食品微生物檢驗常用的試劑及其配制

常用染色液的配制目錄/Contents1常用染色液的配制染色液01常用染色液的配制1.呂氏堿性美藍染色液美藍0.3g95％乙醇30mL0.01％氫氧化鉀溶液100mL將美藍溶解于乙醇中，然后于氫氧化鉀溶液混合。染色時，先將涂片在火焰上固定，待冷卻后滴加染液，染1min~3min，水洗，待干，鏡檢。01常用染色液的配制2.奧爾特氏莢膜染色液（1）成分沙黃3g蒸餾水100mL用乳缽研磨溶解。01常用染色液的配制（2）染色法將涂片在火焰上固定，滴加染色液，并加熱至產(chǎn)生蒸汽后，繼續(xù)染3min，水洗，待干，鏡檢。（3）結(jié)果炭疽芽孢桿菌菌體呈赤褐色，莢膜呈黃色。01常用染色液的配制3.瑞氏染色液（2015年新法）（1）成分瑞氏色素0.1g甲醇60mL用乳缽研磨溶解01常用染色液的配制3.瑞氏染色液（2015年新法）（2）染色法①待涂片自然干燥后，滴加染色液，固定1min。②加入等量磷酸鹽緩沖液，輕輕晃動玻片或采用其他方式混合，使磷酸鹽緩沖液與瑞氏染液混勻靜置；③再用蒸餾水從一端輕輕沖洗，待干燥后，鏡檢。01常用染色液的配制4.革蘭氏染色法（1）染色液①結(jié)晶紫染色液結(jié)晶紫1g95％乙醇20mL1％草酸銨水溶液80mL將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。01常用染色液的配制②革蘭氏碘液碘1g碘化鉀2g蒸餾水300mL將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，在加蒸餾水至300mL。01常用染色液的配制③沙黃復(fù)染法染色液沙黃0.25g95％乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。01常用染色液的配制（2）染色法①將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗；②滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；③滴加95％乙醇脫色，約30s；或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s；④水洗，滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。（3）結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。01常用染色液的配制5.耐酸性染色法（1）染色液①石炭酸品紅染色液堿性品紅0.3g95％乙醇10mL5％苯酚水溶液90mL將品紅溶解于乙醇中，然后與苯酚溶液混合。01常用染色液的配制②3％鹽酸-乙醇濃煙酸3mL95％乙醇97mL③復(fù)染液呂氏堿性美藍染色液01常用染色液的配制（2）染色法①將涂片在火焰上固定，滴加石炭酸品紅染色液，徐徐加熱至有蒸汽出現(xiàn)，但切不可使沸騰。染液因蒸發(fā)減少時，應(yīng)隨時添加。染5min，傾去染液，水洗；②滴加鹽酸-乙醇脫色，直至無紅色脫落為止，（所需時間視涂片厚薄而定，一般為1min~3min），水洗；③加呂氏堿性美藍染色液，復(fù)染30min，水洗，待干，鏡檢。（3）結(jié)果耐酸性細菌呈紅色，其他細菌、細胞等物質(zhì)呈藍色。01常用染色液的配制6.柯氏染色法（1）染色液成分0.5％沙黃液0.5％孔雀綠液（2）染色法①將涂片在火焰上固定，滴加0.5％沙黃液，并加熱至出現(xiàn)氣泡，約2min~3min，水洗；②滴加0.5％孔雀綠液，復(fù)染40s~50s，水洗，待干，鏡檢。（3）結(jié)果布氏桿菌呈紅色，其他細菌及細胞呈綠色。01常用染色液的配制7.鞭毛染色法（1）染色液的配制①甲液稱丹寧酸5g、氯化高鐵（FeCl3）1.5g，溶于100mL蒸餾水中，待溶解后加入1％的氫氧化納溶液1mL和15％的甲醛溶液2mL。01常用染色液的配制7.鞭毛染色法②乙液稱2g硝酸銀溶于100mL蒸餾水中。在90mL乙液中滴加濃氫氧化銨溶液，到出現(xiàn)沉淀后，繼續(xù)滴加使其變?yōu)槌吻?，然后用其?0mL乙液小心滴加至澄清液中，至出現(xiàn)輕微霧狀為止（此為關(guān)鍵性操作，應(yīng)特別小心）。滴加氫氧化銨和用剩余乙液回滴時，要邊滴邊充分搖蕩，染液當(dāng)天配，當(dāng)天使用，2d~3d后基本無效。01常用染色液的配制（2）染色法在風(fēng)干的載玻片上滴加甲液，4min~6min后，用蒸餾水輕輕沖凈，再加乙液，緩緩加熱至冒汽，維持約半分鐘（加熱時注意勿出現(xiàn)干燥面），在菌體多的部位可呈深褐色到黑色，停止加熱，用水沖凈，干后鏡檢。菌體及鞭毛為深褐色到黑色。01常用染色液的配制8．考馬斯亮藍R-250染色液考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度,是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理,定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。01常用染色液的配制8．考馬斯亮藍R-250染色液考馬斯亮藍R-250染色液的配置方法（1L的量）：（1）稱取1g考馬斯亮藍R-250，置于1L燒杯中。（2）量取250mL的異丙醇加入上述燒杯中，攪拌溶解。（3）加入100mL的冰乙醋酸，均勻攪拌。（4）加入650mL的去離子水，均勻攪拌。（5）用濾紙出去顆粒物質(zhì)后，室溫保存。染色與細菌的形態(tài)觀察技術(shù)目錄/Contents1染色的基本程序染色第一節(jié)染色與細菌的形態(tài)觀察技術(shù)媒染染色固定干燥涂片脫色復(fù)染染色的基本程序01染色的基本程序1.載玻片處理（1）滴上95％酒精2～3滴，用清潔紗布擦拭，然后以鐘擺速度通過酒精燈焰3～4次。（2）若上法仍未能除去油漬，可再滴上1～2滴冰醋酸，用紗布擦凈，再在酒精燈火焰上輕輕拖過。玻片潔凈后，用玻璃鉛筆在預(yù)涂材料處的背面劃一個直徑1.5cm的圓圈，用以標(biāo)記。01染色的基本程序2．涂片方法（1）菌落涂片方法涂片時，左手握菌種管，右手持接種環(huán)（又稱鉑金耳）取1～2環(huán)生理鹽水，置于載玻片上，然后將接種環(huán)在火焰上滅菌，待冷后，從菌種管內(nèi)釣取少許菌落，置于生理鹽水中混勻，涂成直徑1.5cm的涂膜，此膜既薄又均勻為好，待干即成。（2）菌液涂片法用滅菌接種環(huán)沾取菌液（液體培養(yǎng)物、血清、乳汁、組織滲出液等）1～2接種環(huán)，均勻涂抹在載玻片上,使成直徑為1.5cm左右圓形或橢圓形涂膜，自然干燥后備用。01染色的基本程序2．涂片方法（3）血液涂片方法先取一張干凈無油垢邊緣整齊的載玻片，其一端沾取少許血液，以45度角放在另一張干凈無油垢的載玻片一端，從這端向另一端推成薄而均勻的血膜，待干后備用。（4）組織涂片方法先用鑷子夾持組織局部，然后以滅菌剪刀剪取一小塊，夾出后以其新鮮切面在載玻片上壓印或涂成一薄層。01染色的基本程序3.干燥涂片最好在室溫中自然干燥。必要時，可將標(biāo)本面向上，在離酒精燈火焰遠處烘干，切勿緊靠火焰，以免標(biāo)本糊焦而不能檢查。01染色的基本程序4．固定有兩種固定方法：（1）火焰固定將已干燥好的抹片，使涂面向上，以鐘擺速度通過酒精燈火焰四次，使固定后的標(biāo)本觸及皮膚時，稍感燒燙為度。放置冷卻后，進行染色。（2）化學(xué)固定血液、組織臟器等抹片作姬姆薩氏染色或單染色時，不用火焰固定而用甲醇固定，可將已干燥的抹片浸入甲醇中2～3min，取出晾干；或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作用2～3min后，自然揮發(fā)干燥，抹片作瑞特氏染色時則不必作特別固定，染色液中含有甲醇可以達到固定目的。01染色的基本程序5．染色根據(jù)檢驗?zāi)康牟煌x擇不同的染色方法進行染色。染色時滴加染液，以覆蓋標(biāo)本為度。01染色的基本程序6．媒染凡能增強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質(zhì)，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。媒染劑可用于初染與復(fù)染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。01染色的基本程序7．脫色

凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學(xué)試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結(jié)合的穩(wěn)定程度，作為鑒別染色之用。01染色的基本程序8．復(fù)染

已脫色處理的細菌或其結(jié)構(gòu)常以復(fù)染液作復(fù)染以便于觀察。復(fù)染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復(fù)染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。染料及染液配制技術(shù)目錄/Contents1染色原理細菌染色染料的種類2染色的方法3染色的基本步驟401染色原理

微生物的染色是借助物理和化學(xué)因素的作用而進行的。物理因素如細胞及細胞物質(zhì)對染料的毛細現(xiàn)象、滲透、吸附作用等?；瘜W(xué)因素則是正負離子之間的相互吸引而發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。01染色原理

細菌的等電點較低，pH值大約在2~5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子帶陽離子。因此，帶陰電的細菌常和帶陽離子的堿性染料進行結(jié)合。故而在細菌學(xué)上通常采用堿性染料進行染色。

02染料的種類1.酸性染料如酸性復(fù)紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸等。這類染料電離后染料離子帶負電，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類分解產(chǎn)酸使pH值下降時，細菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染色。02染料的種類2.堿性染料

一般有堿性復(fù)紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結(jié)晶紫、美蘭、甲基紫等，這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽，通常情況下，細菌容易被堿性染料染色。

