植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其在育種中的應(yīng)用

關(guān)于植物組織培養(yǎng)技術(shù)及其在育種中的應(yīng)用一、現(xiàn)代生物技術(shù)及其基本概念（一）生物技術(shù)概念生物技術(shù)（Biotechnology)，有時也稱生物工程（Bioengineering）,是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)科學(xué)的原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì)改造生物體或加工生物原料，為人類產(chǎn)出所需產(chǎn)品。生物技術(shù)是一門綜合性學(xué)科?，F(xiàn)代生物技術(shù)已成功地應(yīng)用于植物育種中。第2頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（二）生物技術(shù)的種類基因工程（GeneEngineering）細(xì)胞工程（CellEngineering）酶工程（EnzymeEngineering）發(fā)酵工程（FermentationEngineering）蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）第3頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（三）細(xì)胞工程

細(xì)胞工程就是在細(xì)胞水平研究開發(fā)、利用各類細(xì)胞的工程。亦即人們根據(jù)科學(xué)設(shè)計(jì)改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，通過無菌操作，大量培養(yǎng)細(xì)胞、組織乃至完整個體的技術(shù)。第4頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（四）克隆概念分離基因的技術(shù)；擴(kuò)增基因的技術(shù)；將單一細(xì)胞擴(kuò)增成細(xì)胞群體的技術(shù)；將一個生命體復(fù)制成一個與之完全相同的新個體的過程；將單一個體擴(kuò)增成一個遺傳上完全相同的群體。一個遺傳上來源完全相同的生物群體。第5頁,共45頁，2024年2月25日，星期天二、植物組織培養(yǎng)的基本步驟1、植物細(xì)胞的全能性（CellTotipotency）一個植物細(xì)胞能產(chǎn)生一個完整植株的固有能力稱之為細(xì)胞的全能性。第6頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2、植物離體分化的類型無菌短枝型叢生芽增殖型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球莖發(fā)生型第7頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3、植物組織培養(yǎng)的特點(diǎn)培育材料經(jīng)濟(jì)；培養(yǎng)條件可人為控制；生長周期短，繁殖率高；管理方便，利于自動化控制。第8頁,共45頁，2024年2月25日，星期天5、植物組織培養(yǎng)的基本操作無菌操作技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)原生質(zhì)體融合技術(shù)第9頁,共45頁，2024年2月25日，星期天接種用具的滅菌

接種前，必須把用具放入接種室或箱內(nèi)，初用接種室或箱時要用甲醛（一般市售分析純的有效成份為36-38%熏蒸5小時以上再開紫外光燈照射40-60分鐘，以后在每次接種之前，把要接種的試管或三角瓶放入接種室（箱）內(nèi)，用5%的煤酚瓶皂溶液即來蘇爾（一般市售的有效成份為47-53%）或5%的石灰炭酸液噴霧消毒，再打開紫外光燈照20-40分鐘，這樣消毒后，再經(jīng)30-40分鐘便可進(jìn)行接種。第10頁,共45頁，2024年2月25日，星期天接種材料的表面滅菌

接種前花蕾或穗的徹底滅菌是杜絕污染的主要關(guān)鍵，先用70-75%的酒精浸泡10-15秒鐘或用酒精棉球擦兩遍，初步殺死表面所帶的微生物，放在10%的漂白粉液或飽和漂白粉液中浸泡15-30分鐘殺菌，然后用無菌水沖洗2-3次。消毒過的穗子或花蕾用消毒紗布包好，待取花藥接種，注意，穗子或花蕾的操作要在無菌條件下進(jìn)行。第11頁,共45頁，2024年2月25日，星期天5、植物組織培養(yǎng)所需營養(yǎng)與環(huán)境條件（1）無機(jī)營養(yǎng)大量元素：一般是指濃度大于0.5mmol/L.氮(N)、磷(P)、鉀(K)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、硫(S)。微量元素：

包括鐵(Fe)

、銅(Cu)

、鉬(Mo)

、鋅(Zn)

、鈉(Na)

、錳(Mn)

、鈷(Co)

、硼(B)

、碘(I)。（2）有機(jī)營養(yǎng)維生素、肌醇、氨基酸、有機(jī)添加物。（3）生長調(diào)節(jié)物生長素：2，4-D、奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸(IAA)。細(xì)胞分裂素：激動素（KT）、6-芐基氨基嘌呤（6BA）、玉米素（ZT）。赤霉素（GA）

