細(xì)胞凋亡課件

第十二章程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老

程序性細(xì)胞死亡（PCD）細(xì)胞衰老1

第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡（PCD）

受到嚴(yán)格的基因調(diào)控、程序性的細(xì)胞死

亡形式。對生物體的正常發(fā)育、自穩(wěn)態(tài)

平衡及多種病理過程具有重要的意義。

本節(jié)內(nèi)容將涉及：

動物細(xì)胞的程序性死亡

植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的程序性死亡（自學(xué)）2細(xì)胞死亡的方式主要有三種：細(xì)胞凋亡（apoptosis）細(xì)胞壞死（necrosis）

細(xì)胞自噬（autophagy）動物細(xì)胞的程序性死亡3機(jī)體結(jié)構(gòu)細(xì)胞增殖細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)染色體（DNA與蛋白質(zhì)的相互作用）衰老4細(xì)胞凋亡（Apoptosis）●細(xì)胞凋亡一詞的來源：

細(xì)胞凋亡一詞，即apoptosis，源自希臘語，

本意指樹葉的脫落或花瓣的凋零。

選用此詞，是強(qiáng)調(diào)這一過程是一種自然的生

理學(xué)過程，是受基因調(diào)控的主動的生理性細(xì)

胞自殺行為。5

2002年，悉尼·布雷諾爾（英）、羅伯特·霍維茨（美）

和約翰·蘇爾斯頓（英），因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和

細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎。JohnE.Sulston

H.RobertHorvitzSydneyBrenner6

秀麗隱桿線蟲C.elegans是研究PCD的理想材料咽卵巢腸陰門直腸肛門7雌雄同體細(xì)胞數(shù)：體：1090–131=959(cells)生殖：2000雄性（0.05%）細(xì)胞數(shù)：體：1090(cells)生殖：1000幼蟲細(xì)胞數(shù)（個）：體細(xì)胞：556原始生殖細(xì)胞：2

秀麗隱桿線蟲細(xì)胞凋亡情況81、細(xì)胞凋亡的概念：

一種有序的或程序性的細(xì)胞死亡方式，使細(xì)胞接受

某些特定信號刺激后進(jìn)行的正常生理應(yīng)答反應(yīng)。

該過程具有典型的形態(tài)學(xué)和生化特征，凋亡細(xì)胞最

后以凋亡小體的形式被吞噬消化。

細(xì)胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命

的過程，也常被稱為細(xì)胞程序性死亡（即PCD，

programmedcelldeath)。一）細(xì)胞凋亡的概念及特征一、細(xì)胞凋亡92、細(xì)胞凋亡

過程及特征最重要特征：細(xì)胞質(zhì)膜保持完整，內(nèi)含物不外泄，不引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)。需ATP供能凋亡小體形成細(xì)胞凋亡開始正常細(xì)胞凋亡小體被吞噬10胸腺細(xì)胞凋亡過程形態(tài)變化正常凋亡凋亡細(xì)胞表面發(fā)泡，許多泡狀或者芽狀突起，逐漸分隔，形成單個凋亡小體。11胸腺細(xì)胞凋亡過程形態(tài)變化正常凋亡12可逆膨脹細(xì)胞皺縮不可逆膨脹解體破碎胞膜完整細(xì)胞壞死細(xì)胞凋亡133、細(xì)胞凋亡的生化特征（DNA梯狀條帶）1）細(xì)胞色素C誘導(dǎo)0h2）細(xì)胞色素C誘導(dǎo)1h3）細(xì)胞色素C誘導(dǎo)2h4）細(xì)胞色素C誘導(dǎo)3h5）細(xì)胞色素C誘導(dǎo)4h6）陰性對照7）Marker細(xì)胞色素C作用：促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)特異性核酸酶內(nèi)切酶活化。DNA降解成180-200bp片段或其整數(shù)倍片段144、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子1）物理性因子：包括射線（紫外線，

射線等），較溫和的溫度刺激（如：熱激，冷激）等。2）化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子（超氧自由基，H2O2），

DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，正常生理因子

（激素、細(xì)胞生長因子）的失調(diào)及凋亡因子（腫瘤

壞死因子，TNF

）、細(xì)胞毒素等。151、凋亡的生理學(xué)意義：1）生長發(fā)育：

組織與器官的塑造（趾的分化）；動物變態(tài)等2）免疫細(xì)胞分化：淋巴細(xì)胞的克隆選擇3）防御作用：

清除衰老細(xì)胞、DNA損傷的細(xì)胞以及被病原體

感染的細(xì)胞。二）細(xì)胞凋亡的生理意義161）蝌蚪尾巴的消失

蝌蚪在變態(tài)過程中，尾部細(xì)胞發(fā)生凋亡172）脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育