02染料的種類3．中性（復(fù)合）染料

如伊紅美蘭等，瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細胞核染色。

02染料的種類4．單純?nèi)玖线@類染料的化學(xué)親和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如蘇丹類（Sudanb)的染料。03染色的方法（1）單染色法單染色法是用一種染料染色的方法。比如用美藍使各種細菌染成同—種顏色，此法只顯示細菌的形態(tài)和大小，對細菌的鑒別價值較小。在染色過程中常加入媒染劑如碘、石碳酸或明礬等，來增加染料對細菌的親和力，當(dāng)然也可以使用加熱的方法。03染色的方法（1）單染色法單染色法是用一種染料染色的方法。比如用美藍使各種細菌染成同—種顏色，此法只顯示細菌的形態(tài)和大小，對細菌的鑒別價值較小。在染色過程中常加入媒染劑如碘、石碳酸或明礬等，來增加染料對細菌的親和力，當(dāng)然也可以使用加熱的方法。03染色的方法（2）復(fù)染色法復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料染色的方法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸染色法。復(fù)染色法能顯示細菌的形態(tài)和大小，不同類型的細菌可以染上不同的顏色，從而具有鑒別細菌種類的價值，因此又稱之為鑒別染色法。03染色的方法（3）細菌特殊結(jié)構(gòu)的染色法檢查細菌的特殊結(jié)構(gòu)，如鞭毛、異染顆粒等對鑒別細菌很有幫助。細菌特殊結(jié)構(gòu)染色法不僅能使特殊的結(jié)構(gòu)著色，還可使特殊結(jié)構(gòu)染成與菌體不同的顏色，有利于觀察。在細菌檢查工作中，異染顆粒染色法應(yīng)用的較多，其他特殊結(jié)構(gòu)染色法操作比較費時，又能用其他簡易方法來代替，故而在日常檢驗工作中較少使用。03染色的方法（4）熒光染色法熒光染料溶于水中，在紫外線照射下能激發(fā)出熒光，細菌染色后鏡檢，即為熒光染色法。熒光染料分為酸性染料及堿性染料兩種。細菌用熒光染料染色后在熒光顯微鏡下檢查，可在黑的背景中觀察到細菌發(fā)出明亮的熒光。用熒光染色法檢查細菌可起到加快檢查速度和提高陽性率的作用。04染色的基本步驟染色的步驟大致為8步，即①涂片。用灼燒滅菌冷卻后的接種環(huán)挑取少量菌體與水滴充分混勻，涂成極薄的菌膜；②干燥。可自然晾干，或?qū)⑼科糜诨鹧娓咛幬岷娓?，但不能直接在火焰上烘烤；③固定。手?zhí)玻片一端，有菌膜的一面朝上，通過迅速通過火焰2~3次（用手指觸涂片反面，以不燙手為宜）；④染色。加適量(以蓋滿菌膜為度)結(jié)晶紫染色液(或石炭酸復(fù)紅液)，染l~2min；⑤媒染；⑥脫色。用自來水沖洗至流下的水中無染色液的顏色時為止，或者使用脫色液也可，比如考馬斯亮藍脫色液；⑦復(fù)染；⑧鏡檢。而單染色法不需要媒染、脫色和復(fù)染三個步驟。pH指示劑的配制技術(shù)目錄/Contents1pH指示劑的配制技術(shù)分類物質(zhì)的量濃度溶液的配制01pH指示劑的配制分類1．酸堿指示劑指示溶液中H+濃度的變化，是一種有機弱酸或有機弱堿，其酸性和堿性具有不同的顏色。指示劑酸HIn在溶液中的離解常數(shù)Ka=[H+][In-]/[HIn]，即溶液的顏色決定于[In-]/[HIn]，而[In-]/[HIn]又決定于[H+]。01pH指示劑的配制分類2．金屬指示劑絡(luò)合滴定法所用的指示劑，大多是染料，它在一定pH下能與金屬離子絡(luò)合呈現(xiàn)一種與游離指示劑完全不同的顏色而指示終點。比如淀粉指示劑。01pH指示劑的配制分類3．氧化還原指示劑為氧化劑或還原劑，它的氧化形與還原形具有不同的顏色，在滴定中被氧化（或還原）時，即變色，指示出溶液電位的變化。如鉻黑T指示劑、鈣指示劑。02常見指示劑的配制1．甲基紫指示劑稱取甲基紫10mg，加水100mL溶解即得。本指示劑有三個變色范圍：第一變色范圍PH=0.13~0.5，顏色由黃至綠；第二變色范圍pH=1.0~1.5，顏色由綠至藍；第三變色范圍pH=2.0~3.0，顏色由藍至紫色。02常見指示劑的配制2．甲基橙指示劑稱取甲基橙0.1g，溶解于100mL水中。變色范圍pH=3.1-4.4，顏色變化由紅至黃色。3．溴甲酚綠（溴甲酚藍）指示劑此指示劑有兩種配制方法，一種是稱取溴甲酚綠0.1g，溶于100mL20%（體積分數(shù)）乙醇中；另一種是稱取溴甲酚綠0.1g，溶于100mL水中，加入0.05mol/L氫氧化鈉溶液2.9mL。變色范圍是pH=3.8~5.4，顏色由黃至藍色。02常見指示劑的配制4．溴甲酚紫指示劑稱取溴甲酚紫0.04g，0.01mol/LNaOH7.4g，加入蒸餾水92.6mL。溴甲酚紫pH5.2-5.6，顏色由黃變紫，常用濃度為0.04％。5．甲基紅指示劑稱取0.1g或0.2g甲基紅，溶于100mL60%（體積分數(shù)）乙醇中即可。變色范圍為pH=4.4~6.2，顏色由紅至黃色。02常見指示劑的配制6．酚紅指示劑稱取酚紅0.1g，溶于100mL20%（體積分數(shù)）乙醇中；第二種配制方法為：稱取酚紅0.1g溶于100mL水中，加入0.05mol/L氫氧化鈉溶液5.7mL。其變色范圍是pH=6.8-8.0，顏色由黃色至紅色。7．酚酞指示劑稱取酚酞lg，溶于100mL60%（體積分數(shù)）乙醇中。變色范圍pH=8.2-10.0，顏色由無色至紫紅。02常見指示劑的配制8．甲基紅溴甲酚綠混合指示劑量取1g/L溴甲酚氯乙醇溶液50mL，讓它再與1g/L甲基紅乙醇溶液10mL混合，所制得的混合液即是甲基紅溴甲酚綠混合指示劑。變色點PH=5.1，酸性色為酒紅色，堿性色為綠色。9．甲基紅亞甲基藍指示劑將2g/L的甲基紅乙醇溶液與1g/L的亞甲基藍乙醇溶液等體積混合，混合液即是甲基紅亞甲基藍指示劑。其變色點是PH=5.4，酸性色為紅紫色，堿性色為綠色。PH=5.2為紅紫色，PH=5.4為暗紫色，PH=5.6為綠色。02常見指示劑的配制10．5g/L的鉻酸鉀指示劑稱取鉻酸鉀5g，溶于100mL水即可。11．淀粉指示劑稱取1g可溶性淀粉，加入10mL冷水調(diào)成懸浮液，倒入正在沸騰的100mL水中，冷卻備用。12．鈣紅指示劑稱取鈣紅0.1g，加水100mL，或者鈣紅液與乙醇按1:1等體積溶解即得。02常見指示劑的配制13．麝香草酚藍指示劑稱取麝香草酚藍0.1g溶于100mL20%（體積分數(shù)）乙醇中；還有一種配制方法，即稱取麝香草酚藍0.1g溶于100mL水中，加入0.05mol/L氫氧化鈉溶液4.3mL。第一變色范圍pH=1.2~2.8，顏色由紅至黃；第二變色范圍pH=8.0~9.6，顏色由黃至藍色。02常見指示劑的配制14．麝香草酚酞指示液取麝香草酚酞0.1g，加乙醇100mL使溶解，即得。變色范圍pH9.3~10.5g（無色→藍）。麝香草酚藍指示液取麝香草酚藍0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液4.3mL使溶解，再加水稀釋至200mL，即得。變色范圍pH1.2~2.8(紅→黃)；15．中性紅指示劑稱量中性紅0.04g，加入95％乙醇28mL，蒸餾水72mL，混勻即可。中性pH6.8~8顏色由紅變黃，常用濃度為0.04％。02常見指示劑的配制16．孔雀綠指示液取孔雀綠0.3g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。變色范圍pH0.0~2.0，由黃色變?yōu)榫G色；PH11.0-13.5，由綠色變?yōu)闊o色。17．甲酚紅指示液取甲酚紅0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液5.3mL使溶解，再加水稀釋至100mL，即得。變色范圍pH7.2~8.8由黃變紅。02常見指示劑的配制18．剛果紅指示液取剛果紅0.5g,加10％乙醇100mL使溶解，即得。變色范圍pH3.0~5.0由藍變紅。19．蘇丹Ⅳ指示液取蘇丹Ⅳ0.5g,加氯仿100mL使溶解，即得。20．間甲酚紫指示液取間甲酚紫0.1g,加0.01mol/L氫氧化鈉溶液10mL使溶解，再加水稀釋至100mL，即得。變色范圍pH7.5~9.2由黃色變紫色。02常見指示劑的配制21．茜素磺酸鈉指示液取茜素磺酸鈉0.1g，加水100mL使溶解,即得。變色范圍pH3.7~5.2由黃變紫。22．萘酚苯甲醇指示液取α-萘酚苯甲醇0.5g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。變色范圍pH8.5-9.8（黃→綠）23．鉻黑T指示劑取鉻黑T0.1g，加氯化鈉10g，研磨均勻，即得。02常見指示劑的配制24．喹哪啶紅指示液取喹哪啶紅0.1g，加甲醇100mL使溶解，即得。變色范圍pH1.4~3.2由無色變成紅色。25．溴酚藍指示液取溴酚藍0.1g，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0mL使溶解，再加水稀釋至200mL，即得。變色范圍pH2.8~4.6從黃色變?yōu)樗{綠色。02常見指示劑的配制26．鄰二氮菲指示液取硫酸亞鐵0.5g，加水100mL使溶解，加硫酸2滴與鄰二氮菲0.5g,搖勻，即得。本液應(yīng)臨用新制。27．鈣紫紅素指示劑取鈣紫紅素0.1g，加無水硫酸鈉10g，研磨均勻，即得。28．熒光黃指示劑取熒光黃0.1g，加乙醇100mL使溶解，即得該指示劑。02常見指示劑的配制29．結(jié)晶紫指示劑取結(jié)晶紫0.5g，加冰醋酸100mL使溶解，即得。30．硫酸鐵銨指示劑取硫酸鐵銨8g，加水100mL使溶解，即得。31．鈣紫紅素指示劑取鈣紫紅素0.1g，加無水硫酸鈉10g，研磨均勻，即得。緩沖液的配制目錄/Contents1緩沖液的配制緩沖液01緩沖液的配制1．磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)磷酸鈉緩沖液是常用的一種阻礙溶液pH變化的緩沖溶液，其鹽溶液中含有氯化鈉，磷酸鹽，磷酸鹽，氯化鉀和磷酸鉀組成。（1）常規(guī)磷酸鹽緩沖液①成分磷酸二氫鉀34g，1mol/L氫氧化鈉溶液175mL，蒸餾水825mL01緩沖液的配制1．磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS)②配置先將磷酸鹽溶解于500mL蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液校正pH為7.2后，再用蒸餾水稀釋至1000mL。③稀釋液取儲存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1000mL。分裝每瓶100mL或每管10mL，于121℃高壓滅菌15min，備用。01緩沖液的配制（2）改良磷酸鹽緩沖液①成分磷酸氫二鈉34g，山梨醇10.0g，磷酸二氫鈉1.2g，氯化鈉5.0g，蒸餾水1000mL，膽鹽1.5g。②制法將磷酸鈉及氯化鈉溶于蒸餾水中，再加入山梨醇及膽鹽，溶解后，校正PH值為7.6，分裝試管。于121℃高壓滅菌15min，備用。01緩沖液的配制（3）明膠磷酸緩沖液①成分磷酸氫二鈉4.0g，明膠2.0g，蒸餾水1000mL。②制法加熱溶解，校正PH為6.2，于121℃高壓滅菌15min。01緩沖液的配制（4）磷酸-三乙胺緩沖液取磷酸約4mL與三乙胺約7mL，加50％甲醇稀釋至1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2，即得磷酸-三乙胺緩沖液。01緩沖液的配制（5）PH值在2.0~8.0范圍內(nèi)常用磷酸鹽緩沖液的配制方法①磷酸鹽緩沖液(pH2.0)：甲液:取磷酸16.6mL，加水至1000mL，搖勻。乙液：取磷酸氫二鈉71.63g，加水使溶解成1000mL。取上述甲液72.5mL與乙液27.5mL混合，搖勻，即得。②磷酸鹽緩沖液(pH2.5)：取磷酸二氫鉀100g，加水800mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.5，用水稀釋至1000mL。01緩沖液的配制（5）PH值在2.0~8.0范圍內(nèi)常用磷酸鹽緩沖液的配制方法③磷酸鹽緩沖液(pH5.0)：取0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液一定量，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié)pH值至5.0，即得。④磷酸鹽緩沖液(pH5.8)：取磷酸二氫鉀8.34g與磷酸氫二鉀0.87g,加水使溶解成1000mL，即得。01緩沖液的配制（5）PH值在2.0~8.0范圍內(nèi)常用磷酸鹽緩沖液的配制方法⑤磷酸鹽緩沖液(pH6.5)：取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液15.2mL，用水稀釋至100mL，即得。⑥磷酸鹽緩沖液(pH6.8)取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250mL，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118mL，用水稀釋至1000mL，搖勻，即得。⑦磷酸鹽緩沖液(pH7.0)取磷酸二氫鉀0.68g，加0.1mol/L氫氧化鈉溶液29.1mL，用水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制⑧磷酸鹽緩沖液(pH7.8)：甲液：取磷酸氫二鈉35.9g，加水溶解，并稀釋至500mL。乙液：取磷酸二氫鈉2.76g，加水溶解，并稀釋至100mL。取上述甲液91.5mL與乙液8.5mL混合，搖勻，即得。⑨磷酸鹽緩沖液(pH7.8-8.0)：取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使溶解成1000mL，即得。01緩沖液的配制（6）0.2mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液母液A（0.2mol/L的Na2HPO4