：脫落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）。第12頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（4）瓊脂（5）能源和滲透壓（6）其他成分（7）溫度（8）光照（光強(qiáng)、光質(zhì)）培養(yǎng)基的配制：培養(yǎng)基母液的配制；配制培養(yǎng)基的步驟；培養(yǎng)基的分裝及滅菌。第13頁,共45頁，2024年2月25日，星期天6、植物組織培養(yǎng)經(jīng)歷的五個階段：（1）預(yù)備階段外植體的獲得；接種材料的消毒處理；配制適宜的培養(yǎng)基；（2）誘導(dǎo)去分化階段（3）繼代增殖階段（4）生根成芽階段（5）移栽成活階段第14頁,共45頁，2024年2月25日，星期天三、植物組織培養(yǎng)技術(shù)在育種中的應(yīng)用種質(zhì)資源保護(hù)；優(yōu)良品種快速繁殖；誘發(fā)和離體篩選突變體；克服遠(yuǎn)緣雜交困難；克服種子發(fā)育中的障礙；單倍體育種的技術(shù)環(huán)節(jié)基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)第15頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（一）單倍體育種單倍體的概念及其特點(diǎn)只含有一套染色體組的生物體；被子植物的配子體世代。矮小性；不育性；全顯性。第16頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2.單倍體植物在育種上的意義單倍體植物的直接利用；克服雜種分離，縮短育種年限；快速獲得異花授粉植物的自交系；單倍體植物的誘變育種；克服遠(yuǎn)緣雜種不孕性與不穩(wěn)定的現(xiàn)象；第17頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.單倍體植株和愈傷組織的培養(yǎng)（1）單倍體材料的采集

單倍體育種的首要問題是如何獲得大最的單倍體植株。據(jù)現(xiàn)有的研究材料，用花藥培養(yǎng)產(chǎn)生單倍體植株有兩個途徑:

第一是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉經(jīng)過類似胚胎發(fā)育的過程直接形成單倍體植物，如煙草、曼陀羅等。第二是在離體培養(yǎng)的花藥中，花粉形成愈傷組織，再從愈傷組織分化出單倍體植株。第18頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（2）花藥的接種接種前的準(zhǔn)備工作接種和培養(yǎng)花藥是在無菌條件下進(jìn)行的，所用的一切用具必須徹底滅菌?；ǚ郯l(fā)育時期的鑒定適宜的花粉發(fā)育時期對于提高花粉誘導(dǎo)愈傷組織分化的頻率是很重要的，為此，進(jìn)行花藥培養(yǎng)前，要用顯微鏡進(jìn)行花粉發(fā)育時期的鑒定。經(jīng)顯微鏡檢查后，把花粉細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)期與花藥或花序的外部形態(tài)聯(lián)系起來，找出花粉單核期或單核期的花蕾或花序的外部形態(tài)標(biāo)志選取花藥進(jìn)行接種培養(yǎng)。第19頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

（3）從愈傷組織分化成苗

誘導(dǎo)愈傷組織分化出根、莖、葉的方法是在愈傷組織長到1-3毫米大?。ㄈ缧∶状螅r，即可轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，促使分化長出植株。一般說來，愈傷組織如果先形成芽，隨后根自然會發(fā)生，如果先有根，以后不一定會出芽。因此，掌握芽分化的條件是十分重要的。愈傷組織轉(zhuǎn)移培養(yǎng)工作是在無菌室或接種箱內(nèi)進(jìn)行的，轉(zhuǎn)移后愈傷組織培養(yǎng)在23-28℃恒溫室內(nèi)，每日光照9-11小時，可用日光燈作輔助光，光強(qiáng)度在2000勒克斯以上。在轉(zhuǎn)移愈傷組織時，應(yīng)注意其極性，原來向上的一但轉(zhuǎn)移后的一但轉(zhuǎn)移后仍應(yīng)向上，否則會影響生長，同時在轉(zhuǎn)移時，就避免沾帶過多的培養(yǎng)基。第20頁,共45頁，2024年2月25日，星期天4.染色體加倍處理方式：試管內(nèi)進(jìn)行；花粉植株定植后進(jìn)行；藥劑處理；植株鑒定。第21頁,共45頁，2024年2月25日，星期天單倍體育種程序：

