基因治療(概述)

基因治療CompanyLogo目錄基因治療的發(fā)展史1基因治療的概述2基因治療的策略3問題互動(dòng)5基因治療的方式422021/6/16CompanyLogo基因治療的定義基因治療（genetherapy）是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。也包括轉(zhuǎn)基因等方面的技術(shù)應(yīng)用。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。從廣義說，凡是在基因水平上進(jìn)行操作而達(dá)到治療疾病的所有療法。32021/6/16CompanyLogo基因治療的發(fā)展史時(shí)間發(fā)生事件研究者1944DNA是轉(zhuǎn)化物質(zhì)Avery1953DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型WatsonandCrick1963遺傳密碼的破譯Brenner1979重組體DNA技術(shù)、基因轉(zhuǎn)染MulliganandBerg1980臨床地貧研究Cline1990第一個(gè)臨床試驗(yàn)（ADA)基因BlaséandAnderson1992大量癌癥臨床試驗(yàn)美國(guó)等1993中國(guó)制定第一部基因治療質(zhì)控要點(diǎn)中國(guó)1997至今重組病毒的產(chǎn)業(yè)化及其技術(shù)改進(jìn)美國(guó)42021/6/16CompanyLogo基因治療的發(fā)展史上世紀(jì)九十年代初，一位因ADA(腺苷酸脫氨酶)基因缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重免疫缺損的四歲女孩，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院用ADA基因治療，取得療效?！盎蛑委煛毖芯繜釓拇瞬叭澜?，起而效顰，為保障人類健康展現(xiàn)了美好的前景。52021/6/16CompanyLogo基因治療的發(fā)展史人民網(wǎng)深圳2003年10月22日15：30急電正在這里召開的深圳市政府新聞發(fā)布會(huì)向世界公布了一項(xiàng)振奮人心的消息：“個(gè)基因治療藥物在中國(guó)誕生”。世界首深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司研制開發(fā)的抗癌新藥——“重組人p53腺病毒注射液”（商品名“今又生”），10月16日獲得國(guó)家儀器藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的新藥證書。這標(biāo)志著我國(guó)在基因治療藥物研制和產(chǎn)業(yè)化方面已達(dá)世界領(lǐng)先水平，在國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)中搶占了先機(jī)。世界第一個(gè)基因治療藥物在中國(guó)誕生62021/6/16CompanyLogo基因治療的概述基因治療的基本內(nèi)容：基因診斷：產(chǎn)生基因缺陷的原因除了進(jìn)化障礙因素外，主要包括點(diǎn)突變、缺失、插入、重排等DNA分子畸變事件的發(fā)生。目前已建立多種病變基因的診斷和定位方法：如PCR擴(kuò)增序列法、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析法、人類基因庫(kù)搜尋法等72021/6/16CompanyLogo基因治療的發(fā)展史基因分離：利用DNA重組技術(shù)克隆、鑒定、擴(kuò)增、純化用于治療的正常基因，并根據(jù)病變基因的定位，與特異性整合序列和基因表達(dá)調(diào)控原件進(jìn)行體外重組操作。載體構(gòu)建：主要有病毒和非病毒兩大類，病毒載體一般都需要重新構(gòu)建。基因轉(zhuǎn)移：關(guān)系到基因治療成敗的關(guān)鍵單元操作82021/6/16CompanyLogo基因治療的概述根據(jù)靶細(xì)胞不同，基因治療分為：

將正常基因轉(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基因產(chǎn)物，以達(dá)到治療目的。

