TRAIL聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤HOS-8603細(xì)胞凋亡研究(全文)

精品文檔-下載后可編輯TRAIL聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)骨肉瘤HOS-8603細(xì)胞凋亡研究(全文)【摘要】目的研究TRAIL聯(lián)合順鉑誘導(dǎo)HOS-8603細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制。方法MTT法分別測定TRAIL，順鉑，和TRAIL+順鉑對HOS-8603細(xì)胞的抑制率，流式細(xì)胞法測定亞G1期細(xì)胞百分率及PI和Rh123雙染色后細(xì)胞的ΔΨm。結(jié)果三組分別由TRAIL、順鉑、TRAIL+順鉑處理過的HOS-8603細(xì)胞用MTT法測抑制率分別為29%、33.6%、58.5%。隨著藥物作用時(shí)間增加,HOS-8603細(xì)胞凋亡數(shù)增加和ΔΨm降低(P

【關(guān)鍵詞】TRAIL；順鉑；細(xì)胞凋亡

骨肉瘤是一種相對耐藥的腫瘤,單藥化療的效果一直不很理想。聯(lián)合化療多以鉑類藥物為主。TRAIL是INF超家族成員，能選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TRAIL與鉑類藥物聯(lián)合化療方案的可行性，為骨肉瘤的臨床治療提供參考。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料HOS-8603細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所;TRAIL、順鉑、CsA均購自Sigma公司(化學(xué)純標(biāo)準(zhǔn)品)。主要器材：流式細(xì)胞儀型號:EPICSALTRAⅡ.AmericanBeckman;熒光酶標(biāo)儀型號:GENIOSVA200,AUSTRIATECAN。

1.2藥物配制將TRAIL用生理鹽水溶解并分別配制成10ug/ml和50ug/ml兩種濃度的儲藏液。將順鉑、CsA分別用生理鹽配制成10ug/ml的儲藏液,備用。

1.3凋亡細(xì)胞熒光染色HOS-8603細(xì)胞以1×106接種于六孔板培養(yǎng),加入不同濃度的TRAIL+順鉑,培養(yǎng)24h后,經(jīng)DHanks液洗滌及熒光染料Hoechst33258和PI，37℃避光染色10min，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及顏色改變。

1.4透射電鏡觀察1000r/min,離心10min收集處理后的HOS-8603細(xì)胞,經(jīng)固定、脫水、包被及乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙染色處理后透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5MTT法測定TRAIL，順鉑，TRAIL+順鉑對HOS-8603細(xì)胞生長的影響取對數(shù)生長期HOS-8603細(xì)胞,以2×106/ml的細(xì)胞濃度,接種于上述三種藥物處理培養(yǎng)基中,以生理鹽水為空白對照組。將每種藥物組分兩組,其中一組在加藥物前30min加入終濃度1.0μg/mlCsA［10,11］,每組設(shè)3個(gè)平行對照孔。

1.6細(xì)胞DNA含量分布測定取藥物處理12，24,36,48h后HOS-8603細(xì)胞,經(jīng)固定、染色后流式細(xì)胞儀測定DNA。

1.7細(xì)胞ΔΨm檢測參照文獻(xiàn)［1,2］,取上述三種藥物處理12,24,36,48h后的HOS-8603細(xì)胞,經(jīng)DHanks液洗滌后用10ug/mlRh123在37℃避光染色30min,再次洗滌后用10ug/mlPI在37℃避光染色20min,流式細(xì)胞儀檢測。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包作方差分析對各組作顯著性檢驗(yàn)，TRAIL組與TRAIL加CsA組采用配對t檢驗(yàn)，以P

2結(jié)果

2.1HOS-8603細(xì)胞分別經(jīng)2.5ug/mlTRAIL，1.0ug/ml順鉑，2.5μg/mlTRAIL+1.0μg/ml順鉑作用后,都出現(xiàn)了明顯的凋亡峰，亞G1期細(xì)胞百分率分別為29.3%，57%，83%。聯(lián)合用藥組明顯高于單一用藥組(P

2.2在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈彌散均勻熒光，出現(xiàn)凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密顆粒塊狀熒光。如圖1示。

比較兩圖中的同一細(xì)胞高藍(lán)/低紅為凋亡細(xì)胞；低藍(lán)/高紅為壞死細(xì)胞；低藍(lán)/低紅為正常細(xì)胞。

2.3HOS-8603細(xì)胞經(jīng)2.5ug/mlTRAIL+1.0ug/ml順鉑作用12h后,倒置顯微鏡下見細(xì)胞體積縮小，開始呈圓形，以細(xì)胞表面起泡，變成不規(guī)則形狀。緊鄰細(xì)胞之間出現(xiàn)空虛，有離群，脫落感。透射電鏡下見凋亡細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的濃縮，形成染色質(zhì)塊，并集聚在核的邊緣，呈半月形，花瓣?duì)罨撞烤o貼核膜。胞質(zhì)凝縮，最后核斷裂，細(xì)胞通過出芽的方式形成許多凋亡小體，其外有完整的膜封閉，其內(nèi)有結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞器，還有凝縮的染色體；線粒體腫脹，空泡狀，外膜破裂，內(nèi)膜脹大呈氣球狀，脊消失。如圖3所示。

