)；當(dāng)pH=pI時(shí)凈電荷為零，在電場(chǎng)中既不向正極也不向負(fù)極移動(dòng)，此時(shí)的pH就是該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)。各種蛋白質(zhì)由不同的氨基酸以不同的比例組成，因而有不同的pI。利用pI不同，以PAG為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)，在電場(chǎng)作用下，兩性電解質(zhì)載體在凝膠中移動(dòng)，形成pH梯度，蛋白質(zhì)在凝膠中遷移至其pI的pH處，即不再泳動(dòng)而聚焦成帶，這種方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(isoelectricfocusing,簡(jiǎn)釋IEF)。第50頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第51頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.雙向電泳雙向PAGE電泳是由兩種類型的PAGE組合而成。樣品經(jīng)第一向電泳分離后，再以垂直它的方向進(jìn)行第二向電泳。如這二向電泳體系pH及凝膠濃度完全相同，則電泳后樣品中不同組分的斑點(diǎn)基本上呈對(duì)角線分布，對(duì)提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根據(jù)不同生物分子間等電點(diǎn)及相對(duì)分子質(zhì)量不同的特點(diǎn)，建立了以第一向?yàn)镮EF，第二向?yàn)镾DS-PAGE的雙向分離技術(shù)，簡(jiǎn)稱為IEF/SDS；基本原理與IEF，SDS完全相同。一般第一向IEF用超薄水平板，電泳結(jié)束后切取所需泳道用于第二向電泳，或在1mm內(nèi)徑的毛細(xì)管中進(jìn)行第一向IEF，取出膠條用于第二向電泳。第一向電泳的方法同IEF，只是制膠時(shí)要加入2%兩性電解質(zhì)和6mol/L尿素。第二向電泳時(shí)，先將SDS-PAG灌在垂直玻璃板之間，上部留2cm左右空間，待聚合后，將第一向膠條轉(zhuǎn)移到第二向膠之上，用載玻片將膠條輕輕壓直，加3μL1%溴酚蘭指示劑，用1%的瓊脂糖(用電極緩沖液配制)密封膠條，瓊脂糖凝固后即可電泳。待溴酚蘭將至凝膠板下方邊緣時(shí)，停止電泳。第二向電泳時(shí)，用梯度混合器將凝膠制成7.5%-15%的濃度梯度，可以提高電泳的分辨率。第52頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第53頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第54頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.毛細(xì)管電泳毛細(xì)管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis,CGE)是在毛細(xì)管中填充具線狀纏結(jié)聚合物結(jié)構(gòu)的物理凝膠，使樣品中各組分通過凈電荷差異和分子大小差異雙重機(jī)制得以分離。CGE在蛋白質(zhì)、多肽、DNA序列分析中得到成功應(yīng)用，已成為生命科學(xué)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中有力的分析工具。近年來(lái)，其它類型的毛細(xì)管電色譜法(capillaryelectro-chromatography,CEC)發(fā)展很快。其中填充毛細(xì)管電色譜法(packedcolomnCEC)是將細(xì)粒徑固定相填充在毛細(xì)管柱中，開管毛細(xì)管電色譜法(opentubolarCEC)是把固定相的官能團(tuán)鍵合在毛細(xì)管內(nèi)壁表面而形成的色譜柱。CEC是很有前途的分析方法。由于毛細(xì)管容易冷卻，可以加很高的電壓，因而，有很好的分辨率?？梢酝ㄟ^記錄儀直接檢測(cè)，容易組合成自動(dòng)化程度很高的成套儀器。第55頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第56頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天6.層析聚焦層析柱中填裝多緩沖交換劑，用多緩沖劑淋洗柱子可以形成pH梯度，淋洗液按照pH依次從柱中流出，蛋白質(zhì)按pI依次從柱中流出，有較好的分離效果。第57頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天7.離子交換層析(1)離子交換劑離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)(或功能基團(tuán))和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基團(tuán)共價(jià)鍵連接，電荷基團(tuán)與反離子以離子鍵結(jié)合。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，假設(shè)以RA+代表陽(yáng)離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽(yáng)離子B+發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：RA++B+RB++A+

第58頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天

離子交換劑對(duì)溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。強(qiáng)酸性(陽(yáng)性)離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力比對(duì)Na+的?。粡?qiáng)堿性(陰性)離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力比對(duì)Cl-的小得多；弱酸性離子交換劑對(duì)H+的結(jié)合力遠(yuǎn)比對(duì)Na+的大；弱堿性離子交換劑對(duì)OH-的結(jié)合力比對(duì)Cl-的大。因此，在應(yīng)用離子交換劑時(shí)，采用何種反離子進(jìn)行電荷平衡是決定吸附容量的重要因子之一。離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發(fā)生水化作用形成的)的結(jié)合力與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。所以，離子價(jià)數(shù)越高，結(jié)合力越大。在離子間的電荷相同時(shí)，離子的原子序數(shù)越高，水合離子半徑越小，結(jié)合力越大。第59頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天第60頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)洗脫方法在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進(jìn)行洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。梯度溶液按組成來(lái)分，一般有二種：一種是增加離子強(qiáng)度的梯度溶液。是用一簡(jiǎn)單的鹽(如NaCl或KCl)溶解于稀緩沖液制成的，習(xí)慣上不用弱酸或弱堿的鹽類；另一種是改變pH值的梯度溶液。該溶液是用兩種不同pH值或不同緩沖容量的緩沖液制成的，所用緩沖液的種類、pH值以及緩沖容量要認(rèn)真選擇，否則將達(dá)不到預(yù)期目的。對(duì)于增加離子強(qiáng)度的梯度溶液，不管用于何種類型的離子交換劑，其離子強(qiáng)度絕大部分是增加的。而改變pH值的梯度溶液則不然，如果使用的是陽(yáng)離子交換劑，pH值應(yīng)從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑，pH值應(yīng)從高到低遞減，實(shí)際許可的pH值范圍由待分離物質(zhì)的穩(wěn)定pH范圍和離子交換劑限制的pH范圍來(lái)決定。第61頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天K=VM/VR第62頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天(四)利用選擇性吸附的純化方法1.羥基磷灰石層析羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2(簡(jiǎn)稱HA)]的吸附容量高，穩(wěn)定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒和其它生命物質(zhì)方面得到了廣泛的應(yīng)用。有時(shí)有些樣品如RNA、雙鏈DNA、單鏈DNA和雜合型雙鏈DNA-RNA等，經(jīng)過一次HA柱層析，就能達(dá)到有效的分離。HA的Ca2+基團(tuán)和生物分子表面的負(fù)電荷基團(tuán)的相互反應(yīng)，在用HA分離生物分子過程中起著重要作用。而HA的(PO4)3基團(tuán)與生物分子表面的陽(yáng)電荷基團(tuán)的相互反應(yīng)，則僅起著次要的作用。第63頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.疏水作用層析

以苯基瓊脂糖或辛基瓊脂糖為固體支持物，與蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)相互作用，用降低離子強(qiáng)度或增加置換劑的方法洗脫。常用的置換劑有非離子型去污劑、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用層析容易引起蛋白質(zhì)變性，在蛋白質(zhì)分離中使用不廣。第64頁(yè),共72頁(yè)，2024年2月25日，星期天(五)利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的層析技術(shù)。

具有專一而又可逆的親和力的生物分子是成對(duì)互配的。主要的有：酶和底物、酶與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、酶和輔酶、抗原與抗體、DNA和RNA、激素和其受體、DNA與結(jié)合蛋白等。