3.2基因工程的基本操作程序課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修34

3.2基因工程的基本操作程序本節(jié)聚焦:1.基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？2.基因工程操作的每一步涉及的技術(shù)和方法有哪些？基因表達(dá)載體

我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國。棉花在種植的過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。棉鈴蟲可以使棉花產(chǎn)量減少三分之一，嚴(yán)重時，甚至能使一片棉田絕收。大量施用農(nóng)藥殺蟲，不僅會提高生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染。P76轉(zhuǎn)基因抗蟲棉(使棉鈴蟲死亡，左）與非轉(zhuǎn)基因抗蟲棉（右）

科學(xué)家將蘇云金桿菌的“殺蟲基因”——Bt抗蟲蛋白基因轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白（蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白）——破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。

從社會中來

1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟(jì)效益450億元。你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？P76蘇云金桿菌與載體拼接普通棉花（無抗蟲特性）棉花細(xì)胞抗蟲棉提取導(dǎo)入抗蟲基因（Bt抗蟲蛋白基因）重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測與鑒定實例：具體的步驟是？(含抗蟲基因）（含有并表達(dá)抗蟲基因）一目的基因的篩選和獲取1.目的基因

在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因，就是目的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。科學(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因也可以是具有調(diào)控作用的因子。一目的基因的篩選和獲取2.目的基因篩選方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫、序列比對工具等的應(yīng)用，越來越多的基因的

為人們所知。結(jié)構(gòu)和功能DNA測序儀核苷酸序列比對氨基酸序列比對一目的基因的篩選和獲取3.目的基因的獲取?獲取目的基因的方法：①從基因文庫中獲?、谌斯ず铣散劾肞CR獲取和擴增目的基因前提：方法：DNA合成儀基因比較小、核苷酸序列已知通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR是一項根據(jù)

的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的

與

，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴增儀/PCR儀）對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時間內(nèi)大量擴增目的基因全稱原理操作環(huán)境目的優(yōu)點PCR技術(shù)一目的基因的篩選和獲取PCR擴增儀控制溫度解旋酶DNA聚合酶▲子鏈的延伸方向：模板：原料：能量：酶：DNA的兩條母鏈4種游離的脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶復(fù)制特點:①邊解旋邊復(fù)制②半保留復(fù)制堿基互補配對原則（保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行）要點回顧:體內(nèi)DNA復(fù)制條件5'端→3'端復(fù)制原則:

因為DNA聚合酶只能從5'端向3'端延伸子鏈。DNA復(fù)制所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料打開DNA雙鏈催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸（PCR用耐高溫的DNA聚合酶）（PCR用高溫代替）（PCR的引物2種）引物是一小段能與

的一段堿基序列__________的____________DNA母鏈互補配對短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物3’5’DNA母鏈（通常20-30個核苷酸）PCR技術(shù)耐高溫的DNA聚合酶DNA模板引物緩沖溶液四種脫氧核苷酸PCR擴增儀（PCR儀）條件:微量離心管——控制溫度（dNTP）（2種）一般添加Mg2+（激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶）PCR的條件：目的基因DNA（模板）、四種游離的脫氧核苷酸、耐高溫DNA聚合酶、引物、一定的緩沖溶液(維持反應(yīng)體系的pH）、Mg2+（激活DNA聚合酶的活性）、控制溫度變化PCR技術(shù)基本過程3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性

當(dāng)溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性（退火）當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’變性復(fù)性延伸

PCR技術(shù)第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪循環(huán)的產(chǎn)物完成后，常采用

來鑒定PCR的產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳PCR技術(shù)擴增結(jié)果：以指數(shù)形式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）2n（1）若開始只有一個DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為

個。（2）若開始有N個DNA提供模板，則循環(huán)n次后獲得的子代DNA數(shù)目為

個。2nN?2n變性90℃以上延伸72℃左右復(fù)性50℃左右基本過程DNA復(fù)制PCR技術(shù)場所遵循原則條件解旋方式酶特點結(jié)果PCR技術(shù)vsDNA復(fù)制堿基互補配對原則堿基互補配對原則模板、4種脫氧核苷酸、酶、能量、引物模板、4種脫氧核苷酸、酶、能量、引物(2種）DNA在高溫下熱變性解旋解旋酶催化半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再復(fù)制體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）大量的DNA片段形成整個DNA分子耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶等DNA連接酶①全稱：②操作環(huán)境：③原理：④前提：⑤條件：⑥過程：⑦優(yōu)點：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外（PCR擴增儀/PCR儀）可以在短時間內(nèi)大量擴增目的基因（以指數(shù)形式擴增）DNA半保留復(fù)制已知目的基因的一段核苷酸序列（為了合成引物）模板DNA、4種游離脫氧核苷酸、引物（1對）、耐高溫的DNA聚合酶變性：復(fù)性：延伸：DNA解鏈（超過90℃）引物結(jié)合到互補DNA鏈（50℃左右）Taq酶從引物起始進(jìn)行互補鏈的合成（72℃左右）模板、原料、引物、酶、能量（dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP）（本質(zhì)？如何合成？）引物是一小段核酸，能與DNA母鏈的堿基序列互補配對。通常20-30個核苷酸，人工合成回顧：PCR技術(shù)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶（1）引物是一小段能與

