血清清球蛋白分離新

血清清球蛋白分離新2內(nèi)容實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理2實(shí)驗(yàn)材料3實(shí)驗(yàn)過程45注意事項(xiàng)第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天3實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆整}析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握凝膠層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握離子交換層析法分離蛋白質(zhì)的原理和基本方法掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法了解柱層析技術(shù)第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)分組四個(gè)人一小組第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天5實(shí)驗(yàn)過程鹽析（粗分離）葡聚糖凝膠層析（脫鹽）DEAE纖維素離子交換層析（純化）醋酸纖維素薄膜電泳（純度鑒定）第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天6實(shí)驗(yàn)材料人混合血清葡聚糖凝膠（G-25)層析柱DEAE纖維離子交換層析柱飽和硫酸銨溶液醋酸銨緩沖溶液20%磺基水楊酸1%BaCl2溶液氨基黑染色液漂洗液pH8.6巴比妥緩沖溶液電泳儀、電泳槽第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天7實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)的分離和純化是研究蛋白質(zhì)化學(xué)及其生物學(xué)功能的重要手段。不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度及等電點(diǎn)等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天8

蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與常用的分離純化方法蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)常用的純化方法分子質(zhì)量透析、超濾凝膠層析★離心溶解度調(diào)整pH調(diào)整離子強(qiáng)度★降低介電常數(shù)電荷電泳★等電聚焦離子交換層析★特異結(jié)合部位親和層析其他性質(zhì)吸附層析液相層析氣相層析第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天9球蛋白

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等電點(diǎn)4.885.065.065.126.85~7.3相對(duì)分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點(diǎn)、平均分子量及正常含量清蛋白A第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天101.粗提（鹽析法）由于血清中各種蛋白質(zhì)分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣。調(diào)節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質(zhì)沉淀從而達(dá)到分離的目的。血清清蛋白球蛋白半飽和硫酸銨清蛋白不沉淀，上清球蛋白沉淀，蒸餾水溶解第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天鹽析法鹽析法是在蛋白質(zhì)溶液中，加入無機(jī)鹽至一定濃度或達(dá)飽和狀態(tài)，可使蛋白質(zhì)在水中溶解度降低，從而分離出來。水化膜減弱、消失。蛋白質(zhì)溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，致使蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜減弱乃至消失。蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和。中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后由于離子強(qiáng)度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，更加導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低，蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天122.脫鹽（凝膠層析）鹽析分離的蛋白質(zhì)溶液中含有大量無機(jī)鹽，必須先脫鹽后才能進(jìn)一步純化。脫鹽有多種方法，本實(shí)驗(yàn)采用凝膠層析法。凝膠層析法主要是根據(jù)混合物中各種物質(zhì)分子大小的不同而將其分離的技術(shù)。第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天凝膠層析分離示意圖第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天14凝膠層析分離化合物示意圖第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天153.純化（離子交換層析）離子交換層析是指流動(dòng)相中的離子和固定相上的離子進(jìn)行可逆的交換，利用化合物的電荷性質(zhì)及電荷量不同進(jìn)行分離R-SO3-H++Pr+R-SO3-Pr++H+陽離子交換陰離子交換R-N+R3OH-+Pr-R-N+R3Pr-+OH-第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天16球蛋白

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等電點(diǎn)4.885.065.065.126.85~7.3相對(duì)分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點(diǎn)、平均分子量及正常含量清蛋白A第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天0.06mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白pI4.9，帶負(fù)電荷多a、b球蛋白pI5.0～5.2，帶負(fù)電荷少a、b球蛋白被洗脫,清蛋白仍被吸附0.02mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白的pI＜6.5

，帶負(fù)電荷g–球蛋白pI＞6.5，帶正電荷清蛋白及a、b球蛋白被層析柱吸附,g-球蛋白被洗脫0.3mol/LNH4AcpH6.5DEAE帶正電荷緩沖液離子強(qiáng)度增加清蛋白被洗脫第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天18第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天194.純度鑒定（電泳）血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳結(jié)果第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天20球蛋白

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等電點(diǎn)4.885.065.065.126.85~7.3相對(duì)分子量（×104）6.920309~1515.6~30含量（％）57~672~54~96.2~1212~20血清蛋白的等電點(diǎn)、平均分子量及正常含量清蛋白A第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天21醋酸纖維素薄膜電泳原理

血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，一般都低于pH7.4。它們?cè)趐H8.6的緩沖液中均解離帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于血清中各種蛋白質(zhì)分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天22醋酸纖維素薄膜電泳1.點(diǎn)樣(粗面)8cm2cm點(diǎn)樣線點(diǎn)樣區(qū)1.5cm(粗面）點(diǎn)樣線盡量點(diǎn)得細(xì)窄而均勻,寧少勿多－＋小組標(biāo)記樣品標(biāo)記第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天232.電泳薄膜粗面向下點(diǎn)樣端置陰極端兩端緊貼在濾紙鹽橋上，膜應(yīng)輕輕拉平注意：切勿使點(diǎn)樣處與電泳槽接觸電壓：110V時(shí)間：50min。第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天243.染色和漂洗電泳完畢后，關(guān)閉電源，將膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，盡量瀝凈染色液，移入漂洗液中浸洗脫色（一般更換2次），至背景顏色脫凈為止。取出膜，用濾紙吸干即可。第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液洗脫，流出液量約1ml時(shí)開始檢測(cè)蛋白質(zhì)取血清0.8ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白)用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時(shí)開始檢測(cè)蛋白質(zhì)凝膠柱層析除鹽磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時(shí)磺基水楊酸和BaCl2檢測(cè)可能同時(shí)陽性繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測(cè)SO42-陰性用2~3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時(shí)磺基水楊酸和BaCl2檢測(cè)可能同時(shí)陽性繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌BaCl2檢測(cè)SO42-陰性用2~3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡鹽析操作流程離子交換柱層析純化加樣加樣第25頁,共27頁，2024年2月25日，星期天用1ml0.0６mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約５mL0.06mol/LNH4AC緩沖液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白離子交換柱層純化除鹽后收集的清蛋白用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開始檢測(cè)蛋白質(zhì)取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10d，連續(xù)收集3管DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白除鹽后收集的球蛋白過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）用0.3mol/LNH4AC緩沖液(約3ml)洗脫，流出液量約2ml開始檢測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10d，連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC緩沖液流洗再生平衡離子交換柱再生和蛋白純度鑒定2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)第26頁,共27頁，2024年2月25日，星期天27注意事項(xiàng)所用血清應(yīng)新鮮