電鏡技術(shù)-第5次課

第三章超薄切片術(shù)(theTechniquesofUltrathinSection)超薄切片術(shù)是最根本的透射電鏡樣品制備技術(shù)，需要借助超薄切片機(jī)制備樣品，切片的厚度小100nm(一般30~70nm及其功能的有力工具。它分為一般超薄切片術(shù)和冷凍超薄切片術(shù)兩大類。電鏡樣品必需滿足一些根本的條件才能用于觀看第一為保持電鏡工作真空和樣品在真空下不損傷，樣品必需徹底枯燥。其次電鏡所成的圖像是黑白圖像，要求圖像有肯定的反差，而生物樣品供給的反差低，樣品要進(jìn)展提高反差的處理，如電子染色和金屬噴鍍等方法。都會使圖像模糊。所以要求透射電鏡樣品肯定要薄。同時考慮到反差，一般認(rèn)為在50~1OOkV5OO第四樣品應(yīng)當(dāng)能耐受電子束的猛烈照耀，在電鏡觀看程中不發(fā)生變形和升華等損傷。制備好的超薄切片，應(yīng)當(dāng)滿足如下要求細(xì)胞的精細(xì)構(gòu)造保存良好，沒有產(chǎn)生明顯的物質(zhì)的凝集、喪失或添加等人工效應(yīng)500?1000?切片能耐受電子束的猛烈照耀電鏡觀看過程中，包埋介質(zhì)不發(fā)生變形或升華切片應(yīng)具有良好的反差切片均勻，并且沒有皺摺、刀痕及染色劑沉淀等缺陷超薄切片主要步驟殺死組織，同時把從細(xì)胞間的聯(lián)系直至細(xì)胞器的分子構(gòu)造的全部組織的精細(xì)構(gòu)造真實(shí)地保存下來2.脫水從組織中除去游離水分，并用一種既能和水又能和滲透液相混的惰性液體取代組織中的水。3.塊染使組織某些成分結(jié)合重金屬離子，引起電子散射力量差異，提超群微構(gòu)造電鏡圖像的反差。4.滲透和包埋用另一種溶液或混合液取代脫水液。它們很簡潔硬化成固體，并且有足夠的彈性，以切出5OOA的平薄切片。５.聚合滲入組織里的包埋液變硬，以便形成一個能結(jié)實(shí)地支持組織的固態(tài)基質(zhì)，而不混亂其空間聯(lián)系。６.切片將帶有組織的固態(tài)基質(zhì)(稱為“包埋塊切成500? 左右的超薄切片。７.安放把單張或切片帶移到樣品支持載網(wǎng)上，以便放入電子顯微鏡中觀看８.切片染色使載網(wǎng)上切片和重金屬溶液反響，以增加組織成分的電子散射力量９.鏡檢把有樣品切片的載網(wǎng)放人電子顯微鏡中觀看，可得到樣品的電子顯微鏡圖像和照片。80%70樣品90%100%修塊超薄切片染色超薄切片的樣品制備流程一、取材預(yù)備工作取材原則預(yù)備工作取材時需預(yù)備各種溶液、玻璃器皿及器件所需溶液主要有緩沖液，戊二醛、鋨酸30%丙酮，50%丙酮，70%丙酮，80%丙酮，95%100%丙酮分別用于滴加戊二醛、緩沖液、鋨酸、脫水劑、包埋劑、廢棄溶液的玻璃吸管，小稱量瓶，載玻片和封口膜，雙面刀片和醫(yī)用剪刀，一般鑷子及游絲尖鑷，用于轉(zhuǎn)移組織的牙簽。此外，還需預(yù)備雙目解剖鏡為得到超微構(gòu)造保存良好的樣品，從第一步取材就需重視操作中應(yīng)留意的問題，如選擇銳利切割器械、織塊大小適中、固定液溫度適宜等取材原則動作快速 組織離體后，應(yīng)將其快速放人化學(xué)固定液內(nèi)，使組織和細(xì)胞盡可能保持原來的生活狀態(tài)〔動物材料半分鐘或最多2分鐘內(nèi)減小損傷選擇銳利切割器械，避開或盡量削減牽拉或擠壓組織。組織塊小為使組織得到均勻而充分固定，所取材料一般要小于lmm3。