將正常基因轉(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞（精細(xì)胞、卵細(xì)胞中早期胚胎）使其發(fā)育成正常個(gè)體，顯然，這是理想的方法。實(shí)際上，這種靶細(xì)胞的遺傳修飾至今尚無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。體細(xì)胞基因治療：生殖細(xì)胞基因治療：92021/6/16CompanyLogo基因治療的概述生殖細(xì)胞的基因治療不僅可使遺傳疾病在當(dāng)代得到治療，而且還能將新基因傳給患者后代，使遺傳病得到根治。但生殖細(xì)胞的基因治療涉及問題較多，技術(shù)也較復(fù)雜。因此，如今更多地是采用體細(xì)胞基因治療。體細(xì)胞應(yīng)該是在體內(nèi)能保持相當(dāng)長(zhǎng)的壽命或者具有分裂能力的細(xì)胞，這樣才能使被轉(zhuǎn)入的基因能有效地、長(zhǎng)期地發(fā)揮“治療”作用。因此干細(xì)胞、前體細(xì)胞都是理想的轉(zhuǎn)基因治療靶細(xì)胞。102021/6/16CompanyLogo基因治療的策略體細(xì)胞基因治療的策略：基因修正基因置換基因激活基因增補(bǔ)基因干擾免疫調(diào)節(jié)藥物敏感療法112021/6/16基因治療的策略（一）基因修正通過特定的方法如同源重組或靶向突變等對(duì)突變的DNA進(jìn)行原位修復(fù),將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。但目前在技術(shù)上還無法做到。因?yàn)橐谌嘶蚪M的某個(gè)特異部位上進(jìn)行重組是一個(gè)非常復(fù)雜的過程。然而原位修復(fù)的方法無疑是進(jìn)行基因治療最理想的途徑和目的。122021/6/16基因治療的策略（二）基因置換

基因置換指去除整個(gè)變異基因，用有功能的正?；蛉〈?，使致病基因得到永久地更正。傳統(tǒng)上所謂基因治療實(shí)際上就是指基因替代療法，就像外科移植手術(shù)一樣。132021/6/16基因治療的策略（三）基因激活

有些正常基因不能表達(dá)并發(fā)生了基因突變，而是由于被錯(cuò)誤地甲基化或編碼區(qū)組蛋白去乙酰化所致；也有的是編碼區(qū)是正常的但調(diào)控區(qū)發(fā)生了突變。前者可以通過去甲基化或乙酰化使基因恢復(fù)活性；后者可以加入正常啟動(dòng)子來激活基因。但是實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)去甲基化和乙?；卜且资?；原位修復(fù)調(diào)控序列也是很難的。142021/6/16基因治療的策略（四）基因增補(bǔ)

又稱基因修飾，是指將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其他細(xì)胞，目的基因的表達(dá)產(chǎn)物能修飾缺陷細(xì)胞的功能會(huì)使原有的某些功能得以加強(qiáng)。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細(xì)胞內(nèi)，目前基因治療多采用這種方式。152021/6/16基因治療的策略（五）基因干擾

又稱基因失活，有兩種干擾方法：1、抑制有害的基因表達(dá)：導(dǎo)入腫瘤抑制基因，（如rb或p53),以抑制癌基因的異常表達(dá)。

2、封閉有害基因：用反義RNA或小分子干擾RNA來瘋幣癌基因，同樣不能恢復(fù)癌基因的正常功能，但可用來抑制病原體的關(guān)鍵基因。162021/6/16基因治療的策略（六）免疫調(diào)節(jié)

將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，改變患者的免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。如將白細(xì)胞介素-2導(dǎo)入腫瘤患者體內(nèi)，提高患者IL-2的水平，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，達(dá)到防治腫瘤復(fù)發(fā)的目的。172021/6/16基因治療的策略（七）藥物敏感療法