凋亡的神經(jīng)元神經(jīng)元靶細(xì)胞靶細(xì)胞分泌的存活因子通過細(xì)胞凋亡使神經(jīng)元的數(shù)目與靶細(xì)胞相匹配神經(jīng)生長因子等183）發(fā)育過程中手和足的成形過程凋亡細(xì)胞被吞噬后形成趾間隔19胎鼠趾的發(fā)育202、凋亡的病理學(xué)意義1）病原體侵染誘導(dǎo)凋亡—HIV抑制凋亡

—Poxvirus（痘病毒）2）

細(xì)胞凋亡不足腫瘤、自身免疫疾??；3）細(xì)胞凋亡過度神經(jīng)退行性疾病（AD，帕金森癥）、心肌梗塞、

再生障礙性貧血、骨組織壞死等。21三）細(xì)胞凋亡的檢測◆形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳：DNA片段呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測定法（DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法）◆彗星電泳法（cometassay）凋亡細(xì)胞DNA降解片段電荷發(fā)生了變化，在電場泳動

的速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案?！袅魇郊?xì)胞分析（凋亡細(xì)胞為亞二倍體）221、形態(tài)學(xué)觀測1）臺盼藍(lán)染色:臺盼藍(lán)可為活細(xì)胞排斥，但可使死細(xì)胞著色。2）Giemsa染色：

可觀察染色質(zhì)固縮，凋亡小體的形成等。3）透射和掃描電鏡：可觀察凋亡細(xì)胞核的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化，如：染色體固縮，凋亡小體的形成等現(xiàn)象。232、DNALadder檢測1）誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡2）收集凋亡的細(xì)胞，

提取基因組DNA3）以2%的瓊脂糖

膠電泳分離DNA4）EB染色進(jìn)行觀察染色質(zhì)DNA在核小體間被切割243、TUNEL測定法（標(biāo)記DNA斷裂缺口的3’-OH）基因組DNA斷裂時，

暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移

酶（TdT）

的催化下，

加上熒光或DIG標(biāo)記的dUTP，可通過熒光顯微鏡/流式細(xì)胞儀或酶促顯色進(jìn)行檢測。25TUNEL測定法檢測晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡情況264、DAPIStaining方法（與DNA結(jié)合的染料）27四）細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

線蟲（C.elegans）的凋亡研究發(fā)現(xiàn)：

ced3、ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9

基因可阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。

Ced3在哺乳類同源物是ICE（Interleukin-1β-convertingenzyme，白介素-1β

轉(zhuǎn)換酶），

即

Caspase1，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。常見的細(xì)胞凋亡途徑有兩條：Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡（外源、內(nèi)源性）和不依賴于caspase

的細(xì)胞凋亡途徑，兩個途徑一般同時被激活。

281、Caspase家族與凋亡1）Caspase家族簡介

Caspase的活性位點(diǎn)均包含半胱氨酸（Cysteine）

殘基，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽

鍵，故稱天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解

酶（Cysteineasparticacicspecificprotease），

即

Caspase。

Caspase自身以非活化的酶原Procaspase存在，

其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸

位點(diǎn)裂解活化或自身活化。292）caspase超家族成員及功能（15種）執(zhí)行者負(fù)責(zé)切割胞質(zhì)及核內(nèi)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白，產(chǎn)生凋亡對執(zhí)行者前體進(jìn)行切割，激活執(zhí)行者白介素前體的活化，不直接參與凋亡信號的傳遞30Caspase的分類及功能（共15種）ExecutioneroreffectorAutocatalyticinitiator炎癥執(zhí)行者起始者/引發(fā)者31A、起始者：對執(zhí)行者前體進(jìn)行切割、激活

包括：Caspase-2，8，9，10，11

B、執(zhí)行者：切割胞質(zhì)及核內(nèi)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白，產(chǎn)生效應(yīng)

包括：Caspase-3，6，7

C、激活期：

前期細(xì)胞應(yīng)答死亡信號，起始Caspase活化D、執(zhí)行期：后期執(zhí)行Caspase活化，執(zhí)行細(xì)胞死亡3）Caspase的分類：4）Caspase的激活階段：323）Caspase的結(jié)構(gòu)特征①

起始者及執(zhí)

行者均以無

活性的酶原

形式存在；②

N端均含一段前區(qū)域；33④在大亞基的C端含有

一活性中心，其中半

胱氨酸是必需氨基酸。③活性形式由2個大亞基和2個小亞基組成的雜四聚體；Activeenzyme催化位點(diǎn)34Caspase的級聯(lián)效應(yīng)Caspase的酶原活化354）