溶液）：稱取143.256g的Na2HPO4?12H2O，用去離子水定容至2L。母液B（0.1mol/L的檸檬酸溶液）：稱取檸檬酸42.028g用去離子水溶解定容至2L。01緩沖液的配制（6）0.2mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液母液A（0.2mol/L的Na2HPO4

溶液）：稱取143.256g的Na2HPO4?12H2O，用去離子水定容至2L。母液B（0.1mol/L的檸檬酸溶液）：稱取檸檬酸42.028g用去離子水溶解定容至2L。01緩沖液的配制2.醋酸鹽緩沖液：（1）醋酸-醋酸鈉緩沖液①醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH3.7)取無水醋酸鈉20g，加水300mL溶解后，加溴酚藍指示液1mL及冰醋酸60~80mL，至溶液從藍色轉(zhuǎn)變?yōu)榧兙G色，再加水稀釋至1000mL，即得。01緩沖液的配制2.醋酸鹽緩沖液：（1）醋酸-醋酸鈉緩沖液②醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH4.6)取醋酸鈉5.4g，加水50mL使溶解，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至4.6，再加水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制（6）0.2mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液③pH6.6的緩沖液取727.5mL母液A，與272.5mL的母液B混勻即可。并將其放于4℃冰箱保存。01緩沖液的配制③醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH6.0)取醋酸鈉54.6g，加1mol/L醋酸溶液20mL溶解后，加水稀釋至500mL，即得。（2）醋酸-醋酸鉀緩沖液取醋酸鉀14g，加冰醋酸20.5mL，再加水稀釋至1000mL，即得pH=4.3的緩沖液。01緩沖液的配制（3）醋酸-醋酸銨緩沖液①醋酸-醋酸銨緩沖液（PH3.5）取醋酸銨25g，加水25mL溶解后，加7mol/L鹽酸溶液38mL，用2mol/L鹽酸溶液或5mol/L氨溶液準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH值至3.5(電位法指示)，用水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制（3）醋酸-醋酸銨緩沖液②醋酸-醋酸銨緩沖液(pH4.5)取醋酸銨7.7g，加水50mL溶解后，加冰醋酸6mL與適量的水使成100mL，即得。01緩沖液的配制③醋酸-醋酸銨緩沖液(pH6.0)取醋酸銨100g，加水300mL使溶解，加冰醋酸7mL，搖勻即得。（4）醋酸-鉀鹽緩沖液(pH3.0)取冰醋酸50mL，加水800mL混合后，用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值至3.0，再加水稀釋至1000mL，即得。01緩沖液的配制3．硼酸鹽緩沖液（1）硼酸-氯化鈣緩沖液(pH8.0)取硼酸0.572g與氯化鈣2.94g，加水約800mL溶解后,用1mol/L鹽酸溶液約2.5mL調(diào)節(jié)pH值至8.0，加水稀釋至1000mL，即得。01緩沖液的配制（2）硼酸-碳酸鈉緩沖液(pH=10.8~11.2)取無水碳酸鈉5.30g，加水使溶解成1000mL；另取硼酸1.91g，加水使溶解成100mL。臨用前取碳酸鈉溶液973mL與硼酸溶液27mL，混勻，即得。（3）硼酸-氯化鉀緩沖液(pH9.0)取硼酸3.09g，加0.1mol/L氯化鉀溶液500mL使溶解，再加0.1mol/L氫氧化鈉溶液210mL，即得。01緩沖液的配制4．檸檬酸鹽緩沖液取枸櫞酸4.2g，加1mol/L的20％乙醇制氫氧化鈉溶液40mL使溶解，再用20％乙醇稀釋至100mL，即得。（1）檸檬酸鹽緩沖液(pH6.2)取2.1％枸櫞酸水溶液，用50％氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6.2，即得所需溶液。01緩沖液的配制（2）檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液（PH2.2）