的短單鏈核酸，通常為20-30個核苷酸。DNA母鏈的一段堿基序列互補配對（2）在DNA聚合酶的作用下，兩條子鏈的延伸方向都是

。引物與目的基因模板鏈的

端結(jié)合。從子鏈的5′端向3′端延伸3′【拓展練習(xí)】1．PCR反應(yīng)與體內(nèi)DNA復(fù)制的引物在化學(xué)本質(zhì)上是否相同？不相同。但PCR反應(yīng)時所用引物是人工加入的一小段DNA

體內(nèi)DNA復(fù)制所需引物為RNA聚合酶合成的一小段RNA

思考討論：2．PCR過程中需要加入兩種引物，原因是？3．兩種引物的要求？（理解）DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，不能從頭合成，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時被擴增。①引物自身不能環(huán)化②兩種引物之間不能互補配對③引物長度不宜過短，防止引物隨機結(jié)合PCR技術(shù)用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA過程基因表達(dá)載體的構(gòu)建二基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖基因表達(dá)載體重組DNA分子目的基因DNA限制酶限制酶DNA連接酶載體②能自我復(fù)制①有一個至多個限制酶切割位點③具有標(biāo)記基因載體應(yīng)具備條件：限制酶切割位點標(biāo)記基因復(fù)制原點基因表達(dá)載體中還應(yīng)存在那些結(jié)構(gòu)？載體的種類：質(zhì)粒（常用）、噬菌體、動植物病毒①

;②

?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建二——核心步驟基因表達(dá)載體由哪些部分組成啟動子：位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因上游的一段有特殊序列的DNA片段終止轉(zhuǎn)錄1.目的使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用2.組成標(biāo)記基因：目的基因：復(fù)制原點：鑒別或篩選含有重組DNA分子的受體細(xì)胞注意：目的基因必須插入到

與

之間。啟動子終止子DNA復(fù)制的起始位點?；瘜W(xué)本質(zhì)基因表達(dá)載體中啟動子、終止子的來源：①如果目的基因是從自然界中已有的物種中分離出來的，已含有啟動子、終止子，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，不需要在質(zhì)粒上接上特定的啟動子、終止子。②如果目的基因是通過人工方法合成的，或是cDNA，則目的基因是不含啟動子和終止子的。因此，在構(gòu)建基因表達(dá)載體時，需要在目的基因的前后端接上特定的啟動子、終止子。重組DNA分子限制酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因DNA連接酶基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖限制酶啟動子限制酶切割位點終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？基因表達(dá)載體的構(gòu)建二——核心步驟基因表達(dá)載體構(gòu)建模式圖基因表達(dá)載體3.過程培育抗蟲棉的簡要過程載體自身環(huán)化片段間的連接目的基因自身環(huán)化質(zhì)粒自身環(huán)化目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接正向連接

反向連接目的基因11’22’122’1’22’1’1如何解決這一問題？單酶切缺點：

思考：如果用同一種限制酶分別切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶處理后會出現(xiàn)幾種產(chǎn)物？(只考慮兩兩結(jié)合)①質(zhì)粒、目的基因自身環(huán)化；②質(zhì)粒與目的基因反向連接雙酶切！3種旁欄思考題2.將生物的所有DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞不是更簡便嗎？如果這么做，效果會怎樣？

有人采用總DNA注射法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物的總DNA提取出來，花粉管通道法導(dǎo)入受體植物，沒有進(jìn)行基因表達(dá)載體的構(gòu)建。這種方法針對性差，完全靠運氣也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞三導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）基因槍法（單子葉植物常用）花粉管通道法2.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法：

——顯微注射法——Ca2+轉(zhuǎn)化法（我國科學(xué)家獨創(chuàng)）1.轉(zhuǎn)化的概念：

目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)_____和_____的過程。受體細(xì)胞維持穩(wěn)定表達(dá)花粉管通道法（我國獨創(chuàng)）②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。簡便經(jīng)濟(jì)，但要求花朵較大方法：實例：優(yōu)缺點：我國“轉(zhuǎn)基因抗蟲棉”農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）

