沈萍微生物學專家講座

第六章微生物生長

繁殖與控制沈萍微生物學專家講座第1頁本節(jié)重點1、細菌生長曲線概念，幾個時期，各期特點，生產(chǎn)上怎樣應用。2、幾個概念：生長，同時培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3、微生物測定方法沈萍微生物學專家講座第2頁序：

微生物生長表現(xiàn)在微生物個體生長與群體生長兩個水平上。

微生物個體生長表現(xiàn)為個體質量和體積增加。

微生物群體生長是以微生物細胞數(shù)量或微生物群體細胞物質量增加作為生長指標。因而要了解微生物生長規(guī)律，就要了解微生物個體生長和群體生長兩個方面。沈萍微生物學專家講座第3頁單細胞微生物個體生長表現(xiàn)為細胞體積增加和細胞內物質含量增加兩個方面,當細胞生長到一定時期，就分裂成為兩個子細胞。多細胞微生物個體生長則反應在組成個體細胞數(shù)目增加和每個細胞個體生長兩個方面。第一節(jié)細菌個體生長

沈萍微生物學專家講座第4頁（一）染色體DNA復制和分離

細菌細胞生長兩種類型：依據(jù)細胞是否在分裂發(fā)生之前就開啟新一輪DNA復制而將細菌細胞生長分為快速生長和慢速生長兩種類型。

復制區(qū)沈萍微生物學專家講座第5頁沈萍微生物學專家講座第6頁二、細胞壁擴增“背靠背合成”方式：如鏈球菌和一些G+球菌

“分散合成”方式：大腸桿菌等G-桿菌

橫隔形成區(qū)沈萍微生物學專家講座第7頁分裂蛋白和橫隔前體成份橫隔形成細胞分裂間隙期G染色體復制期C分裂期D三、細菌分裂與調整細胞周期各期開啟機制（以大腸桿菌為例）：

DNA復制開啟：細胞必須到達某一閾值體積或起始物質量。細胞分裂期D開啟：只有當細胞到達某一閾值長度后才能進行染色體分離，分裂成為兩個細胞。

DNA復制開啟到達生物量閾值DNA復制與分離到達長度閾值分開DNA拷貝細胞分裂過程開啟時間（min）沈萍微生物學專家講座第8頁一、生長規(guī)律（一）、生長曲線－－細菌接種到均勻液體培養(yǎng)基后，在不補充營養(yǎng)物質或移去培養(yǎng)物時，以時間為橫座標，以菌數(shù)為縱座標，作出一條反應細菌在整個培養(yǎng)期間菌數(shù)改變規(guī)律曲線，這種曲線稱為生長曲線(GrowthCurve)。（二）、分期－－遲緩期；對數(shù)生長久，穩(wěn)定生長久，衰亡期第二節(jié)細菌群體生長繁殖沈萍微生物學專家講座第9頁1、微生物生長曲線沈萍微生物學專家講座第10頁1）遲緩期遲緩期特點?生長速率等于零細胞合成新成份–補充消耗材料–適應新培養(yǎng)基或別培養(yǎng)條件?細胞形態(tài)變大或變長對外界不良環(huán)境敏感沈萍微生物學專家講座第11頁影響遲緩期長短原因與實踐意義

接種齡:對數(shù)期“種子”，遲緩期較短；遲緩期或衰亡期“種子”,遲緩期較長；接種量：接種量大，遲緩期較短；接種量小，遲緩期較長；

培養(yǎng)基成份:培養(yǎng)基成份豐富，遲緩期較短；培養(yǎng)基成份與種子培養(yǎng)基一致,遲緩期較短；沈萍微生物學專家講座第12頁2）對數(shù)生長久特點?生長速率最快，細胞呈指數(shù)增加生長速率恒定，代時最短代謝旺盛，細胞成份平衡發(fā)展,?群體生理特征較一致沈萍微生物學專家講座第13頁生長數(shù)學模型Nt=N0×2n

lgNt=lgN0+nlg2n=lgNt-lgN0=lgNt-lgN0lg20.301n=3.322(lgNt－lgN0)

t－t0

G=－－－－－－－－－-

3.322（lgNt－lgN0)沈萍微生物學專家講座第14頁世代：由1個細胞分裂成為2個細胞間隔被稱為世代。代時：就是一個世代所需時間，因而也就是群體細胞數(shù)目擴大1倍所需時間，有時也被稱為倍增時間。