稱取210g檸檬酸（C6H8O7?H2O）84g氫氧化鈉NaOH，加水溶解，再用量筒量取160mL的濃鹽酸，混勻，加水定容至10L即得PH=2.2的緩沖液。使用時可以每升中加入1g酚，若最后pH有變化，再用少量50%氫氧化鈉溶液或濃鹽酸調(diào)節(jié)，冰箱保存。01緩沖液的配制（3）檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液取9.2mL0.1M檸檬酸和10.8mL0.1M檸檬酸鈉溶液混合，即得PH=4.8的緩沖液。（4）檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（PH=5.0）取10.30mL0.2MNa2HPO4液和9.70mL0.1M檸檬酸混合，即得PH=5.0的緩沖液。01緩沖液的配制（5）檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖液(pH4.0)甲液：取枸櫞酸21g或無水枸櫞酸19.2g,加水使溶解成1000mL，置冰箱內(nèi)保存。乙液：取磷酸氫二鈉71.63g，加水使溶解成1000mL。取上述甲液61.45mL與乙液38.55mL混合，搖勻，即得。01緩沖液的配制5．巴比妥緩沖液（1）巴比妥緩沖液(pH7.4)取巴比妥鈉4.42g，加水使溶解并稀釋至400mL，用2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，過濾即得。（2）巴比妥緩沖液(pH8.6)取巴比妥5.52g與巴比妥鈉30.9g，加水使溶解成2000mL，即得。01緩沖液的配制5．巴比妥緩沖液（3）巴比妥-氯化鈉緩沖液(pH7.8)取巴比妥鈉5.05g，加氯化鈉3.7g及水適量使溶解，另取明膠0.5g加水適量，加熱溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.8，再用水稀釋至500mL，即得。01緩沖液的配制6．三羥甲基氨基甲烷緩沖液（1）三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.0)取三羥甲基氨基甲烷12.14g，加水800mL，攪拌溶解，并稀釋至1000mL，用6mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0，即得。（2）三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH8.1)取氯化鈣0.294g，加0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液40mL使溶解，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.1，加水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制（3）三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH9.0)取三羥甲基氨基甲烷6.06g，加鹽酸賴氨酸3.65g，氯化鈉5.8g，乙二胺四醋酸二鈉0.37g，再加水溶解使成1000mL，調(diào)節(jié)pH值至9.0，即得。01緩沖液的配制7．氨－氯化銨緩沖液（1）氨－氯化銨緩沖液(pH8.0)取氯化銨1.07g，加水使溶解成100mL，再加稀氨溶液(1→30)調(diào)節(jié)pH值至8.0，即得。（2）氨－氯化銨緩沖液(pH10.0)取氯化銨5.4g，加水20mL溶解后，加濃氯溶液35mL，再加水稀釋至100mL，即得。01緩沖液的配制8．甲酸鈉緩沖液(pH3.3)取2mol/L甲酸溶液25mL，加酚酞指示液1滴，用2mol/L氫氧化鈉溶液中和，再加入2mol/L甲酸溶液75mL，用水稀釋至200mL，調(diào)節(jié)pH值至3.25~3.30，即得。9．鄰苯二甲酸鹽緩沖液(pH5.6)取鄰苯二甲酸氫鉀10g，加水900mL，攪拌使溶解，用氫氧化鈉試液(必要時用稀鹽酸)調(diào)節(jié)pH值至5.6，加水稀釋至1000mL，混勻，即得。生化試劑制備目錄/Contents1糖（醇）類代謝試驗法生化試劑制備氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗法2呼吸酶類試驗3毒性酶類試驗401糖（醇）類代謝試驗法（1）試驗原理：不同的細菌對各種糖醇的分解能力及所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物各不同，有的能分解多種糖醇，有的只能分解1-2種糖醇，有的分解糖醇只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，有的分解糖醇能產(chǎn)酸產(chǎn)氣，通過這些特點，我們可以鑒別細菌。01糖（醇）類代謝試驗法糖發(fā)酵培養(yǎng)基主要有：液體糖發(fā)酵管、半固體糖發(fā)酵管、固體糖發(fā)酵管、雙糖(或三糖)高層斜面發(fā)酵管四類。01糖（醇）類代謝試驗法糖發(fā)酵試驗法的具體操作方法：采用無菌操作法，首先將已分離培養(yǎng)的純種細菌用接種針或者接種環(huán)移取，然后接種在糖發(fā)酵管中，如果是半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。最后放置于36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)，經(jīng)過一定時間（數(shù)小時以至二周之間）的培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中每天觀察結(jié)果，并與指示劑比對即可。01糖（醇）類代謝試驗法（3）葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基（O/F）的制備稱取蛋白胨2.7克，氯化鈉5.0克，0.2%溴麝香酚蘭0.03克，瓊脂3克，0.3克KH2PO4，葡萄糖10.0克，水1000毫升。加熱溶解，121℃高壓滅菌20min即可。01糖（醇）類代謝試驗法（2）V-P.試驗的試驗方法首先取3支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，將它們一一編號，第1號接種大腸桿菌，第2號接產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌；然后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，之后加入40%KOH5-10滴，再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振蕩；最后放入37℃溫箱中保溫30min，以加快反應(yīng)速度；保溫期間注意觀察培養(yǎng)基的顏色變化：①當(dāng)發(fā)酵管出現(xiàn)紅色者時，稱為陽性，記作V-P+②當(dāng)發(fā)酵管為黃色或銅綠色時，稱為陰性，記作V-P-。01糖（醇）類代謝試驗法（2）V-P.試驗的制備方法制備方法：將3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂生長物接種3%氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基，36℃士1℃培養(yǎng)48h。取1mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)放到一個試管內(nèi)，加0.6mL甲液，搖動。加0.2mL乙液，搖動。隨意加一點肌酸結(jié)晶，4h后觀察結(jié)果。陽性結(jié)果是呈伊紅的粉紅色。01糖（醇）類代謝試驗法