材料采集接種培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織

獲得再生植株染色體加倍幼苗培育和品種選擇

第22頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（二）原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交常規(guī)雜交育種由于物種間難以逾越的天然屏障而舉步維艱?？茖W(xué)家們受細(xì)胞全能性理論及組織培養(yǎng)成功的啟示，逐漸將眼光轉(zhuǎn)向細(xì)胞融合，試圖通過這種嶄新的手段沖破自然界的禁錮。第23頁,共45頁，2024年2月25日，星期天原生質(zhì)體的概念植物細(xì)胞原生質(zhì)體是指那些以去除全部細(xì)胞壁的細(xì)胞。此時，細(xì)胞外僅由細(xì)胞膜包裹，呈圓形只有在高滲溶液中才能相對穩(wěn)定。原生質(zhì)體經(jīng)適當(dāng)處理，可與其他細(xì)胞融合成新的體細(xì)胞。第24頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2.原生質(zhì)體的特點(diǎn)比完整的細(xì)胞更容易獲得外來遺傳物質(zhì)，為實(shí)現(xiàn)異源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化提供了較好的實(shí)驗(yàn)材料。原生質(zhì)體在一定條件下可以融合成雜種細(xì)胞，開辟了一條新的育種途徑。第25頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.發(fā)展概況1892，J.A.Klerker用機(jī)械法獲得原生質(zhì)體；1960，E.C.Cocking用酶法首先從番茄根尖中分離出大量有活性的原生質(zhì)體并通過培養(yǎng)再生出細(xì)胞壁形成再生植株;1960，G.Barski發(fā)現(xiàn),題細(xì)胞原生質(zhì)體能融合在一起形成單核的、并能進(jìn)行分裂的雜種細(xì)胞；1972，P.S.Carlon首次獲得煙草體細(xì)胞種間雜種。80’s此項(xiàng)技術(shù)在我國得到發(fā)展。第26頁,共45頁，2024年2月25日，星期天4.原生質(zhì)體的制備（1）取材與滅菌（2）酶解(纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶)（3）分離（沉淀法、漂洗法、滴洗法）（4）洗滌（5）鑒定（形態(tài)觀測、活性鑒定）原生質(zhì)體的培養(yǎng)：細(xì)胞壁再生；細(xì)胞分裂；植株再生。第27頁,共45頁，2024年2月25日，星期天5.原生質(zhì)體的融合化學(xué)法誘導(dǎo)融合按比例混合雙親原生質(zhì)體-滴加PEG-滴加高鈣高PH值溶液-洗滌原生質(zhì)體溶液-離心獲得原生質(zhì)體溶液-篩選雜種細(xì)胞-再生雜種細(xì)胞。第28頁,共45頁，2024年2月25日，星期天物理法誘導(dǎo)融合＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－基本程序：原生質(zhì)體的獲得；電擊融合；篩選雜種細(xì)胞；雜種細(xì)胞再生和完整植株的形成。第29頁,共45頁，2024年2月25日，星期天6.融合細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定與篩選雜和細(xì)胞的顯微鏡鑒別；互補(bǔ)法鑒定雜和細(xì)胞；細(xì)胞與分子生物學(xué)法；植株形態(tài)的鑒別。第30頁,共45頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（三）人工種子

人工種子即人為制造的種子，它是一種含有植物胚狀體或芽、營養(yǎng)成分、激素、及其他成分的人工膠囊。其具有種子的功能，可直接用于田間播種。第32頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

1、人工種子的構(gòu)成

人工種皮胚狀體人工胚乳第33頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2、人工種子的特點(diǎn)：（1）可以不受環(huán)境條件的限制，周年進(jìn)行生產(chǎn)；（2）經(jīng)人工無性繁殖產(chǎn)生，有利于保存該種系的優(yōu)良性狀；（3）成本低，適于田間機(jī)械化生產(chǎn)；（4）可根據(jù)需要調(diào)節(jié)胚乳成分。第34頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3、人工種子的制備（1）胚狀體的制備及其同步生長；（2）人工胚乳的制備；（3）配制包埋劑及人工包埋。第35頁,共45頁，2024年2月25日，星期天人工種子包埋示意圖

4%海藻酸鈉

體細(xì)胞胚

包埋丸

2%CaCl

人工種子

水

第36頁,共45頁，2024年2月25日，星期天4、人工種子的貯存與萌發(fā)低溫、干燥、潔凈。第37頁,共45頁，2024年2月25日，星期天（四）基因工程（一）基因工程的含義按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過體