沈萍微生物學專家講座第15頁影響對數(shù)期原因

菌種：不一樣菌種代時差異極大

營養(yǎng)成份：營養(yǎng)越豐富，代時越短

營養(yǎng)物濃度：影響微生物生長速率和總生長量

培養(yǎng)溫度：影響微生物生長速率對數(shù)期實踐意義

是代謝、生理研究良好材料是增殖噬菌體最適宿主菌齡是發(fā)酵生產(chǎn)中用作“種子”最正確種齡G+染色判定時采取此期微生物沈萍微生物學專家講座第16頁3）穩(wěn)定生長久特點：

活細胞總數(shù)維持不變，即新繁殖細胞數(shù)與衰亡細胞數(shù)相等，菌體總數(shù)到達最高點。細胞生長速率為零細胞生理上處于衰老，代謝活力鈍化，細胞成份合成遲緩，G+染色發(fā)生改變。為何細胞總數(shù)不再增加？沈萍微生物學專家講座第17頁穩(wěn)定生長久實踐意義是發(fā)酵生產(chǎn)中以菌體為終產(chǎn)品最正確收獲期；一些代謝產(chǎn)物尤其是次生代謝產(chǎn)物發(fā)生在此階段，一些細菌芽孢也發(fā)生在此階段，故又稱作代謝產(chǎn)物合成期；造成了連續(xù)培養(yǎng)原理提出和工藝技術改進。沈萍微生物學專家講座第18頁4）衰亡期特點：

?細胞以指數(shù)速率死亡，有時細胞死亡速率降低是因為抗性細胞積累；細胞變形退化，有發(fā)生自溶，G+染色發(fā)生改變。沈萍微生物學專家講座第19頁影響衰亡期原因及實踐意義與菌種遺傳特征相關:有些細菌培養(yǎng)經(jīng)歷全部各個生長時期，幾天以后死亡,有些細菌培養(yǎng)幾個月乃至幾年以后依然有一些活細胞；與是否產(chǎn)芽孢相關：產(chǎn)芽孢細菌更易于幸存下來；與營養(yǎng)物質和有毒物質相關：補充營養(yǎng)和能源，以及中和環(huán)境毒性，能夠減緩死亡期細胞死亡速率，延長細菌培養(yǎng)物存活時間。沈萍微生物學專家講座第20頁（三）絲狀微生物群體生長

絲狀微生物包含具分支原核生物放線菌和真核生物絲狀真菌。

1.絲狀微生物群體生長特征

這類微生物在液體培養(yǎng)基中即使也能夠幾乎均勻分布菌絲懸浮液方式生長（絲狀生長）。但大多數(shù)情況下是以分散沉淀物方式在發(fā)酵液中出現(xiàn)（沉淀生長），沉淀物形態(tài)從渙散絮狀沉淀到堆集緊密菌絲球不等。沈萍微生物學專家講座第21頁起始培養(yǎng)時菌絲體培養(yǎng)18小時后菌絲體圖示絲狀真菌沉淀生長沈萍微生物學專家講座第22頁影響原因：接種體積大小、接種物是否凝集、以及菌絲體是否易于斷裂等原因綜合作用決定著絲狀微生物是絲狀生長還是沉淀生長。工業(yè)發(fā)酵意義：絲狀微生物在液體培養(yǎng)中生長方式在工業(yè)生產(chǎn)中很主要，因為它影響發(fā)酵過程通氣性、生長速率、攪拌能耗及菌絲體與發(fā)酵液分離難易等。沈萍微生物學專家講座第23頁2.絲狀微生物群體生長曲線

絲狀微生物群體生長有著與單細胞微生物類似規(guī)律。沈萍微生物學專家講座第24頁沈萍微生物學專家講座第25頁分批培養(yǎng)優(yōu)缺點優(yōu)點操作簡單，周期短，染菌機會少，生產(chǎn)過程和產(chǎn)品質量輕易掌握缺點產(chǎn)率低，難以自動控制非生產(chǎn)時間占用多沈萍微生物學專家講座第26頁二.生長數(shù)學模型三.主要生長參數(shù)四.同時培養(yǎng)概念：方法

機械法：離心，過濾，硝酸纖維素濾膜環(huán)境控制：溫度，營養(yǎng)，光暗交替五.連續(xù)培養(yǎng)概念：經(jīng)過一定方式使微生物能以恒定比生長速率生長并能連續(xù)生長下去一個培養(yǎng)方法。

