微生物痕量基因殘留測定 微滴數(shù)字PCR法征求意見稿

GB/TXXXXX–2012GB/TXXXXX–2012微生物痕量基因殘留測定微滴數(shù)字PCR法范圍本標準適用于微生物痕量基因殘留測定微滴數(shù)字PCR法的原理、試劑或材料、儀器設備、測定步驟、結(jié)果分析。本標準適用于微生物加工產(chǎn)品中所殘留的痕量基因測定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件3.1微生物加工microbialprocessing利用微生物的代謝能力對原料進行發(fā)酵、催化、轉(zhuǎn)化等進行加工，以改變原料性質(zhì)的過程。3.2痕量基因殘留traceresidualDNA微生物加工產(chǎn)品在后續(xù)分離純化中無法去除的微量核酸。3.3微滴數(shù)字PCR微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。原理利用液滴微流控技術(shù)，基于泊松分布，將待測生物樣品所殘留的目標核酸PCR擴增體系分割成幾十到幾萬份包含一個或多個拷貝的核酸分子微升級油包水液滴。由于液滴體積小，目標核酸分子的相對濃度較高，可以按照常規(guī)PCR體系對其進行擴增，通過熒光探針實現(xiàn)信號讀出。所產(chǎn)生液滴陽性信號的數(shù)目即代表了原始樣本中目標核酸分子的拷貝數(shù)，從而直接數(shù)出目標核酸分子的個數(shù)，對起始樣品的進行絕對定量。試劑和材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。5.1水：GB/T6682一級。5.2數(shù)字PCR反應試劑盒5.3待檢測微生物基因引物和探針。儀器和設備6.1分析天平0.1mg6.2數(shù)字PCR儀6.3離心機6.4核酸測定儀6.5渦旋振蕩儀6.6其它相關(guān)儀器和設備6.7不同量程的移液槍及相應配套的吸頭測定步驟7.1樣品準備將樣品溶于不同體積的去離子水，獲得目標核酸濃度不同待測試樣。7.2數(shù)字PCR檢測7.3.1試樣數(shù)字PCR方法每個試樣的數(shù)字PCR反應都設置3個平行，并按照表1設置數(shù)字PCR的體系。表1數(shù)字PCR反應體系試劑終濃度體系2×Supermix1×10μLPrimer-F10μmol/L1.2μLPrimer-R10μmol/L1.2μLPrimer-P10μmol/L0.4μL待測試樣4μLDdH2O補足20μL注：此為一般反應體系，可根據(jù)不同市售數(shù)字PCR試劑盒進行調(diào)整體系配置完成后按照數(shù)字PCR儀器的說明書進行操作，對上述20μL擴增進行完全進行分割獲得油包水液滴。將液滴轉(zhuǎn)移96孔板，利用熱封機進行封膜。封膜之后應該在30min內(nèi)進行PCR反應，或者放于4℃冰箱4h之內(nèi)進行PCR擴增?？稍谌我庖慌_96孔PCR儀上完成，注意升降溫速度≤2.5℃/s，擴增程序見表2。表2數(shù)字PCR擴增程序步驟溫度時間循環(huán)數(shù)預變性9510min1變性9430s40退火/延伸601min保持4∞注：一般擴增程序不變，但可根據(jù)實際試驗情況調(diào)整退火溫度擴增結(jié)束后讀取所有液滴的熒光信號，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。7.3.2數(shù)字PCR的對照實驗在試樣進行檢測時，分別設置陽性和空白對照。合成目標核酸作為實驗的陽性對照，無菌雙蒸水作為空白對照。各對照PCR反應體系，均按照7.3.1中的數(shù)字PCR體系進行配置。結(jié)果分析8.1閾值的設定根據(jù)擴增體系終點熒光值設置熒光的閾限值，閾限值需明確區(qū)分擴增體系中的陰性液滴和陽性液滴。8.2對照組檢測結(jié)果分析陽性對照的結(jié)果中有目標基因擴增現(xiàn)象，空白對照中沒有任何擴增現(xiàn)象，表明此次數(shù)字PCR檢測正常，無需重復檢測，具有可信性。8.3試樣檢測結(jié)果分析按公式（1）計算：：CP=?式中：CP——X——陽性液滴數(shù)目占總有效液滴數(shù)目的比例；N——_________________________________前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。本標準起草單位：本標準主要起草人：前言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化