3．甲基紅（MR）試驗（1）試驗原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH=4.5以下，使甲基紅指示劑變紅，即為甲基紅試驗陽性；有的細菌使丙酮酸脫羧后形成酮、醇類中性產(chǎn)物，培養(yǎng)液pH＞5.4，甲基紅指示劑呈桔黃色，示為甲基紅試驗陰性。簡而言之，甲基紅試驗原理就是檢測不同細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸的能力。01糖（醇）類代謝試驗法（2）試驗方法首先挑取少許新鮮的待測試驗培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中；然后放于36±1℃或30℃（以30℃較好）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天；其中注意，從培養(yǎng)的第48h起，每天要取培養(yǎng)液1mL，加入甲基紅指示劑1~2滴，立即觀察結(jié)果。01糖（醇）類代謝試驗法（3）結(jié)果觀察與記錄①呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈淡紅色為弱陽性，記MR+；②呈橘黃色或黃色為陰性，記MR-。從發(fā)現(xiàn)陰性并培養(yǎng)至第5天仍為陰性，即可判定結(jié)果。（4）試驗中所用培養(yǎng)基和試劑的制備①磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基的制備稱取蛋白胨5g，葡糖糖5g，磷酸氫二鉀2g，加入蒸餾水1000mL，充分溶解后調(diào)pH7.0-7.2，過濾。分裝于試管中，每管10mL，121℃滅菌30min。01糖（醇）類代謝試驗法②甲基紅試劑稱取甲基紅（Methylred）0.04g，溶于60mL的95％乙醇中，再加入40mL的蒸餾水即可。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗法（1）原理某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可以用顯色反應(yīng)來表現(xiàn)。吲哚與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，此物質(zhì)為紅色化合物。也就是說，這一試驗反應(yīng)原理包括兩個過程，一個是色氨酸分解反應(yīng)，一個是吲哚反應(yīng)。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗法（2）試驗方法先找取3支胰蛋白水培養(yǎng)基，分別編號，1號接種大腸桿菌，2號接種產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌；然后將三個培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天；培養(yǎng)完成后，沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。若結(jié)果呈現(xiàn)玫瑰紅色，則為陽性反應(yīng)，記吲哚試驗陽性；若結(jié)果無紅色者，則為陰性反應(yīng)，記作吲哚陰性。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗法（2）試驗方法先找取3支胰蛋白水培養(yǎng)基，分別編號，1號接種大腸桿菌，2號接種產(chǎn)氣桿菌，第3支接未知菌；然后將三個培養(yǎng)基放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2天；培養(yǎng)完成后，沿試管壁滴加數(shù)滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。若結(jié)果呈現(xiàn)玫瑰紅色，則為陽性反應(yīng)，記吲哚試驗陽性；若結(jié)果無紅色者，則為陰性反應(yīng)，記作吲哚陰性。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗法（2）試驗方法與結(jié)果①瓊脂穿刺法培養(yǎng)基為三糖鐵培養(yǎng)基、含硫酸亞鐵(或醋酸鉛)的半固體培養(yǎng)基兩種。操作方法：將試驗細菌用接種針沿著管壁穿刺接種到含醋酸鉛或硫酸亞鐵培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h-48h后，觀察結(jié)果。結(jié)果：培養(yǎng)基變成黑色則為陽性。當(dāng)產(chǎn)生硫化氫量少時，為了便于觀察結(jié)果，在穿刺接種培養(yǎng)時，一定要沿培養(yǎng)基管壁進行。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗法（2）試驗方法與結(jié)果②醋酸鉛試紙法培養(yǎng)基為含胱氨酸的半固體培養(yǎng)基，還需要準(zhǔn)備一個浸有醋酸鉛的濾紙條。操作方法：待檢菌穿刺接種培養(yǎng)基，懸掛醋酸鉛紙條，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h-48h。結(jié)果：如果試紙呈現(xiàn)黑色，則為陽性。此方法比較敏感。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗法3.尿素酶（Urease）試驗（2）試驗方法挑取大量培養(yǎng)18h~24h的待試菌，濃密涂布接種于尿素瓊脂斜面上，不要到達底部，留底部作變色對照。在培養(yǎng)2h、4h和24h三個時間點時，分別觀察一次結(jié)果。如果培養(yǎng)基變?yōu)榉奂t色則為陽性，顏色不變者即為陰性。倘若初步判斷為陰性，則應(yīng)該繼續(xù)培養(yǎng)至4天，作最終判定。02氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗法（3）尿素瓊脂培養(yǎng)基的制備①成分蛋白胨1g，瓊脂20g，氯化鈉5g，葡萄糖1g，磷酸二氫鉀2g，0.4%酚紅溶液3mL，20%尿素溶液100mL，蒸餾水1000mL。pH7.2±0.1②培養(yǎng)基的配制在蒸餾水或去離子水100mL中，加入上述所有成分（除尿素和瓊脂外），混合均勻并校正pH，121℃滅菌15min。冷至50～55℃，加入經(jīng)除菌過濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為2%，最終pH應(yīng)為7.2±0.1。03呼吸酶類試驗（三）呼吸酶類試驗1.氧化酶試驗（1）試驗原理氧化酶使細胞色素C氧化，氧化型細胞色素C再使鹽酸二甲基對苯二胺氧化，生成由玫瑰紅色變成暗紫色的醌類化合物，它再和α-萘酚結(jié)合生成吲哚酚藍。03呼吸酶類試驗（三）呼吸酶類試驗（2）試驗方法用滴管直接滴加1%鹽酸二甲基對苯二胺試劑在培養(yǎng)物上，滴加量為1-2滴；再加入1%α-萘酚-乙醇液1-2滴，于30秒內(nèi)判定試驗結(jié)果。如果在30秒內(nèi)呈現(xiàn)藍色反應(yīng)，則為陽性，記作+；如果不變色或為粉紅色者，為陰性，記作-。03呼吸酶類試驗2.過氧化氫酶試驗（1）原理某些細菌能夠分泌過氧化氫酶，當(dāng)加入過氧化氫以后，可將過氧化氫分解生成水和氧氣，產(chǎn)生氣泡，此為陽性反應(yīng)。03呼吸酶類試驗2.過氧化氫酶試驗（2）試驗方法取下固體培養(yǎng)基上的新鮮菌落一環(huán)，放置在一個干凈玻璃片上或者試管上，向其上滴加3%過氧化氫液數(shù)滴，立即觀察結(jié)果。若產(chǎn)生氣泡，就是陽性，記為+，若不產(chǎn)生氣泡，則為陰性，記-。03呼吸酶類試驗3.硝酸鹽還原試驗（1）原理某些細菌具有還原硝酸鹽的能力，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。在酸性條件下，亞硝酸鹽可以生成亞硝酸，亞硝酸與對氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，而重氮苯磺酸又與α-萘胺作用，生成紅色的化合物，呈紅色反應(yīng)，為陽性反應(yīng)。03呼吸酶類試驗（2）試劑A試劑是對氨基苯磺酸試劑：將對氨基苯磺酸0.8g，溶解于2.5mol/L，乙酸溶液100mL中；B試劑是α-萘胺試劑：將甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。03呼吸酶類試驗（3）試驗方法取新鮮的純培養(yǎng)物待檢菌，接種在硝酸鹽培養(yǎng)基上，于36±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~4天，每天取2mL培養(yǎng)液，加入等量的A、B試劑混合物各二滴，混和均勻，立即觀察結(jié)果。若結(jié)果是紅色，則為陽性，記+；若無紅色出現(xiàn)，即為陰性，記-。03呼吸酶類試驗4.氰化鉀試驗（1）原理氰化鉀是細菌呼吸酶系統(tǒng)的抑制劑，它能與呼吸酶作用，讓酶失去活性，從而抑制細菌的生長，但有的細菌在一定濃度的氰化鉀存在時，仍能生長，依此來鑒別細菌。03呼吸酶類試驗4.氰化鉀試驗（2）試驗方法取下1環(huán)已培養(yǎng)20h~24h的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，將其接種到對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基內(nèi)，立即用橡膠塞塞緊，放置于36±1℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h~48h，觀察結(jié)果。當(dāng)對照管中有菌生長，同時試驗管也有菌生長時，為陽性，記作+；當(dāng)對照管中有菌生長，而試驗管中無菌生長為陰性，記作-。04毒性酶類試驗1．溶血試驗（1）原理某些細菌在代謝過程中能產(chǎn)生溶血素，可使人或動物的紅細胞發(fā)生溶解，不同的細菌有不同的溶血反應(yīng)，借此可鑒別細菌。（2）試驗方法方法有平板法和試管法兩種，這里只介紹試管法。先把待檢菌培養(yǎng)液與2%的羊血球等量混合，然后于36±1℃培養(yǎng)16h-18h，觀察其結(jié)果。如果溶血，培養(yǎng)液可出現(xiàn)透明狀，即為陽性，記作+；如果無溶血現(xiàn)象，則為陰性，記作-。04毒性酶類試驗2．血漿凝固酶試驗（1）原理致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白，附著在細菌的表面，形成凝塊；或作用于血漿凝固酶原，使它成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固現(xiàn)象，為陽性。04毒性酶類試驗2．血漿凝固酶試驗（2）試驗方法以試管法為主。即找滅菌小試管3支，向三個試管中各加入1:1體積的血漿－無菌水0.5mL，1支加入被檢菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5mL；其余2支作對照管，其中一支加入金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液0.5mL作陽性對照；另一支加入0.9％氯化鈉溶液0.5mL作空白對照。將3個試管同時放在37℃恒溫箱或水浴中培養(yǎng)，每0.5h觀察一次，4h內(nèi)無凝固現(xiàn)象者，觀察直至24小時。04毒性酶類試驗2．血漿凝固酶試驗（3）試管法的結(jié)果觀察與記錄空白對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固。若試驗管血漿凝固，則為陽性；如果三管均無凝固現(xiàn)象，即為陰性。本試驗法所用到的試劑和培養(yǎng)基在血清學(xué)反應(yīng)里介紹過，此處不再贅述。物質(zhì)的量濃度溶液的配制目錄/Contents1物質(zhì)的量濃度溶液的配制物質(zhì)的量濃度溶液的配制01物質(zhì)的量濃度溶液的配制（1）計算與稱量所稱固體質(zhì)量或量取液體的體積，用托盤天平或電子天平稱量固體或用量筒量取液體。（2）溶解或稀釋在燒杯中溶解，并用玻璃棒攪拌。（3）轉(zhuǎn)移待溶液冷卻到室溫，將燒杯中的溶液沿玻璃棒注入容量瓶中。01物質(zhì)的量濃度溶液的配制（4）洗滌用少量蒸餾水洗滌燒杯內(nèi)壁和玻璃棒2~3次，并把洗滌液全轉(zhuǎn)移到容量瓶中。（5）定容向容量瓶中加入蒸餾水，在距離刻度2~3cm時，改用膠頭滴管滴加蒸餾水至凹液面的最低點與刻度線相平。（6）搖勻并貼簽蓋好瓶塞，把容量瓶倒轉(zhuǎn)和搖動多次，使得溶液混合均勻。貼好標(biāo)簽，并注明溶液的名稱和濃度。01物質(zhì)的量濃度溶液的配制物質(zhì)的量濃度溶液的配制關(guān)鍵程序01物質(zhì)的量濃度溶液的配制操作程序：以配制0.5mol·L－1的NaCl溶液250mL為例01物質(zhì)的量濃度溶液的配制（4）洗滌用少量蒸餾水洗滌燒杯內(nèi)壁和玻璃棒2~3次，并把洗滌液全轉(zhuǎn)移到容量瓶中。（5）定容向容量瓶中加入蒸餾水，在距離刻度2~3cm時，改用膠頭滴管滴加蒸餾水至凹液面的最低點與刻度線相平。（6）搖勻并貼簽蓋好瓶塞，把容量瓶倒轉(zhuǎn)和搖動多次，使得溶液混合均勻。貼好標(biāo)簽，并注明溶液的名稱和濃度。01物質(zhì)的量濃度溶液的配制3．誤差分析配制溶液時能引起誤差的一些操作血清學(xué)反應(yīng)試劑制備目錄/Contents1基本概念pH指示劑的配制技術(shù)血清學(xué)鑒定2血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備301基本概念血清是指血液凝固析出的淡黃色透明液體。血清蛋白是指為避免抗凝劑的干擾，血液中許多化學(xué)成分的分析，都以血清為樣品。血清學(xué)檢驗就是利用抗原-抗體反應(yīng)的顯著特異性，進行細菌的鑒別和血清學(xué)定型。細菌菌體或鞭毛等抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。01基本概念血清學(xué)檢驗指根據(jù)抗原與相應(yīng)的抗體在適宜的條件下，能在體外發(fā)生特異性結(jié)合的原理，在體外用已知抗體（或抗原）檢測抗原（或抗體）。01基本概念