低溫操作 為削減對組織細(xì)胞酶活性的破壞，最好在4℃下操作，所用容器、器械及戊二醛固定液均需預(yù)冷。在血液供給停頓后，防止組織和細(xì)胞內(nèi)各種酶的作用使組織發(fā)生自溶，降解組織中蛋白、核酸等主要成分。二、固定固定的定義和目的固定方法影響固定效果的因素固定劑常用的固定操作法固定的定義和目的定義：固定是指用物理或者化學(xué)的方法快速殺死細(xì)胞的過程。目的：防止組織細(xì)胞的離體后變化，防止自溶，以保持組織細(xì)胞的成分和構(gòu)造與其生活狀態(tài)盡量全都。在固定以后的漂洗、脫水和包埋等樣品處理過程中，保護(hù)樣品使其物質(zhì)不致溶解和流失。為樣品以后的處理〔包括染色和和經(jīng)受電子束轟擊〕作預(yù)備，使其組織適當(dāng)?shù)赜不?。固定方法物理固定法用高溫、冷凍、微波、枯燥等物理手段，使?xì)胞構(gòu)造固定?；瘜W(xué)固定法承受化學(xué)試劑來固定細(xì)胞構(gòu)造。這種方法應(yīng)用的較廣泛。常用的固定劑有甲醛、戊二醛、四氧化鋨、高錳酸鉀及重鉻酸鉀等等在化學(xué)固定中，固定液和樣品作用，使細(xì)架間的流淌蛋白質(zhì)凝固，以保存各種細(xì)胞器的空間聯(lián)系。同時，使細(xì)胞的全部組成成分，如核酸、蛋白質(zhì)、核蛋白、糖類和脂類等變?yōu)椴恍腥芙獾奈镔|(zhì)。另外，固定劑中常有重金屬原子，其和組織成分用，可提高電子反差。３.影響固定效果的因素固定液的滲透速度固定液濃度固定溫度固定時間組織塊大小固pH固定液滲透壓緩沖液固定液的滲透速度抱負(fù)的固定液應(yīng)能快速將組織細(xì)胞殺死，并使之收縮和膨脹量最小。細(xì)胞被殺死的速度主要取4mm/h2mm/h>(0.1～０.5)mm/(1～１.5)h固定液濃度及固定時間，可增加滲透速率;灌注固定也是加快滲透速率的有效途徑。致密組織會使固定液滲入緩慢，組織內(nèi)空氣多或外表含蠟，也會阻礙固定液滲入，甚至使組織漂移在固定液面上。消滅這種狀況，可在固定前抽氣，或用稀釋的去垢劑處理。固定液濃度組織細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)受固定液濃度影響較大。假設(shè)固定液濃度過低，則需較長時間固定，這易引起組織中酶的集中，造成細(xì)胞物質(zhì)的抽提。過高濃度固定液，尤其氧化固定劑類易損壞酶活性和細(xì)胞構(gòu)造，使細(xì)胞過度收縮。因此，1.5%~4%胎組織，或泡狀物較多的肺組織時，可用稍高濃度的固定液。固定溫度戊二醛固定液與組織之間發(fā)生的反響隨溫度增加而 強(qiáng)室溫下固定組織，可提高固定液滲透速率，較好保存細(xì)胞中的微絲和微管。低溫下固定組織，可減小線粒體和細(xì)胞質(zhì)顆粒體積變化，降低酶的活性，削減細(xì)胞自溶及胞內(nèi)物質(zhì)的抽提。灌注固定取材時，假設(shè)固定液溫度低于體溫，將會引起血管收縮，導(dǎo)致固定效果較差。某些致密樣品不適合在低溫下固定。另外，當(dāng)組織放在冷的鋨酸固定液時，微管構(gòu)造將會喪失。通常，固441-4h。固定時間固定的最正確時間應(yīng)由固定液和緩沖液類型、樣品種類及大小、固定溫度及固定液濃度等因素打算。假設(shè)組織固定時間過長，會造成某些成分抽提。由于化學(xué)固定劑引起的抽提作用隨時間延長而漸漸積存，故確定適宜的固定時間格外重要。鋨酸固定時間的掌握比戊二醛嚴(yán)格。由于，組織經(jīng) 鋨酸長時間固定會引起脂蛋白復(fù)合體溶解，造成組織變脆，而不利于超薄切片。