以一定速率流加培養(yǎng)基以一樣速率流出培養(yǎng)物沈萍微生物學專家講座第27頁單罐循環(huán)式連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)離心機濃縮細胞培養(yǎng)基流入最終流出液沈萍微生物學專家講座第28頁多罐連續(xù)培養(yǎng)流入流出沈萍微生物學專家講座第29頁管式反應器連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)液管式反應器種子罐培養(yǎng)基沈萍微生物學專家講座第30頁連續(xù)培養(yǎng)優(yōu)缺點優(yōu)點控制稀釋速率能夠使發(fā)酵過程最優(yōu)化；發(fā)酵周期長，得到高產(chǎn)量；便于自動控制缺點菌種不穩(wěn)定話，長久連續(xù)培養(yǎng)會引發(fā)菌種退化，降低產(chǎn)量。長時間補料染菌機會大大增加。沈萍微生物學專家講座第31頁思索題：1、細菌生長曲線，對數(shù)生長久，連續(xù)培養(yǎng)，同時培養(yǎng)，菌落形成單位（cfu），同時生長，連續(xù)發(fā)酵，2、什么是細菌生長曲線？分幾個時期？各有何特點，生產(chǎn)上怎樣應用？3、什么是分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)？試述其優(yōu)缺點。沈萍微生物學專家講座第32頁第六章微生物生長

繁殖與控制（續(xù)）沈萍微生物學專家講座第33頁〖本節(jié)重點〗霉菌幾類孢子及酵母菌繁殖方式溫度、pH、氧對微生物生長影響平板菌落計數(shù)法沈萍微生物學專家講座第34頁第三節(jié)真菌生長與繁殖一.絲狀真菌生長繁殖1.斷裂繁殖2.孢子繁殖無性孢子

游動孢子，分生孢子，節(jié)孢子，厚垣孢子，孢囊孢子有性孢子卵孢子，接合孢子，子囊孢子3.絲狀真菌生活史二.酵母菌生長繁殖見前敘述沈萍微生物學專家講座第35頁絲狀真菌細胞頂端生長圖4絲狀真菌菌絲細胞頂端生長模型圖示Allomycesmacrogynus菌絲頂端生長沈萍微生物學專家講座第36頁一.環(huán)境對微生物生長影響

1.營養(yǎng)物質(nutrient)

2.水活性(wateractivity)

微生物aw范圍

aw=0.6---0.99

細菌要求aw較高霉菌要求aw較低第四節(jié)環(huán)境對生長影響及

生長測定沈萍微生物學專家講座第37頁3.溫度(temperature)

生長溫度三基點

溫度生長速率最低最適最高沈萍微生物學專家講座第38頁影響機制：

1、影響酶活性2、影響質膜流動性3、影響物質溶解度按最適溫度劃分

低溫菌中溫菌高溫菌沈萍微生物學專家講座第39頁表6-3微生物生長溫度范圍微生物類型生長溫度(℃)最低最適最高嗜冷微生物0以下1520兼性嗜冷微生物020-3035嗜溫微生物15-2020-4545以上嗜熱微生物4555-6580嗜高溫微生物6580-90100以上沈萍微生物學專家講座第40頁微生物高溫下能生長原因①酶蛋白及核糖體有較強抗熱性，②核酸含有較高熱穩(wěn)定性（核酸中G+C含量高（tRNA），③細胞膜中飽和脂肪酸含量高，較高溫度下能維持正常液晶狀態(tài)。沈萍微生物學專家講座第41頁嗜冷微生物在低溫下生長機理①它們體內酶能在低溫下有效地催化，在高溫下酶活喪失②細胞膜中不飽和脂肪酸含量高，低溫下也能保持半流動狀態(tài)，能夠進行物質運輸。

沈萍微生物學專家講座第42頁4.pH微生物生長pH值三基點：

pH生長速率最低最高最適pH沈萍微生物學專家講座第43頁影響機制：

◆影響膜表面電荷性質及膜通透性，進而影響對物質吸收能力?！舾淖兠富?、酶促反應速率及代謝路徑：如：酵母菌在pH4.5-5產(chǎn)乙醇，在pH7.6產(chǎn)甘油、乙醇、乙酸?！粲绊懪囵B(yǎng)基中營養(yǎng)物質離子化程度，從而影響營養(yǎng)物質可給性，或有毒物質毒性。沈萍微生物學專家講座第44頁微生物生長pH值范圍絕大多數(shù)種類都生活在pH5.0－9.0。微生物按最適pH值分為：

嗜堿微生物：硝化細菌、、多數(shù)放線菌

耐堿微生物：許多鏈霉菌中性微生物：絕大多數(shù)細菌，一部分真菌嗜酸微生物：硫桿菌屬耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌沈萍微生物學專家講座第45頁微生物生命活動對環(huán)境pH值影響分解糖類、脂肪等，產(chǎn)生酸性物質，pH分解蛋白質、尿素等，產(chǎn)生堿性物質，pH無機鹽選擇性吸收：

