食品中銅綠假單胞菌檢測

食品中銅綠假單胞菌檢測銅綠假單胞菌可由多種途徑傳播，但主要是通過污染醫(yī)療器械、用具及帶菌醫(yī)護(hù)人員引起醫(yī)源性感染，因此，對燒傷病房、手術(shù)器械及治療器械應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格消毒滅菌，以保證無銅綠假單胞菌的污染。對銅綠假單胞菌感染的治療，可應(yīng)用慶大霉素、多粘菌素B和羧芐青霉素。銅綠假單胞菌抵抗力較其他革蘭陰性菌強(qiáng)，56℃1h可殺滅，對很多抗生素具有耐受性。對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素及不良環(huán)境抵抗力強(qiáng)，對化學(xué)藥物的抵抗力比一般革蘭氏陰性菌強(qiáng)大。第2頁,共30頁，2024年2月25日，星期天二、生物學(xué)特性1.培養(yǎng)特性本菌屬于假單胞菌屬，是一種非發(fā)酵革蘭陰性無芽孢桿菌，菌體細(xì)長且長短不一，有時呈球桿狀或線狀，成對或短鏈狀排列。菌體的一端有單鞭毛，在暗視野顯微鏡或相差顯微鏡下觀察可見細(xì)菌運(yùn)動活潑。2．菌體形態(tài)無芽孢，無夾膜，革蘭陰性桿菌，有單鞭毛或叢鞭毛，運(yùn)動活潑。菌體的大小為0.5～1μm×1.5～3.0μm，菌體筆直或彎曲。第3頁,共30頁，2024年2月25日，星期天3、生化特性氧化酶和過氧化氫酶陽性。O/F試驗為氧化型，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，分解乙酰胺產(chǎn)生氨。98％菌株產(chǎn)生水溶性熒光色素。銅綠假單胞菌能液化明膠，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90％以上的菌株產(chǎn)生藍(lán)綠色色素。分解蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，發(fā)酵糖類能力較低，氧化分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解甘露醇、乳糖及蔗糖，能液化明膠，分解尿素，不形吲哚，氧化酶試驗陽性，還原硝酸鹽產(chǎn)氣，靛基質(zhì)陰性，不產(chǎn)硫化氫。第4頁,共30頁，2024年2月25日，星期天三、致病性?主要致病物質(zhì)是內(nèi)毒素，此外尚有菌毛、莢膜、胞外酶和外毒素等多種致病因子?？梢鹁植炕撔匝装Y，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃腸炎、心內(nèi)膜炎、膿胸，還可引起菌血癥、敗血癥及引起嬰兒嚴(yán)重的流行性腹瀉。?WHO的HACCP評估明確指出銅綠假單胞菌是嬰兒瓶裝飲用水的危害指示菌，可造成嬰兒腹瀉。尤其是抵抗力較差的老弱病幼孕人群，飲用含銅綠假單胞菌的瓶裝水很可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生，患者食入103~104個菌體細(xì)胞即可被侵害。銅綠假單胞菌的生長還將增加亞硝酸鹽的含量-參考文獻(xiàn)。第5頁,共30頁，2024年2月25日，星期天

國內(nèi)外污染情況-參考文獻(xiàn)?國內(nèi)污染情況：-瓶裝天然礦泉水銅綠假單胞菌的檢出率1.2％～23.6％；-瓶裝飲用純凈水銅綠假單胞菌的檢出率11.6％。?國外污染情況：-Richards等在104件檢品中的4件分離到銅綠假單胞菌；-Rosenberg報告德國1.2％～10.2％的瓶裝礦泉水檢出銅綠假單胞菌。?剛出廠的產(chǎn)品中銅綠假單胞菌數(shù)量較少，但有文獻(xiàn)報道5加侖桶裝產(chǎn)品（15～31天的保存期），銅綠假單胞菌可生長繁殖達(dá)到CFU/ml。?國內(nèi)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：0CFU/250ml第6頁,共30頁，2024年2月25日，星期天三、實驗室檢驗

GB/T8538-2008

銅綠假單胞菌檢測（濾膜法）第7頁,共30頁，2024年2月25日，星期天原理

將250mL水樣用孔徑為0.45μm的濾膜過濾，并將濾膜移至CN瓊脂培養(yǎng)基上，于36℃士1℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，能夠在CN瓊脂上生長并產(chǎn)生綠膿菌素，或者能夠在CN瓊脂上生長并且氧化酶呈陽性、紫外光（360±20nm）照射下能發(fā)熒光、能夠利用乙酰胺產(chǎn)氨的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，經(jīng)證實為銅綠假單胞菌，則其檢測結(jié)果為陽性。第8頁,共30頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基和試劑?假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂（低溫避光保存）?金氏B培養(yǎng)基（低溫避光保存）?乙酰胺肉湯?營養(yǎng)瓊脂?氧化酶試劑?鈉氏試劑（配制好之后低溫避光保存）第9頁,共30頁，2024年2月25日，星期天

設(shè)備和儀器?玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘?恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃?紫外燈：波長應(yīng)為360±20nm?濾膜：直徑47mm，微孔徑為0.45μｍ