通常，鋨酸固定時間為15min~2h。單個細(xì)胞或顆粒狀樣品，固定時間應(yīng)縮短;構(gòu)造致密的樣品，固定時間應(yīng)延長。組織塊大小組織固定不好的緣由，多為組織塊偏大或是延遲了組織放入固定液的時間。只有組織塊較小才能得到 快速均勻的固定。鋨酸固定液的均勻固定深度為0.25mm，戊二醛的均勻固定深度為0.5~lmm。一般來講，組織塊表層固定效果較好，但表層易有機(jī)械損傷。組織中心雖無機(jī)械損傷，但固定效果不夠好。所以，取材時要求盡可能將組織塊切小，使組織表層及中心部位均得到良好固定。對于組織表層的機(jī)械損傷，在修整包埋塊時可適當(dāng)修除一薄層。pHpHpHpHpH平均為7.4。試驗(yàn)中，不同組織需用不同pH的固定液。含水量高的動物組織，如原生動物、海生無脊椎動物以及胚胎組織需用pH8.0~8.4固定液;胃黏膜組織需用pH8.5pH6.8~7.1pH6.2固定液滲透壓固定液滲透壓對組織固定效果的影響不容無視。為此，通常用電解質(zhì)物質(zhì)氯化鈉或非電解質(zhì)物質(zhì)蔗糖、葡萄糖等調(diào)整固定液的滲透壓，以使組織得到良好的固定。固定液假設(shè)是等滲的，滲透速度則比較慢;假設(shè)固定是高滲的，將會引起組織收縮;假設(shè)固定液是低滲的，將引起組織細(xì)胞膨脹。樣品制備時，假設(shè)樣品為培育細(xì)胞，應(yīng)考慮細(xì)胞培育液與固定液滲透壓是否全都，假設(shè)固定液滲透壓低于培育液滲透壓，將導(dǎo)致細(xì)胞膨脹裂開。所緩沖液緩沖液在組織固定中的作用比較簡單。為維持細(xì)胞本身的pH良好的固定質(zhì)量，正確使用及選擇緩沖液格外重要。有些緩固定液發(fā)生反響，降低緩沖液和固定液兩者效力還有些緩沖液抽提組織中物質(zhì)。假設(shè)在預(yù)固定時末用緩沖液，組織的pH則會急劇下降，使組織產(chǎn)生大量人為假象。不同組織對同一種緩沖液反響不同，而相近組織對不同緩沖反響也不同。因此，應(yīng)依據(jù)試驗(yàn)要求選擇緩沖液。４.固定劑固定的目的要求抱負(fù)固定劑應(yīng)具備以下條件:能快速而均勻地滲透到組織內(nèi)部，并能馬上殺死細(xì) 胞，以盡量削減死后變化能使各種構(gòu)造成分凝固或變性，并穩(wěn)定，以保證在后繼的各種處理過程中不致消逝能保存肯定的酶活性，以供細(xì)胞化學(xué)的測定對細(xì)胞沒有收縮或膨脹作用，以保持各種構(gòu)造在生活時的外形沒有人工假象，以保證電鏡圖像的真實(shí)性有防腐作用，以利于較長期的保存樣品。固定劑的種類及性能鋨酸戊二醛甲醛高錳酸鉀丙烯醛１〕四氧化鋨四氧化鋨是一種淡黃色結(jié)晶，具有特別的臭味，習(xí)慣上稱為鋨酸，它的水溶液呈中性，所以正確的應(yīng)稱為四氧化鋨。它是一種強(qiáng)氧化劑，有毒性，其蒸氣對眼、鼻、喉等粘膜有猛烈的刺激作用，水溶液能燒傷皮膚。四氧化鋨優(yōu)點(diǎn)幾乎和細(xì)胞內(nèi)全部成分發(fā)生化學(xué)結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)結(jié)實(shí)地吸附在為其所穩(wěn)定的構(gòu)造上，把構(gòu)造圖像能較完善地刻畫出來。蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)結(jié)合時，形成交鏈，而不是沉淀，以穩(wěn)定蛋白質(zhì)。