銨鹽吸收（(NH4)2SO4）pH↓硝酸鹽吸收(NaNO3)，pH↑沈萍微生物學專家講座第46頁即使微生物生活環(huán)境pH值范圍較寬，不過其細胞內pH值卻相當穩(wěn)定，普通都靠近中性。培養(yǎng)過程中調整pH值辦法過酸時：加入堿或適量氮源，提升通氣量過堿時：加入酸或適量碳源，降低通氣量

沈萍微生物學專家講座第47頁5.氧沈萍微生物學專家講座第48頁表6-6微生物與氧關系微生物類型最適生長O2濃度(V/V)好氧等于或大于20%微好氧2-10%氧忍耐型2%以下兼性厭氧有氧或無氧專性厭氧不需要氧、有氧時死亡沈萍微生物學專家講座第49頁好氧微生物

含SOD和H2O2酶，氧氣是最終電子受體，增氧培養(yǎng)。微好氧微生物

O2分壓占2-10%，氧氣是最終電子受體。沈萍微生物學專家講座第50頁耐氧微生物

有SOD缺H2O2酶，氧氣無毒兼性厭氧微生物

含SOD和H2O2酶，有氧—呼吸，無氧---發(fā)酵專性厭氧微生物

缺SOD和cyt酶，氧氣有毒沈萍微生物學專家講座第51頁沈萍微生物學專家講座第52頁1）固體好氧培養(yǎng)方法

瓊脂斜面和瓊脂平皿培養(yǎng)好氧培養(yǎng)方法

沈萍微生物學專家講座第53頁香菇固體栽培床沈萍微生物學專家講座第54頁沈萍微生物學專家講座第55頁2）液體好氧培養(yǎng)方法

恒溫振蕩培養(yǎng)箱沈萍微生物學專家講座第56頁試驗室小型全自動發(fā)酵罐沈萍微生物學專家講座第57頁工業(yè)發(fā)酵車間沈萍微生物學專家講座第58頁沈萍微生物學專家講座第59頁厭氧培養(yǎng)方法

微生物厭氧培養(yǎng)箱沈萍微生物學專家講座第60頁沈萍微生物學專家講座第61頁二.微生物生長測定1.計數(shù)法2.重量法3.生理指標法直接計數(shù)間接計數(shù)膜濾計數(shù)比濁計數(shù)沈萍微生物學專家講座第62頁直接計數(shù)沈萍微生物學專家講座第63頁間接計數(shù)沈萍微生物學專家講座第64頁（三）比濁法沈萍微生物學專家講座第65頁2)薄膜過濾平皿計數(shù)法沈萍微生物學專家講座第66頁（二）微生物生物量測定方法1.濕重法

搜集微生物菌體，或將微生物培養(yǎng)液離心，搜集細胞沉淀物，然后稱重。2.干重法

將微生物菌體或離心得到細胞沉淀物置100—105℃烘箱中干燥至水份去除，然后再稱重。3.細胞成份含量法

如蛋白質、還原糖、總糖、核酸等含量測定。因為每個細胞成份含量是一定，單位體積培養(yǎng)液中微生物群體細胞數(shù)目越多，總細胞成份含量就越多。沈萍微生物學專家講座第67頁微生物生長測定方法比較測定細胞數(shù)目方法特點與應用總細胞數(shù)血球計數(shù)板法較快速簡便，但較費時薄膜過濾染色法快速簡便，適于含菌數(shù)很低空氣、水等中總菌計數(shù)活細胞數(shù)平皿菌落計數(shù)法簡易價廉，但花費時間較長，不能立刻知道結果薄膜過濾平皿法靈敏度高,不用于高密度培養(yǎng)物，不能立刻知道結果測定物質量比濁法快速簡便，敏感度低，適于不發(fā)酵液或液體中快速總細胞數(shù)預計，但需事先標定細胞濕重法較為簡便，但含水量不定，準確度差細胞成份含量法如測定蛋白質、核酸、還原糖含量等細胞干重法較為費時，易受顆粒雜質干擾，敏感度低沈萍微生物學專家講座第68頁思索題

最適生長溫度，專性厭氧菌，兼性厭氧菌，試述溫度對微生物影響試述霉菌繁殖方式圖示并說明釀酒酵母生活史。沈萍微生物學專家講座第69頁第六章微生物生長

繁殖與控制

（續(xù)）沈萍微生物學專家講座第70頁本節(jié)重點1、抗代謝物；抗生素作用機制2、高溫滅菌方法及要求3、高壓蒸汽滅菌操作與要求沈萍微生物學專家講座第71頁幾個概念消毒（Disinfection)：消毒是利用某種方法殺死或滅活物質或物體中全部病原微生物一個辦法。