Caspase的作用底物目前已知的Caspase作用底物約280種36

①凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物（ICAD）CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶（具內(nèi)切酶活性）ICADCADDNACaspaseCaspase的作用底物舉例降解37②核纖層（lamina）蛋白核纖層解體核纖層染色體③細(xì)胞骨架蛋白：

導(dǎo)致細(xì)胞解體，形成凋亡小體

④其他的caspases⑤滅活細(xì)胞凋亡的抑制物38

當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子（FasL，TNF等）刺激后，凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白（Adaptorprotein）結(jié)合，這些銜接蛋

白又募集Procaspase聚集在受體部位，胞質(zhì)內(nèi)的

Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡。2、Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑分為死亡受體（Fas）起始的外源途徑及線粒體起源的內(nèi)源途徑兩條。1）死亡受體起始的外源途徑（書上P450）39下游caspases活化后，作用于底物，裂解核

纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解

Dnase結(jié)合蛋白，使Dnsae釋放，降解DNA

形成DNAladder，裂解參與細(xì)胞連接或附著

的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，

便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂重排（如：磷酯酰絲氨酸由脂雙層內(nèi)頁→外頁），便于吞噬細(xì)

胞識別并吞噬。40外源性死亡受體通路凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體（Fas)配體（FasL)的表達(dá)、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD接頭蛋白41死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物接頭蛋白DD：死亡結(jié)構(gòu)域DED：死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域CARD:caspase募集結(jié)構(gòu)域8，102，9凋亡誘導(dǎo)因子細(xì)胞凋亡內(nèi)源和外源信號途徑Bcl-2家族執(zhí)行者起始者起始者Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子

接頭蛋白

422）Bcl-2家族與線粒體起源的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡

Bcl-2（B-celllymphomagene2）是一種原癌基因，是線蟲抗凋亡蛋白Ced9在哺乳類中的同源物，與線粒體相結(jié)合，能改變線粒體外膜通透性（釋放凋亡因子CytC），抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族成員的基因根據(jù)功能不同可分為兩組：A、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等抑制凋亡；B、Bax、Bak、Bad、Noxa等促進(jìn)凋亡。

43BCL-2家族部分成員Bax和Bak寡聚化，促進(jìn)CytC釋放，引發(fā)凋亡；

Bcl-2、Bcl-xL與Bax/Bak形成異二聚體，阻止Bax和

Bak寡聚化，從而抑制凋亡。44Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡

Bcl-2家族促凋亡因子

Bid被活化后的Caspase8

或其他刺激因素裂解成2個片段，其中含有BH3

（Bcl-2homology）結(jié)構(gòu)域的

C-端片段被運(yùn)送到線粒體，與Bcl-2

/

Bax

的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，

導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子

apoptosisprotease

activatingfactor）結(jié)合并活化Apaf-1，被活化的

Apaf-1再活化Procaspase9，最后引起細(xì)胞凋亡。4546細(xì)胞內(nèi)源信號激發(fā)細(xì)胞程序性死亡起始者執(zhí)行者凋亡蛋白酶活化因子CytC被釋放并與Apaf1結(jié)合47凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體/配體的表達(dá)、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisBid活化線粒體通路活化死亡受體通路與線粒體通路的聯(lián)系Caspase-3活化48二、細(xì)胞壞死（necrosis）P543

細(xì)胞受到意外損傷，如極端的物理、化學(xué)因素或與嚴(yán)重的病理性刺激而發(fā)生的細(xì)胞被動死亡形式。細(xì)胞壞死時，細(xì)胞

內(nèi)含物釋放到胞外，引起周圍區(qū)域的炎癥反應(yīng)。

49

炎癥反應(yīng)50細(xì)胞壞死細(xì)胞凋亡性質(zhì)病理性的群體細(xì)胞死亡生理性或病理性的單個細(xì)胞死亡誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈刺激，隨機(jī)發(fā)生較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生生化特點(diǎn)被動過程，無新蛋白合成，不耗能主動過程，有新蛋白合成耗能形態(tài)變化細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細(xì)胞腫脹，失去質(zhì)膜完整性胞膜及細(xì)胞器相對完整，細(xì)胞皺縮，核固縮DNA電泳彌散性降解，電泳呈均一DNA片狀（“拖尾”）DNA片段化（180-200bp）電泳呈梯狀條帶炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整局部無炎癥反應(yīng)凋亡小體無有基因調(diào)控?zé)o有細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的特征比較51第二節(jié)細(xì)胞衰老

cellaging

或cellsenescence

一般含義是復(fù)制衰老，是指正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂增殖后，停止分裂，細(xì)胞形態(tài)和生理代謝發(fā)生顯著改變的過程。52涉及內(nèi)容●

Hayflick

界限（HayflickLimitation）●細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老（自學(xué)）●衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化（自學(xué)）●細(xì)胞衰老的分子機(jī)制（自學(xué)）531、概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick

界限（即細(xì)胞最大分裂次數(shù)）。癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞。細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系二倍體細(xì)胞的衰老是由細(xì)胞本身決定的 ◆決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，不是外部的環(huán)境 ◆是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老一、Hayflick界限（HayflickLimitation）54成人早衰癥（Werner'ssyndrome）：病人平均39

歲時出現(xiàn)衰老，47

歲左右生命結(jié)束。55患嬰幼兒早衰癥（Hutchinson-Gilfordsyndrome）：小孩在1

歲時出現(xiàn)明顯的衰老，12-18

歲即過早夭折，其細(xì)胞培養(yǎng)只傳代2-10次。56二、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生?！裾Ｇ闆r下終生保持分裂的細(xì)胞，其分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降？它們會不會衰老？◆衰老動物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是

G1

期明顯延長?！羲ダ蟼€體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老?！艄撬韪杉?xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢。57一名男子從36歲到75歲味覺喪失64％腎小球減少44％腎小球過濾率減少31％脊神經(jīng)元減少37％神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢10％腦供血量減少20％肺活量減少44％58三、細(xì)胞衰老的形態(tài)變化59衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化細(xì)胞核的變化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化線粒體的變化致密體的生成膜體系的變化60一）細(xì)胞核的變化在衰老變化中細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的最明顯變化是核膜內(nèi)折。電鏡檢測可見衰老細(xì)胞核形狀不規(guī)則、內(nèi)陷和斷裂。染色質(zhì)固縮化是衰老細(xì)胞核中另一個重要變化。在衰老細(xì)胞中，細(xì)胞核固縮，還常常出現(xiàn)核內(nèi)容物，核質(zhì)染色加深，核的細(xì)致結(jié)構(gòu)逐漸消失，核仁也發(fā)生明顯的變化。61二）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化在衰老細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列變得無序，膜腔膨脹擴(kuò)大甚至崩解，膜面上核糖體數(shù)量減少。三）線粒體的變化細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨著年齡的增大而減少，而其體積則隨著年齡的增長而增大。同時，線粒體的結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，腫脹空泡化，內(nèi)部嵴大大減少。線粒體崩解是細(xì)胞衰老變化的重要標(biāo)志。62四）致密體的生成

溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化五）膜系統(tǒng)的變化1.膜脂相發(fā)生改變，不飽和脂肪酸含量增加，膜流動性下降。2.細(xì)胞的間隙連接明顯減少，組成間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小，使細(xì)胞間代謝協(xié)作減少。3.膜的微粘度增加，從而影響膜表面受體的移動和特異性生物化學(xué)信號的傳導(dǎo)。63四、細(xì)胞衰老的分子機(jī)制一）氧化損傷學(xué)說:

該理論認(rèn)為，代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子

（ROS，reactiveoxygenspecies）引發(fā)的氧化性損傷的積累，最終導(dǎo)致衰老。ROS主要有三種類型：

◆O2-，即超氧陰離子；◆

OH-，即羥自由基；◆

H2O2。它們的高度活性引發(fā)脂類、蛋白質(zhì)和核酸分子的氧化性損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷乃至破壞。清除ROS，就可以延長壽命。64二）染色體端粒和衰老端粒是由簡單的富含T

和G

的DNA

片段的重復(fù)序列組成。人類端粒結(jié)構(gòu)為染色體末端重復(fù)上千次的TTAGGG

序列所組成。DNA

聚合酶不能完成線性染色體末端DNA

的復(fù)制。由于RNA引物的原因，DNA聚合酶一定會留下染色體末端的一段DNA（一段端粒）使其不被復(fù)制。那么真核細(xì)胞、染色體末端的端粒就會隨著細(xì)胞分裂而縮短。這個縮短的端粒傳給子細(xì)胞后，隨著細(xì)胞的再次分裂進(jìn)一步縮短。染色體末端端粒隨著每次細(xì)胞分裂逐漸縮短，直到不能分裂走向衰老。人類種系細(xì)胞一生中維持分裂、不斷增殖的原因是該細(xì)胞表達(dá)端粒酶。65

端粒酶以自身一段RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄酶，轉(zhuǎn)錄出一段端粒片段并使之連接于染色體的端粒末端，使端粒不縮短，維持完整，從而保持了細(xì)胞的永生化生長。在單細(xì)胞生物、多細(xì)胞生物的種系細(xì)胞中都顯示出弱的端粒酶活性。而在人類正常組織的體細(xì)胞均無端粒酶活性。值得注意的是，在絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中顯示明顯的端粒酶活性，這可能是腫瘤細(xì)胞具有永生性生長的原因之一。66一