（處理方法：如濾膜未經(jīng)滅菌，則使用前需先將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水，用蒸餾水洗滌2次～3次，以除去殘留溶劑。建議使用一次性無菌濾膜。）?顯微鏡：10×～100×?冰箱：0℃～8℃第10頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共30頁，2024年2月25日，星期天操作步驟-水樣過濾在100級的潔凈工作臺進(jìn)行過濾操作。首先用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將250mL水樣或稀釋液通過孔徑0.45μm的濾膜過濾，然后將過濾后的濾膜貼在已制備好的CN瓊脂平板上，平鋪并避免在濾膜和培養(yǎng)基之間夾留著氣泡。第13頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共30頁，2024年2月25日，星期天結(jié)果觀察培養(yǎng)20h～24h觀察濾膜上菌落的生長情況并計數(shù)，防止因為培養(yǎng)導(dǎo)致菌落過分生長而出現(xiàn)菌落融合。（40h～48h時更容易觀察產(chǎn)色素情況和熒光情況）。第16頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共30頁，2024年2月25日，星期天可疑菌落計數(shù)情況?計數(shù)所有顯藍(lán)色或綠色（綠膿色素）的菌落，初步判定為銅綠假單胞菌。?計數(shù)濾膜上所有發(fā)熒光不產(chǎn)綠膿色素疑似銅綠假單胞菌菌落，并進(jìn)行乙酰胺肉湯確定試驗。（在紫外線下檢查濾膜時，應(yīng)避免長時間在紫外光下照射，否則可能會將平板上的菌落殺滅，而導(dǎo)致無法在證實培養(yǎng)基上生長。）?將其它所有紅褐色不發(fā)熒光的菌落進(jìn)行氧化酶試驗、乙酰胺肉湯、金氏B培養(yǎng)基確證實驗。第20頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共30頁，2024年2月25日，星期天純化?營養(yǎng)瓊脂：將需驗證的可疑菌落劃線接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于36℃±1℃培養(yǎng)20h～24h，對可疑菌進(jìn)行純化。第22頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共30頁，2024年2月25日，星期天將最初顯紅褐色的菌落進(jìn)行氧化酶試驗?氧化酶試驗：?原理：氧化酶（細(xì)胞色素氧化酶）是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。?操作：取2～3滴新鮮配制的氧化酶試劑滴到放于平皿里的潔凈濾紙上。用鉑金絲接種環(huán)或玻璃棒，將適量的純種培養(yǎng)物涂布在預(yù)備好的濾紙上。在10秒內(nèi)顯深藍(lán)紫色的視為陽性反應(yīng)。也可以按照商品化氧化酶測試產(chǎn)品的說明書進(jìn)行該項測試。第24頁,共30頁，2024年2月25日，星期天產(chǎn)氨實驗（乙酰胺肉湯）?原理：銅綠假單胞菌產(chǎn)生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經(jīng)脫酰胺作用釋放氨，滴加鈉氏試劑（碘化汞鉀），氨在堿性條件下與碘化汞鉀作用，生成紅色的絡(luò)合物。?操作：將純培養(yǎng)物接種到裝有乙酰胺肉湯的試管中，在36℃±1℃下培養(yǎng)20h～24h。然后向每支試管培養(yǎng)物加入1～2滴鈉氏試劑，檢查各試管的產(chǎn)氨情況，如表現(xiàn)出從深黃色到磚紅色的顏色變化，則為陽性結(jié)果，否則為陰性。第25頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共30頁，2024年2月25日，星期天產(chǎn)熒光素實驗（金氏B培養(yǎng)基）?原理：蛋白胨提供氮源，磷酸鹽促進(jìn)熒光素的產(chǎn)生并抑制綠膿色素的產(chǎn)生，硫酸鎂為熒光素的產(chǎn)生提供必須的陽離子，瓊脂是培養(yǎng)基的凝固。?操作：將上述呈紅褐色的且氧化酶反應(yīng)呈陽性的培養(yǎng)物接種于金氏B培養(yǎng)基上，于36℃±1℃恒溫箱培養(yǎng)24h～5d。每天需取出在紫外燈下檢查其是否產(chǎn)生熒光性，將5d內(nèi)產(chǎn)生熒光的菌落記錄為陽性。第27頁,共30頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共30頁，2024年2月25日，星期天計數(shù)結(jié)果說明?菌落計數(shù)公式：N＝P＋F(cF/nF)＋R(cR/nR)–P是呈藍(lán)/綠色的菌落數(shù)（所有證實為銅綠假單胞菌的菌落）。–F是沒有綠膿色素但顯熒光的菌落數(shù)。–R是呈紅褐色的菌落數(shù)。–nF是進(jìn)行產(chǎn)氨測試的顯熒光菌落數(shù)。–cF是產(chǎn)氨陽性的顯熒光菌落數(shù)。–nR是進(jìn)行產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測試的紅褐色菌落數(shù)。–cR是產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測試均呈陽性的紅褐色菌落數(shù)。第29頁,共30頁，2024年2月25日，星期天舉例N=17+16×