高中生物同步備課系列【備課件】3.2.2 基因工程的基本操作程序-人教2019版選擇性必修3

第三章基因工程第2節(jié)基因工程的基本操作程序學習目標掌握目的基因的篩選與獲取方法，簡述PCR的原理、條件及過程（生命觀念、科學思維）0102學會基因表達載體構建的方法和要求，簡述基因表達載體的組成及構建過程（科學探究）理解目的基因導入受體細胞的具體過程，闡明將目的基因導入受體細胞的方法（科學探究）掌握并闡明目的基因檢測與鑒定的方法（科學探究、社會責任）掌握DNA片段的擴增及電泳鑒定的方法（科學探究）030405情境導入目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞第一步第二步第三步第四步目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序構建好的Bt基因表達載體通過什么方式導入棉花細胞？

在獲得轉基因產品的過程中，受體細胞有植物、動物、微生物之分，受體

細胞不同，將目的基因導入受體細胞的方法也不完全相同。將目的基因導入受體細胞的方法有哪些，分別適用于什么生物？新課講授1一、將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞的方法導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。農桿菌轉化法（常用）花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法（我國科學家獨創(chuàng)）轉化：目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程，稱為轉化。轉化的實質是將目的基因整合到受體細胞基因組中?；驑尫ㄐ抡n講授1一、將目的基因導入受體細胞將目的基因導入植物細胞這是我國科學家獨創(chuàng)的一種方法，是一種十分簡便、經(jīng)濟的方法，我國的轉基因抗蟲棉就是用此種方法獲得的。操作方法：①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；②在植物受粉后的一定時間內，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。1.花粉管通道法2.基因槍法單子葉植物中常用的一種基因轉化方法，但是成本較高。將目的基因吸附在微小的金?；蜴u粒表面，然后將微粒用基因槍高速射入受體細胞或組織。3.農桿菌轉化法（1）農桿菌的特點：農桿菌能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力；農桿菌細胞內含有的Ti質粒上的T-DNA可轉移至受體細胞，并且將其整合到該受體細胞染色體DNA上。農桿菌細胞內含有

，當它侵染植物細胞時，Ti質粒的_______可轉移至被侵染的細胞，并且將其整合到該細胞的

。（2）轉化原理：T-DNATi質粒大型環(huán)狀DNA農桿菌T-DNA染色體DNA上Ti質粒（3）轉化過程：構建表達載體含目的基因的重組Ti質粒表現(xiàn)出新性狀的植株導入植物細胞植物細胞將目的基因插入染色體DNA中目的基因Ti質粒T-DNA含重組Ti質粒的農桿菌轉入農桿菌農桿菌轉化法示意圖（3）轉化過程：構建表達載體導入植物細胞目的基因插入植物細胞染色體DNA上表達新性狀轉入農桿菌植物組織培養(yǎng)Ti質粒目的基因第一次導入第二次導入第一次拼接第二次拼接植物組織培養(yǎng)第一次導入第二次導入第一次拼接第二次拼接將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA導入受體細胞。將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌。（3）轉化過程：（4）轉化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片__________________，然后________________，并_____________；受體細胞為_______與農桿菌共培養(yǎng)篩選轉化細胞再生成植株體細胞b.可以將_______直接浸沒在___________________中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得____，再進行_____、_____等；受體細胞為_______花序含有農桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵將目的基因導入動物細胞（1）常用方法：顯微注射技術（2）常用受體細胞：受精卵（3）基本操作程序：目的基因的表達載體提純取卵（受精卵）顯微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動物①個體大，易操作。②受精卵全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。將目的基因導入微生物細胞（1）原核生物的特點：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少等。早期的基因工程操作都用原核生物作為受體細胞，其中以大腸桿菌應用最為廣泛。（2）操作過程：對受體細胞的常用處理方法是氯化鈣法。首先用Ca2+處理大腸桿菌細胞→感受態(tài)細胞→將重組表達載體DNA分子與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子。Ca2+處理大腸桿菌細胞，可使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。注意說明①將基因表達載體（重組質粒）導入農桿菌的常用方法是Ca2+處理法。Ca2+（或CaCl2

溶液）對微生物細胞的作用是增加細胞壁的通透性。②目的基因能否在植物細胞內穩(wěn)定保存并表達的關鍵是目的基因是否插入到受體細胞染色體DNA上（原理是基因重組）。③不同種類的受體細胞：對于植物來說，受體細胞可以是受精卵和體細胞；對于動物來說，受體細胞一般是受精卵，受精卵具有體積大、易操作、經(jīng)培養(yǎng)可直接表達性狀的優(yōu)點。種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法；花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→感受態(tài)細胞吸收DNA分子【小結】新課講授2二、目的基因的檢測與鑒定問題：基因表達載體中已經(jīng)具備標記基因（如抗生素抗性基因），對受體細胞進行了篩選，為什么基因工程的第四步還要對目的基因進行檢測和鑒定？在含抗生素的選擇培養(yǎng)基上能生長的是導入了載體的細胞，這里的載體可能是基因表達載體，也可能是未插入目的基因的空載體。因此第四步需要對目的基因是否導入進行進一步的檢測。此外，即便在選擇培養(yǎng)基上能生長的細胞中導入的是基因表達載體，但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正確，能否正確表達，因此也需要在轉錄和翻譯以及個體水平上進行檢測和鑒定。新課講授2二、目的基因的檢測與鑒定目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道1.分子水平的檢測（1）檢測目的基因是否導入如：檢測棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測Bt基因——通過PCR等技術檢測轉基因生物提取DNAPCR操作是否擴增出目的基因M：marker；1-陽性質粒；2：原始品系；3-9轉Bt品系；

PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果電泳操作1.分子水平的檢測（2）檢測目的基因是否轉錄如：檢測Bt基因是否翻譯出mRNA——通過PCR等技術檢測提取棉花細胞mRNA逆轉錄產生DNA對擴增產物進行檢測用與Bt基因相關的引物進行PCR擴增BtM3C0T-9T-2T-51T-5T-23T-11T-20T-21T-34T-1010個PCR陽性棉花植株中，有四株Bt基因發(fā)生轉錄1.分子水平的檢測（3）檢測目的基因是否翻譯如：檢測Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白——通過抗原-抗體雜交檢測蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白電泳分離抗原抗體雜交2.個體生物學水平的檢測轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）感染（抗病接種實驗）未出現(xiàn)病斑鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正?？剐澡b定、活性鑒定等基因工程的基本操作程序用限制酶切割載體和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA連接酶連接，構建基因表達載體將含有目的基因的表達載體導入受體細胞檢測和鑒定目的基因是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性獲取質粒、噬菌體等載體篩選和獲取目的基因DNA片段的擴增及電泳鑒定探究·實踐實驗原理（1）利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理①利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增。②PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。③PCR儀實質上就是一臺能夠自動調控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。（2）DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。②PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。材料用具（1）儀器PCR儀（自動控溫，實現(xiàn)DNA的擴增）微量離心管（實際上是進行PCR反應的場所）微量移液器（用于向微量離心管轉移PCR配方中的液體）一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）PCR儀微量離心管微量移液器電泳裝置材料用具（2）用具4種脫氧核苷酸的等量混合液2種引物Tap

DNA聚合酶模板DNA擴增緩沖液無菌水電泳緩沖液凝膠載樣緩沖液瓊脂糖和核酸染料等方法步驟（1）DNA片段的擴增用微量移液器按照PCR反應體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量離心管中依次加入各組分參照下表的參數(shù)，設置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應。待所有組分都加入后，蓋嚴離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機里，離心約10s，使反應液集中在離心管的底部（提高反應速率）循環(huán)程序變性復性延伸預變性94℃，5min//30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后1次94℃，1min55℃，30s72℃，1min10倍濃縮的擴增緩沖液5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物I2.5μL20μmol/L的引物II2.5μLH2O28-33μL1~5U/μL的TaqDNA聚合酶1~2U模板DNA5~10μL總體積50μL（2）DNA片段的電泳鑒定配制瓊脂糖溶液制備凝膠加樣電泳觀察記錄根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，（一般配制質量體積比0.8%～1.2%）。在沸水浴或微波爐內加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜將擴增得到的PCR產物與凝膠載樣緩沖液（內含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內。留一個加樣孔加入指示分子大小的標準參照物接通電源，根據(jù)電泳槽陽極至陰極之間的距離來設定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相，并與核酸分子量標準參照物比較被擴增產物的大小注意說明1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。2.該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進行操作時，一定要戴好一次性手套。PCR擴增不能隨意加大試劑用量。結果分析與評價(1)你是否成功擴增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？(2)你進行電泳鑒定的結果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產生這個結果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細程度來評價擴增的結果。進行電泳鑒定的結果應該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應成分，各反應成分的用量不當，PCR程序設置不當?shù)取Ｈ绻麛U增結果不止一條條帶，可能的原因有：引物設計不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質量不好等。1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據(jù)是什么？

科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監(jiān)測，2011年的數(shù)據(jù)顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平；2013年的數(shù)據(jù)表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續(xù)抗性篩選，已經(jīng)培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。

到社會中去2.科研工作者在沒有發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲出現(xiàn)抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。例如，最早種植的抗蟲棉中只轉入了一種Bt基因，抗性比較單一；現(xiàn)在經(jīng)常將兩種或兩種以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同時轉入棉花細胞，這樣既可以提高殺蟲活性，又可以延緩害蟲抗性的產生和發(fā)展，還可以通過不同基因間的互補作用擴大抗蟲范圍。

到社會中去（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物輪作或套種等。例如，在澳大利亞和美國等地普遍采取的措施是在轉基因棉田中，總面積的4%種植不使用任何殺蟲劑的非轉基因棉花，或在轉基因棉田周圍種植20%～30%面積的可使用化學殺蟲劑的非轉基因棉花；在印度，一些地區(qū)要求，在轉基因棉田周圍至少種植5行或者20%面積的非轉基因棉花。我國除新疆棉區(qū)及大型農場需設計專門的庇護所外，其他棉區(qū)如長江、黃河流域棉區(qū)多采用多種作物混作的耕作制度(如將轉基因抗蟲棉與番茄、向日葵、高梁、玉米、辣椒等棉鈴蟲寄主作物混作)，這些作物可以構成天然的庇護所，一般無須種植非轉基因棉花作為庇護所。

到社會中去

這樣做的原理是為少部分害蟲提供一個正常的取食環(huán)境，始終保持一定的敏感目標害蟲種群。這樣，即使目標害蟲對轉基因抗蟲棉產生了抗性，但是因為其與敏感目標害蟲交配，后代抗性基因會發(fā)生分離，所以抗性目標害蟲的種群也不至于迅速增加。（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區(qū)種植管理、加強抗性監(jiān)測、進行嚴格的安全生評價等。網(wǎng)絡構建思維導圖基礎檢測1我國科學家將富含賴氨酸的蛋白質編碼基因導入某植物，富含賴氨酸的蛋白質編碼基因編碼區(qū)共含678個堿基對，科學家利用了XbaⅠ和SacⅠ兩種限制酶，并運用農桿菌轉化法，將富含賴氨酸的蛋白質編碼基因導入植物葉片細胞，再