應(yīng)用藥物敏感基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。如向腫瘤細(xì)胞導(dǎo)入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給予患者無毒性的環(huán)氧鳥苷藥物。腫瘤細(xì)胞被殺死，而對(duì)正常細(xì)胞無影響。182021/6/16基因治療的策略一些常見疾病的基因治療策略：192021/6/16基因治療的方式1.直接體內(nèi)療法（invivo）是指將目的基因直接導(dǎo)入體內(nèi)有關(guān)的組織器官，使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并進(jìn)行表達(dá)。2.間接體內(nèi)療法（exvivo）是指在體外將目的基因?qū)氚屑?xì)胞，經(jīng)過篩選和增殖后將細(xì)胞回輸給患者，使該基因在體內(nèi)有效地表達(dá)相應(yīng)產(chǎn)物，以達(dá)到治療的目的。202021/6/16基因治療的方式直接體內(nèi)療法（invivo）、利用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)，要求靶細(xì)胞處于分裂期，但許多需進(jìn)行基因治療的組織多處于靜止期、目前用溫和病毒載體直接注入相應(yīng)的組織212021/6/16基因治療的方式間接體內(nèi)療法（exvivo）、從患者體內(nèi)取出帶有缺陷基因的細(xì)胞，并培養(yǎng)；、將帶有目的基因的載體通過轉(zhuǎn)染或感染轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)的靶細(xì)胞中，進(jìn)行遺傳修正、對(duì)遺傳修正的細(xì)胞進(jìn)行選擇和培養(yǎng)；、處理過的細(xì)胞用融合或移植的方法轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)222021/6/16CompanyLogo基因治療的方式exvivo載體將目的基因直接輸入體內(nèi)目的基因invivo將目的基因?qū)牖颊甙屑?xì)胞,體外培養(yǎng)將重組靶細(xì)胞回輸體內(nèi)靶細(xì)胞232021/6/16基因治療的方式基因治療的關(guān)鍵步驟：1、目的基因的選擇2、靶細(xì)胞的選擇3、選擇安全而有效的方法和載體系統(tǒng)，使外源基因順利地導(dǎo)入靶細(xì)胞，并有效表達(dá)從而達(dá)到治療目的。242021/6/16基因治療的方式目的基因的選擇是根據(jù)不同的疾病、不同的治療方式而定的252021/6/16基因治療的方式靶細(xì)胞的選擇需考慮：1、最好為組織特異性細(xì)胞2、細(xì)胞易獲得，具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)3、離體細(xì)胞較易受外源基因轉(zhuǎn)化4、細(xì)胞堅(jiān)固，能耐受處理，回植到體內(nèi)易成活262021/6/16基因治療的方式常用的靶細(xì)胞有：造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等。272021/6/16CompanyLogo基因治療的方式目的基因的轉(zhuǎn)移方式：1.直接注射法2.磷酸鈣沉淀法3.顯微注射法4.脂質(zhì)體介導(dǎo)法5.受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移6.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移282021/6/16直接注射法將目的基因直接注射到體內(nèi)的某些部位(如肌肉)，鄰近細(xì)胞攝人DNA并表達(dá)。這種方法非常簡(jiǎn)單，但效率低。292021/6/16CompanyLogo磷酸鈣沉淀法將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，即有磷酸鈣微沉淀形成，體外培養(yǎng)的細(xì)胞可將沉淀吞入細(xì)胞內(nèi)，從而將目的基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。這種方法優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單和通用性，但轉(zhuǎn)化效率通常很低。302021/6/16CompanyLogo顯微注射法在顯微鏡下，直接將DNA由細(xì)胞玻璃針注人細(xì)胞核內(nèi)，可避免DNA的降解，但要求有熟練的操作技巧。312021/6/16脂質(zhì)體介導(dǎo)法將目的基因包裹到脂質(zhì)體內(nèi)，通過靜脈注人體內(nèi)，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合而使目的基因進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移能在活體內(nèi)應(yīng)用，較為簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)移效率較低，轉(zhuǎn)移的目的基因不與染色體整合，只能短時(shí)間表達(dá)。322021/6/16

受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移將含有目的基因的重組質(zhì)粒DNA共價(jià)連接到能與某種細(xì)胞受體結(jié)合的配體上，再將這種復(fù)合物注人體內(nèi)，配體與細(xì)胞受體特異性結(jié)合，發(fā)生正常的人胞作用，目的基因從而進(jìn)人細(xì)胞內(nèi)。這種方式轉(zhuǎn)人的目的基因也不與染色體整合，只能短時(shí)間表達(dá)。332021/6/16逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移帶有外源性基因的重組病毒在感染細(xì)胞時(shí).可將外源性基因序列導(dǎo)人細(xì)胞內(nèi)。目前主要使用的病毒載體有逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒可將遺傳物質(zhì)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，因而很合適作基因治療載體。將野生的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行重組，除去編碼病毒自身蛋白的序列，插人目的基因。342021/6/16基因治療的問題安全性問題

1999年首例基因治療失敗事件只限于體細(xì)胞，提倡間接體內(nèi)法、主要用于單基因遺傳病治療、療效顯著并經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等。社會(huì)倫理問題禁止用于生殖細(xì)胞防止不當(dāng)應(yīng)用（如體育上）352021/6/16目前，基因治療領(lǐng)域存在的主要問題是有效性和安全性。事實(shí)上，自1995年以來，全世界基因治療領(lǐng)域的科學(xué)家們?cè)诟纳苹驅(qū)胂到y(tǒng)和載體方面作了大量的努力，新思路、新技術(shù)和新方法層出不窮。目前，在基因?qū)胼d體方面出現(xiàn)了兩大主流：一