圖2A染色質(zhì)濃縮，形成染色質(zhì)塊，并邊聚在核的邊緣，呈半月形，花瓣?duì)睿撞烤o貼核膜。

圖2B線粒體腫脹，空泡化，內(nèi)膜腫大呈氣球狀，脊消失。胞質(zhì)間可見早期凋亡小體。

2.4經(jīng)TRAIL+順鉑和TRAIL+順鉑+CsA處理后的細(xì)胞ΔΨm變化如表2所示;TRAIL+順鉑組的Rh123-PI-細(xì)胞百分率均明顯高于空白對照組(P

2.5TRAIL+順鉑作用于HOS-8603細(xì)胞后Rh123-PI-與亞G1期細(xì)胞百分率間有直線相關(guān)關(guān)系(r=0.998,P

3討論

聯(lián)合化療是目前提高骨肉瘤細(xì)胞對化療的敏感性的研究熱點(diǎn)。本研究中TRAIL+順鉑的MTT法測定抑制率為58.5%。明顯優(yōu)于兩者單用(P

亞G1期細(xì)胞出現(xiàn)是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志之一。本研究中我們采用了TRAIL、順鉑,TRAIL+順鉑分別作用于HOS-8603細(xì)胞后測定亞G1期細(xì)胞百分率,結(jié)果顯示TRAIL+順鉑組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用顯著高于TRAIL組和順鉑組(P

近年來研究證實(shí)，線粒體在細(xì)胞凋亡控制中起決定性作用［3,4］線粒體的早期改變?yōu)椋壕€粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)開放，釋放線粒體內(nèi)凋亡相關(guān)物質(zhì)，這些物質(zhì)激活Caspase-9酶系，從而引發(fā)連鎖反應(yīng)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。MPTP是跨膜多蛋白孔,可能由電壓依賴的陰離子通道(VDAC)-腺苷酸移位酶-親環(huán)蛋白-D(CyP-D)三聯(lián)復(fù)合物構(gòu)成［5-8］。在正常情況下MPTP只允許質(zhì)子等分子量較小的物質(zhì)通過線粒體膜,形成穩(wěn)定ΔΨm。MPTP開放可導(dǎo)致ΔΨm下降或喪失,因此，可通過檢測ΔΨm觀察線粒體的改變［9-11］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)TRAIL和順鉑處理后的HOS-8603細(xì)胞ΔΨm隨藥物作用時(shí)間的增加而下降，并且與線粒體超微結(jié)構(gòu)改變相一致。

順鉑和TRAIL聯(lián)合化療既增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對其化療的敏感性，又減少了順鉑的使用劑量。我們相信TRAIL和順鉑的聯(lián)合化療方案會有很廣闊的臨床應(yīng)用前景。由于體外細(xì)胞株培養(yǎng)不能模仿體內(nèi)三維結(jié)構(gòu)，不能準(zhǔn)確反映藥物-人體-腫瘤的復(fù)雜關(guān)系，且腫瘤具有一定的異質(zhì)性。因此只能從實(shí)驗(yàn)的角度來肯定聯(lián)合應(yīng)用順鉑和TRAIL，能取得比單獨(dú)應(yīng)用順鉑或TRAIL更明顯的對骨肉瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒性作用，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但進(jìn)一步的結(jié)果尚需更深入的研究。

參考文獻(xiàn)

［1］GriffithTS,ChinWA,JacksonGC,etal.IntracellularregulationofTRAIL-inducedapoptosisinhumanmelanomacells.JImmunol,1998,161:2833-2840.

［2］祝少博,陳振光,喻愛喜,方成.人可溶性蛋白誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.中華骨科雜志,2022,23(6).

［3］李寧麗,路麗明,沈佰華,等.重組人可溶性.ThereceptorforthecytotoxicligandTRAIL.Science,1997,276:111-113.

［4］TRAIL分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)理探討.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，23(1).

［5］范清林,宋禮華,魏偉.的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與臨床.中國藥理學(xué)通報(bào),2022,19(9)：976-981.

［6］HalestrapAP,DoranE,GllespieJP,etal.Mitochondrialandcelldeath.BiochemiSociTransac,2000,28:170-177.

［7］LarochetteN,DecaudinD,JacototE,etal.Arseniteinducesapoptosisviaadirecteffectonthemitochondrialpermeabilitytransitionpore.ExpcellRes,1999,249:413-421.

［8］GajateC,AntonioMS,Machoa,etal.Involvmentofmitochondrialandcaspase-3inET-18-OCH3-inducedapoptosisofhumanleukemiccells.InterJCancer,2000,86:208-218.

［9］沈玉雷，陳國強(qiáng)，蔡循,等.谷胱甘肽合成酶抑制劑加強(qiáng)三氧化二砷的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng).中華腫瘤雜志，1999，21：259-261.

［10］CromptonM.Themitochondriapermeabilitytransitionporeanditsroleincelldeath.BiochomJ,1999,341:233-249.

［11］ShimizuS,KonishiA,KodamaT,etal.BH4domainof