2.血清學(xué)反應(yīng)的一般特點（1）抗原抗體的結(jié)合具有特異性，當(dāng)有共同抗原體存在時，會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。（2）抗原抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的。01基本概念

2.血清學(xué)反應(yīng)的一般特點（3）抗原抗體的結(jié)合是按一定比例進行的，只有比例適當(dāng)時，才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。（4）血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個階段進行，但其間無嚴格界限。反應(yīng)速度慢，需幾分、幾十分以至更長時間。01基本概念3.血清學(xué)檢驗的類型血清學(xué)試驗可分為血清學(xué)鑒定和血清學(xué)診斷兩部分。血清學(xué)試驗既可定性，又可定量。用已知抗體（即含特異抗體的免疫血清或單克隆抗體等）檢測標(biāo)本中或分離培養(yǎng)物中未知細菌的種、型或細菌抗原，稱為血清學(xué)鑒定；而用已知細菌或特異性抗原檢測患者血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的動態(tài)變化，作為某些感染性疾病的輔助診斷，稱為血清學(xué)診斷。02血清學(xué)鑒定1．凝集反應(yīng)（1）直接凝集反應(yīng)①玻片凝集法方法是取已知抗體（診斷血清）滴加在載玻片上，直接從培養(yǎng)基上刮取待檢菌混勻于診斷血清中，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)細菌凝集成塊或肉眼可見的顆粒，即為反應(yīng)陽性。02血清學(xué)鑒定1．凝集反應(yīng)（1）直接凝集反應(yīng)②試管凝集法此法是一種定量試驗方法。多用已知抗原來檢測血清中有無相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進行流行病學(xué)調(diào)查。02血清學(xué)鑒定（2）間接凝集反應(yīng)法此反應(yīng)法是指將可溶性抗原或抗體吸附于某種與免疫無關(guān)一定大小的顆粒載體表面，制成致敏載體，再與相應(yīng)抗體或抗原作用，在電解質(zhì)存在的適宜條件下，被動地使致敏載體凝集的反應(yīng)。02血清學(xué)鑒定（2）間接凝集反應(yīng)法間接凝集反應(yīng)主要可分為正向間接凝集試驗、反向間接凝集試驗、間接凝集抑制試驗和協(xié)同凝集試驗。但根據(jù)載體的不同，還可以分為乳膠凝集、血球凝集、炭凝集、SPA協(xié)同凝集等。02血清學(xué)鑒定①正向間接凝集試驗即將已知可溶性抗原吸附于載體顆粒上，然后與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生顆粒凝集現(xiàn)象，用以檢測未知抗體。②反向間接凝集試驗此試驗是將已知抗體吸附于載體顆粒表面，以檢測相應(yīng)可溶性抗原的凝集反應(yīng)。適用于可溶性和顆粒性抗原的檢出，如從食品中檢出肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等菌體。02血清學(xué)鑒定③間接凝集抑制試驗它是將已知抗體或可溶性抗原先與被測的抗原或抗體混合，然后加入有關(guān)抗原或抗體致敏的載體顆粒，如果已知抗體或可溶性抗原與被測的抗原或抗體相結(jié)合后，不出現(xiàn)顆粒凝集的現(xiàn)象，也可稱為正向或反向間接凝集抑制試驗。02血清學(xué)鑒定④協(xié)同凝集試驗協(xié)同凝集反應(yīng)屬于間接凝集反應(yīng)的一種類型。它所用的載體是含SPA（葡萄球菌A蛋白）金黃色葡萄球菌。本試驗法操作簡便、快速、敏感性高，易于觀察結(jié)果，已廣泛用于細菌的快速鑒定和分群（型），如腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、布魯氏菌、沙門氏菌及志賀菌等細菌。02血清學(xué)鑒定2．沉淀反應(yīng)（1）環(huán)狀沉淀反應(yīng)此反應(yīng)是一種定性試驗方法，可用已知抗體檢測未知抗原。將已知抗體注入特制小試管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原與抗體對應(yīng)，則在兩液界面出現(xiàn)白色的沉淀圓環(huán)。02血清學(xué)鑒定2．沉淀反應(yīng)（2）絮狀沉淀反應(yīng)將已知抗原與抗體在試管（如凹玻片）內(nèi)混勻，如抗原抗體對應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時，會出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反應(yīng)。02血清學(xué)鑒定2．沉淀反應(yīng)（3）瓊脂擴散試驗利用可溶性抗原抗體在半固體瓊脂內(nèi)擴散，若抗原抗體對應(yīng)，且二者比例合適，在其擴散的某一部分就會出現(xiàn)白色的沉淀線。每對抗原抗體可形成一條沉淀線。有幾對抗原抗體，就可分別形成幾條沉淀線。瓊脂擴散可分為單向擴散和雙向擴散兩種類型。02血清學(xué)鑒定3．補體結(jié)合反應(yīng)此反應(yīng)法是一種在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)。血清學(xué)反應(yīng)的判定是這樣的：在試驗時，先將定量補體（使用新鮮的豚鼠血清）加入待檢系統(tǒng)中，使抗原抗體優(yōu)先結(jié)合補體。01血清學(xué)鑒定3．補體結(jié)合反應(yīng)如果待檢系統(tǒng)中抗原與抗體相對應(yīng)，加入的補體可被抗原抗體復(fù)合物所結(jié)合而固定，不再與以后加入的溶血系統(tǒng)起反應(yīng)，不出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，為補體結(jié)合反應(yīng)陽性；如待檢系統(tǒng)中的抗原抗體不相對應(yīng)，則游離的補體與后面加入的溶血系統(tǒng)反應(yīng)，從而出現(xiàn)溶血，為補體結(jié)合反應(yīng)陰性。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備1．0.1％十二烷基磺酸鈉（用于制備沙門氏菌樣品）用電子天平稱取0.2884g十二烷基磺酸鈉（SDS）溶于100mL水中，并轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，定容至1000mL，搖勻即可。2．營養(yǎng)肉湯（用于培養(yǎng)沙門氏菌）蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化鈉5.0g，加熱溶解于1000mL蒸餾水中，25℃條件下調(diào)整PH值7.2±0.2，配制好的溶液分裝進三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15分鐘備用。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備3．1.2%~1.5%瓊脂培養(yǎng)基稱取12g-15g的瓊脂，溶于1000mL的蒸餾水中，加熱使之溶解，室溫條件下慢慢冷卻即可。4．生理鹽水稱取0.9克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100毫升，即得濃度為0.9%的生理鹽水。5．15%氯化鈉稱取15克氯化鈉，溶解在少量蒸餾水中，稀釋到100毫升即得。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備7．PCA平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（用于菌落總數(shù)測定的）稱取胰蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15.0g，加入蒸餾水1000mL，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH7.0士0.2，然后分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15min。即得。8．月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（金黃色葡萄球菌的檢測）稱取胰蛋白胨或胰酪胨20.0g，氯化鈉5.0g，乳糖5.0g，磷酸氫二鉀2.75g，磷酸二氫鉀2.75g，月桂基磺酸鈉0.1g，溶于1000mL蒸餾水中，調(diào)整PH6.8士0.2，然后分裝到有玻璃小導(dǎo)管的試管中，每管10mL。121℃高壓滅菌15min。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備9．腦心浸出液肉湯（用于金黃色葡萄球菌的檢測）（1）配方胰蛋白質(zhì)胨10.0g，氯化5.0g，磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O)2.5g，葡萄糖2.0g，牛心浸出液500mL。（2）制法加熱溶解，調(diào)節(jié)pH7.4±0.2，分裝16mmX160mm試管，每管5mL，置121℃高壓滅菌15min。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備10．10％氯化鈉胰酪胨大豆肉湯（LST）（用于金黃色葡萄球菌的檢測）（1）配方胰酪胨（或胰蛋白胨）17g，植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3g，氯化鈉100g，磷酸氫二鉀2.5g，丙酮酸鈉10g，葡萄糖2.5g，蒸餾水1000mL。（2）制法將上述成分混合，加熱，輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié)pH7.3±0.2，分裝，每瓶50mL,121℃高壓滅菌。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備11．緩沖蛋白胨水（BPW）（用于沙門氏菌的前增菌）稱取蛋白胨10g，氯化鈉5g，磷酸氫二鈉9g，磷酸二氫鉀1.5g，蒸餾水1000mL。加熱攪拌至溶解，調(diào)節(jié)pH7.2，121℃高壓滅菌15min。12．250μg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱取250mg標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白，用0.03mol/LpH7.8的磷酸緩沖液溶解并定容至1L，于3.4℃保存。03血清學(xué)反應(yīng)常用試劑和培養(yǎng)基的制備13．血清肉湯（用于營養(yǎng)要求較高的細菌培養(yǎng)）（1）原料滅菌營養(yǎng)肉湯100mL，無菌血清（馬、牛或羊）10mL。