因此能較完好地保存生物微細(xì)構(gòu)造。它能保護(hù)脂肪，與脂肪的不飽和脂肪酸結(jié)合，形成脂肪-鋨復(fù)合物。是現(xiàn)在全部固定劑中唯一的脂肪性物質(zhì)的固定劑。雖然對碳水化合物保護(hù)較差，但對組成細(xì)胞支架的磷脂蛋白質(zhì)保護(hù)很好。對核酸保護(hù)作用差，但對核蛋白保護(hù)很好。鋨的原子序數(shù)高，為76，對生物樣品有電子染色作用。對緩沖液要求不高經(jīng)過四氧化鋨固定的組織，既不收縮，也不膨脹，亦不變硬或發(fā)脆，有利于超薄切片。四氧化鋨的缺點(diǎn)不能保護(hù)糖原，不能固定核酸，對微管固定作用較差。不適于進(jìn)展超微細(xì)胞化學(xué)方面的工作。子量大，滲透力量差，大于lmm３的組織塊固定不完有揮發(fā)性，對粘膜有毒性作用，吞食或經(jīng)皮膚吸取可能致命，有強(qiáng)刺激性。2〕戊二醛戊二醛優(yōu)點(diǎn)對組織的穿透力量較強(qiáng)、較快，組織塊可適當(dāng)增大到數(shù)毫米，也不影響固定效果。對蛋白質(zhì)反響較快，能較好地保存蛋白質(zhì)。對糖原、核蛋白，尤其是微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞膜系統(tǒng)構(gòu)造和細(xì)胞基質(zhì)有較好的固定作用。保存肯定的酶活性，適于做超微細(xì)胞化學(xué)爭論。不揮發(fā)，但簡潔經(jīng)皮膚吸取，對皮膚、眼睛、粘膜及上呼吸道有刺激性。樣品在冷戊二醛固定液中數(shù)周到數(shù)月，不致產(chǎn)生不良后果，為野外工作和遠(yuǎn)離試驗(yàn)室的現(xiàn)場取材，供給大便利。戊二醛缺點(diǎn)對脂類保護(hù)不好。經(jīng)戊二醛單獨(dú)固定的組織，在脫水時大局部脂類會被脫水劑抽提而喪失。另外它不能供給電子反差，對緩沖液的要求也較高。固定，再以四氧化鋨固定液后固定?？梢允箖煞N固定劑相互補(bǔ)充，樣品取得良好的固定效果。因戊二醛和四氧化鋨混合會形成沉淀，所以戊二醛固定后，必需用緩沖液充分洗滌后，才能將組織塊轉(zhuǎn)人四氧化鋨后固定。戊二醛和醋酸-巴比妥緩沖液相互反響，所以戊二醛的緩沖液不能承受醋酸-巴比妥緩沖液。為充分發(fā)揮戊二醛固定效果，使用和儲存過程中應(yīng)留意以下凡種因素的影響pHpHpH3.5力也將大幅度降低。有試驗(yàn)說明，純戊二醛溶液pH54℃或更低溫度可保持穩(wěn)定狀態(tài)幾個月，如在-146個月不會消滅聚合現(xiàn)象。氧氣和濃度氧氣對戊二醛溶液的影響較大，所以，無論是純的還是與緩沖液混合的戊二醛，均應(yīng)密封保存。另外，濃度大50%的戊二醛溶液在室溫下簡潔聚合成膠狀，因此保存低于4%的溶液較穩(wěn)妥。雜質(zhì)污用緩沖液或水稀釋戊二醛溶液時，因某些雜質(zhì)污染，能產(chǎn)生白色沉淀物。故此，在配制戊二醛固定液時，應(yīng)確保玻璃器皿及水的干凈。3〕甲醛甲醛為無色氣體，溶于水，37％~40%的水溶液為福爾馬林，甲醛曾作為早期電鏡工作的固定劑，但當(dāng)它濃度過高時，或脫水時會使細(xì)胞中某些物質(zhì)因解固定而流失消滅空洞現(xiàn)象，對細(xì)胞超微構(gòu)造保存不好。甲醛在溶液形式下會形成長度不均的聚合物，會影響交聯(lián)效力和滲透速度，曾被淘汰。甲醛有以下優(yōu)點(diǎn)：滲透速度比戊二醛還要快，固定快速，組織塊大小不受限制；對酶活性存比戊二醛好；濟(jì)便利?