能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。隨著轉(zhuǎn)化方法的突破，用農(nóng)桿菌侵染水稻、玉米等多種

植物也取得了成功。農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有

，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞時，Ti質(zhì)粒的

可轉(zhuǎn)移至被侵染的細(xì)胞，并整合到該細(xì)胞的

。2.轉(zhuǎn)化原理：1.農(nóng)桿菌的特點：T-DNATi質(zhì)粒大型環(huán)狀DNA農(nóng)桿菌T-DNA染色體DNA上單子葉Ti質(zhì)粒構(gòu)建基因表達(dá)載體時，目的基因該插到Ti質(zhì)粒哪里？T—DNA上Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA上表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（常用）3.過程：植物組織培養(yǎng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入①兩次拼接:第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上。

第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細(xì)胞的

染色體DNA上。②兩次導(dǎo)入:第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒重新導(dǎo)入農(nóng)桿菌。

第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。1.顯微注射法科學(xué)家用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi)，如腺病毒載體等。2.病毒侵染法導(dǎo)入動物細(xì)胞——顯微注射法將含目的基因的表達(dá)載體提純受精卵顯微注射含目的基因的受精卵具有新性狀的動物雌性動物輸卵管或子宮胚胎移植早期胚胎

細(xì)胞

處理大腸桿細(xì)胞

Ca2+感受態(tài)

與感受態(tài)細(xì)胞混合細(xì)胞吸收DNA分子基因表達(dá)載體使細(xì)胞處于一種能夠吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的生理狀態(tài)。注：原核生物作為受體細(xì)胞產(chǎn)生的真核生物的蛋白質(zhì)通常沒有生物活性，需要在體外進(jìn)行再加工。導(dǎo)入微生物細(xì)胞——Ca2+轉(zhuǎn)化法增加細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性因為沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體對蛋白質(zhì)進(jìn)一步加工。四目的基因的檢測與鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——“抗原—抗體雜交技術(shù)”2.個體生物學(xué)水平鑒定1.分子水平檢測抗性檢測：功能活性比較：PCR技術(shù)

或分子雜交技術(shù)——檢測目的基因在受體細(xì)胞中是否穩(wěn)定維持和表達(dá)——檢測目的基因的表達(dá)產(chǎn)物抗蟲、抗病接種實驗；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性比較利用專一性——檢測是否具有抗性以及抗性強度等方法如：胰島素注射到糖尿病模型小鼠①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR擴增轉(zhuǎn)基因生物提取DNADNA作為模板PCR操作M：marker；1-陽性質(zhì)粒；2：原始品系；3-9轉(zhuǎn)Bt品系；轉(zhuǎn)Bt基因品系PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果DNA半保留復(fù)制原理：四目的基因的檢測與鑒定是否擴增出目的基因以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）電泳操作

引物如何設(shè)定？原因：帶標(biāo)記的基因探針，與目的基因DNA單鏈在一定條件下互補配對，結(jié)合成雙鏈，從而出現(xiàn)雜交帶。四目的基因的檢測與鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因酶切轉(zhuǎn)膜標(biāo)記的DNA/RNA探針DNA分子雜交（Southern-blot)流程圖以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）方法2：

DNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對原理：②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴增或分子雜交技術(shù)轉(zhuǎn)基因生物提取RNARNA作為模板PCR操作電泳是否擴增出目的基因逆轉(zhuǎn)錄cDNA四目的基因的檢測與鑒定提取RNA轉(zhuǎn)膜標(biāo)記的DNA/RNA探針RNARNA分子雜交(NorthernBlot)流程圖以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法：

抗原與抗體的特異性結(jié)合原理：蘇云金芽孢桿菌提取Bt抗蟲蛋白注射小鼠體內(nèi)抗體標(biāo)記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交轉(zhuǎn)基因生物四目的基因的檢測與鑒定放射性檢測

（雜交帶）以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）過程：提取轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)+相應(yīng)抗體→是否出現(xiàn)雜交帶抗原—抗體雜交技術(shù)2.個體生物學(xué)水平鑒定沒有抗蟲基因的棉花植株有抗蟲基因的棉花植株棉鈴蟲沒有死亡棉鈴蟲死亡接種棉鈴蟲四目的基因的檢測與鑒定以“抗蟲棉”為例（含Bt抗蟲蛋白基因）轉(zhuǎn)Bt基因非轉(zhuǎn)基因四目的基因的檢測與