滅菌(Sterilization)：滅菌是指利用某種方法殺死物體中包含芽孢在內全部微生物一個辦法。第五節(jié)微生物生長繁殖控制沈萍微生物學專家講座第72頁防腐(Antiseptsis)：防腐是在一些化學物質或物理因子作用下，能預防或抑制微生物生長一個辦法，它能預防食物腐敗或預防其它物質霉變。化療(Chemotherapy)：化療是指利用含有選擇毒性化學物質對生物體內部被微生物感染組織進行治療，以殺死組織內病原微生物，但對機體本身無毒害作用治療辦法。

沈萍微生物學專家講座第73頁時間細胞數(shù)對數(shù)殺菌、溶菌、制菌區(qū)分總菌數(shù)活菌數(shù)沈萍微生物學專家講座第74頁1.抗微生物劑(antimicrobialagent)

概念:分類:消毒防腐劑作用機理①使微生物蛋白質凝固變性,如酒精等.②破壞菌體酶系統(tǒng),如過氧化氫等.③增加細胞膜通透性,使細胞發(fā)生破裂或溶解.如來蘇兒等酚類物質.一.控制微生物化學物質沈萍微生物學專家講座第75頁抗微生物劑作用范圍作用機理防腐劑：

有機汞皮膚與蛋白質巰基結合0.1-1%硝酸銀眼睛發(fā)炎蛋白質沉淀碘液皮膚與酪氨酸結合，氧化劑70%乙醇皮膚脂溶劑和蛋白質變性六六粉(酚)玻璃器皿破壞細胞質膜肥皂、洗液、除臭劑陽離子化合物玻璃器皿與膜上磷酯相互作用3%過氧化氫溶液皮膚氧化劑沈萍微生物學專家講座第76頁抗微生物劑作用范圍作用機理消毒劑：

HgCl2桌子、地板等與巰基結合CuSO4游泳池、供水池蛋白質沉淀碘液醫(yī)用器械用具與蛋白質酪氨酸結合氯氣供水池氧化劑含氯化合物奶制品與食品設備，氧化劑酚化合物表面蛋白質變性陽離子去垢劑醫(yī)用儀器、食品與奶制品等設備與磷酯相互作用乙烯氧化物、甲醛溫度敏感塑料制品烷化劑臭氧食用水強氧化劑沈萍微生物學專家講座第77頁2.抗代謝物

(antimetabolite)

概念－－有些化合物在結構上與生物體所必需代謝物很相同，以致于能夠和特定酶結合，從而妨礙酶功效，干擾代謝正常進行，這些物質叫抗代謝物．作用機理作為基本生長因子競爭性抑制劑假冒正常代謝物反饋抑制正常代謝物調整沈萍微生物學專家講座第78頁種類：磺胺藥——對氨基苯甲酸；6-巰基嘌呤——嘌呤；5-甲基色氨酸——色氨酸；異煙肼——吡哆醇。

沈萍微生物學專家講座第79頁磺胺結構H2NSO2NH2H2NCOOH對氨基苯甲酸結構沈萍微生物學專家講座第80頁沈萍微生物學專家講座第81頁3.抗生素（antibiotic）概念：-----由一些生物在其生命過程中所產(chǎn)生一類低分子量代謝產(chǎn)物或其人工衍生物，在很低濃度下就能干擾它種生物生命活動。抗菌譜－－各種抗生素有其不一樣制菌范圍

廣譜型抗生素狹譜型抗生素進展－－從抗菌素抗生素生物藥品素沈萍微生物學專家講座第82頁

抗生素作用機制：

1）抑制細胞壁合成（如：青霉素）2）破壞細胞膜功效；（如：多粘菌素）3）抑制蛋白質合成；（如：氯霉素，四環(huán)素、鏈霉素等）4）干擾核酸代謝；（如：利福霉素)5)影響呼吸鏈;

(如抗霉素）沈萍微生物學專家講座第83頁沈萍微生物學專家講座第84頁微生物抗藥性（1）細胞質膜透性改變（2）藥品作用靶位點改變（3）修飾藥品（4）藥品阻斷路徑變異（5）排除藥品沈萍微生物學專家講座第85頁二.控制微生物物理原因1.高溫滅菌原理

：

干熱滅菌濕熱滅菌火焰灼燒熱空氣常壓加壓巴氏消毒煮沸消毒間歇滅菌常規(guī)加壓連續(xù)加壓方法沈萍微生物學專家講座第86頁

高壓蒸汽滅菌

操作步驟

滅菌要求0.1MPa、15磅/英寸21Kg/cm2

121℃20—30min

注意事項放