，F(xiàn)在還是承受，但一般不單獨(dú)使用，通常作為四氧化鋨和戊二醛的前固定劑，或和戊二醛組成混合固定液。4〕6%，呈赤紫色溶液，它也是一種強(qiáng)氧化劑。高錳酸鉀的特點(diǎn)是磷脂蛋白的優(yōu)良固定劑，空間關(guān)系保存好。對神經(jīng)髓鞘、脂質(zhì)固定特別好，是細(xì)胞膜構(gòu)造的良好固定劑。對葉綠體的構(gòu)造固定也好。對生物樣品有電子染色作用。高錳酸鉀對細(xì)胞的其它成分固定不好。對細(xì)胞內(nèi)顆粒性或纖維狀構(gòu)造固定效果欠佳，有些組織構(gòu)造將會在固定期間和脫水過程中發(fā)生變化，如線粒3%高錳酸42h，用緩沖液沖洗幾次后過夜，然后按標(biāo)準(zhǔn)步驟脫水。另外，用高錳酸鉀固定的組織，一般不需用鋨酸后固定。高錳酸鉀也可以作為戊二醛的后固定劑。5〕丙烯醛丙烯醛(C3H4O)為單醛。與大多數(shù)固定液相比，其滲透和反響速度均較快。稍大一些的組織塊可用丙烯醛作固定液。丙烯醛與戊二醛混合液可較好保存微管。當(dāng)丙烯醛暴烯醛易燃，是危急化學(xué)品，可由呼吸系統(tǒng)吸人，通過皮膚吸取，并對皮膚有猛烈刺激作用。5、常用的固定操作法動物組織固定動物組織取材通常承受灌注固定和浸入固定兩種方式。灌注固定可使組織得到快速、均勻而充分的固定，細(xì)胞成分穩(wěn)定，構(gòu)造形態(tài)變化最小。浸人固定則存在某些缺乏。如解剖時，動物血壓的快速變化可導(dǎo)致組織體積轉(zhuǎn)變;動物缺氧和死后變化可引起組織形態(tài)轉(zhuǎn)變;組織外外表的固定可阻礙固定液進(jìn)一步滲人;由于戊二醛和餓酸滲透力量有限，往往便尺寸偏大的組織中心部位得不到充分固定。盡管浸入固定有很多弊端，但因其操作簡潔便利，假設(shè)能較好把握取材方法，如解剖動物動作盡可能快速，剪下的組織塊盡可能小些，并盡可能快地放入固定液等，也能得到較好的固定效果。故仍有許多組織樣品實(shí)行這種固定方式。例如皮膚和骨組織在血液供給停滯后，可短時間保持其結(jié)構(gòu)不變，較適合承受浸人固定方式。浸入固定將動物麻醉或急性處死，解剖所需器官，用銳利潔凈解剖剪刀取下小塊組織，放入預(yù)冷2.5%lmmхlmmх3mmlmm31-2h5102.5%0.lmol/L(PBS)315min11~2h。灌注固定灌注固定需經(jīng)血液循環(huán)途徑，使所需組織或器官得到良好固定。如獵取動物肝臟組織時，先將動物麻醉，解剖后使心臟和肝臟暴露，將注射器針頭插人左心室，注入漂洗液，同時將右心房剪開，通過體循環(huán)沖洗大約30S，當(dāng)肝臟從深棕黃色變成淡棕黃色時注入固定液，待組織適度變硬后，用剪刀取下一塊組織，切成小塊后放入預(yù)冷固定液。組織臨時儲存為削減細(xì)胞物質(zhì)喪失，取材后應(yīng)馬上進(jìn)展固定和包埋等一系列操作程序。但在外科手術(shù)中意外獵取的組織，手頭又缺乏用于電鏡樣品制備藥品和設(shè)備時，則需將組織材料臨時儲存。用于儲存組織材料的固定液種類則取決于樣品大小和爭論目的。較小組織可短時間儲存在3mm4%1%戊二醛固定液中;2~3cm材料需放在滲透效果較強(qiáng)的丙烯醛或甲醛固定液中，10%多聚甲醛0.2mol/L三甲基吡啶緩沖液一般用于較大組織的固定，但這種固定液可能會抽提組織成分。已用醛類固定的組織材料不宜在緩沖液中儲存。體外培育細(xì)胞的固定單層細(xì)胞2%戊二醛固定液后放在3~5min3m12023r?min15~2Omin2%戊二醛固定液緩慢參加細(xì)胞，固定液參加量按1515~3Omin1-2115-3Omin。