（2）制法取已制備好的營養(yǎng)肉湯，待冷卻后，以無菌操作，加入滅菌血清，混勻后，分裝于試管。常見培養(yǎng)基的配方及其特點目錄/Contents1基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)基鑒別和選擇培養(yǎng)基23加富培養(yǎng)基01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（1）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（簡稱PDA）（分離培養(yǎng)霉菌用）

馬鈴薯300g蔗糖（或葡萄糖）20g

瓊脂20g蒸餾水1000mLpH自然培養(yǎng)基的配制：將馬鈴薯去皮切塊，加1000mL蒸餾水，煮沸10～20min。用紗布過濾，補加蒸餾水至1000mL。加入葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝，121℃高壓滅菌20min。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基

（2）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)細菌用）牛肉膏3g蛋白胨5g氯化鈉10g瓊脂15~20gpH7.0~7.2水1000mL121℃滅菌20min。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（3）吲哚培養(yǎng)基（蛋白胨水）用于細菌靛基質(zhì)試驗胰酪蛋白胨10g氯化鈉5gL-色氨酸0.5g蒸餾水1000mLpH7.4。121℃滅菌15min。（4）玉米粉瓊脂（培養(yǎng)真菌用）玉米浸粉7.0g瓊脂15.0gpH值6.0±0.201基礎(chǔ)培養(yǎng)基（5）月桂基硫酸鹽胰蛋白胨MUG培養(yǎng)基胰蛋白胨20.0g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀2.75g月桂基硫酸鈉0.1g磷酸二氫鉀2.75gpH值6.8±0.2溫度25℃（6）改良山梨醇麥康凱(CT-SMAC)瓊脂蛋白胨20.0g山梨醇10.0g三號膽鹽1.5g氯化鈉5.0g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.001g瓊脂15.0gpH值7.2±0.201基礎(chǔ)培養(yǎng)基（7）營養(yǎng)瓊脂斜面蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g瓊脂15.0gpH值7.3±0.1（8）PSE瓊脂（用于糞鏈球菌的選擇性分離和計數(shù)（SN標(biāo)準(zhǔn)）蛋白胨20.0g酵母浸粉5.0g牛膽汁物10.0g檸檬酸鈉1.0g氯化鈉5.0g檸檬酸鐵銨0.5g疊氮化鈉0.25g七葉苷1.0g瓊脂15.0gpH值7.1±0.201基礎(chǔ)培養(yǎng)基（9）沙氏瓊脂培養(yǎng)基（用于真菌檢測）蛋白胨10.0g葡萄糖40.0g瓊脂20.0gpH值5.6±0.2（10）葡萄糖瓊脂胰蛋白胨10.0g酵母粉1.5g氯化鈉5.0g溴甲酚紫0.015g葡萄糖10.0g瓊脂12.0gpH值6.9-7.101基礎(chǔ)培養(yǎng)基（11）葡萄糖胰蛋白胨瓊脂胰酪蛋白胨10.0g葡萄糖5.0g瓊脂15.0g溴甲酚紫0.04pH值6.7±0.1（12）LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基蛋白胨10g酵母膏5g氯化鈉10g蒸餾水1000mLpH7.0。121℃滅菌20min。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（13）麥?zhǔn)希∕eclary）瓊脂（酵母菌）葡萄糖1g氯化鉀1.8g酵母浸膏2.5g醋酸鈉8.2g瓊脂15-20g蒸餾水1000mL113℃滅菌20min。（14）玉米粉蔗糖培養(yǎng)基玉米粉60g磷酸二氫鉀3g維生素B1100mg蔗糖10g七水合硫酸鎂1.5g水1000mL121℃滅菌30min，維生素B1單獨滅菌15min后另加。01基礎(chǔ)培養(yǎng)基（15）馬丁氏（Martin）瓊脂培養(yǎng)基（分離真菌用）葡萄糖10g蛋白胨5g磷酸二氫鉀1g七水合硫酸鎂0.5g1/3000孟加拉紅（rosebengal，玫瑰紅水溶液）100mL