懸浮培育細(xì)胞離心法 在培育液中參加等量固定液，離心使細(xì)胞分散成團(tuán)。假設(shè)細(xì)胞離心后仍呈絮狀，輕輕吸去上清液后，于沉淀物中加幾滴溶化的2%瓊脂或牛血清白蛋白，以促使細(xì)胞分散。瓊脂預(yù)包埋法將經(jīng)固定液固定的細(xì)胞懸液離心，棄上清液后，在50℃水浴中將細(xì)胞團(tuán)加熱，用的吸管吸一滴已加熱溶化并冷卻至50℃的瓊脂，滴入細(xì)胞團(tuán)中，使細(xì)胞懸浮。為避開瓊脂凝固，將細(xì)胞放在保溫的離心管中，在3000~5000r?min條件下離心lmin。在離心管置于冰浴條件下，參加70%乙醇，停留1h。當(dāng)細(xì)胞團(tuán)被瓊脂包埋后，取出并切成小塊，用常規(guī)方法進(jìn)展雙重固定。瓊脂鑄模法該方法可將分散樣品高度濃縮在微小空間內(nèi)，不僅適制備懸浮培育細(xì)胞，而且適合制備細(xì)菌、藍(lán)藻、原生動物和花粉等細(xì)小分散的生物樣品。藻類細(xì)胞的固定淡水藻細(xì)胞穎的淡水藻細(xì)胞，固定液戊二醛和鋨酸通常0.025mol/LPBS配制。海藻細(xì)胞因滲透壓對海藻細(xì)胞的影響，溶液配制與樣品制備均不同于淡水藻。不管是淡水藻還是海藻，分布均較分散，為將分散樣品濃縮在微小空間內(nèi)，可用瓊脂鑄膜法制備樣品。植物材料固定取材時應(yīng)先將組織切成薄片狀，然后切成lmm3小塊。組織放入戊二醛固定液后，需用真空泵抽出組織內(nèi)部的氣體，使材料沉人固定液中。植物材料固定液濃度與固定時間與動物材料不同。戊二醛固定液濃度一般為0.5%~12%，大2.5%~5%.6.固定方式戊二醛一鋨酸雙重固定法本法可充分發(fā)揮戊二醛與四氧化鋨二固定劑的優(yōu)點(diǎn)，有利于保存細(xì)胞內(nèi)各種微細(xì)構(gòu)造，所以現(xiàn)在被普遍承受，其操作步驟是：將生物樣品先浸入預(yù)冷(42%~4%1~2現(xiàn)0.6~2〔)1％鋨酸室溫下后固定1~2小時。樣品經(jīng)戊二醛固定后呈淡黃色，再經(jīng)鋨酸固定后則變成黑色?；旌瞎潭ɑ旌瞎潭ㄊ菍⑦m當(dāng)濃度戊二醛和餓酸固定液混合，并同時對組織進(jìn)展固定的一種方法。在雙重固定方法中，鋨酸固定前需用緩沖液將組織中殘留戊二醛漂洗干凈，以免其與鋨酸作用產(chǎn)生微小沉淀。而在混合固定方式中，將戊二醛和鋨酸兩者混合，對組織構(gòu)造同時發(fā)揮各自的固定作用，不會有沉淀產(chǎn)生。雙重固定與混合固定，雖然均是戊二醛和鋨酸在組織中起固定作用，但因操作方式不同，這是可否產(chǎn)生沉淀的關(guān)鍵。兩者反響生成沉淀存在滯后時間，滯后時間長短與固定溫度有關(guān)，溫度越低，兩者反響的滯后時間越長?；旌瞎潭ǖ膬?yōu)點(diǎn)可防止膜中脂質(zhì)移動，尤其可防止流淌性脂質(zhì)的變化。該固定方式可使膜構(gòu)造清楚，可良好保存核蛋白、脂質(zhì)和多糖。顆粒狀和泡狀構(gòu)造較清楚，但糖原可能有所削減。對單個細(xì)胞構(gòu)造的保存，明顯好于雙重固定。假設(shè)在脫水前用2%醋酸雙氧鈾對組織進(jìn)展后固定，則利于樣品構(gòu)造保存，并能增加反差。適合纖毛蟲、四膜蟲及簡潔裂開構(gòu)造的保存?；旌瞎潭ǖ娜秉c(diǎn)當(dāng)兩種固定液同時固定組織時，它們各自的固定效果將有所減弱;兩者對氨基酸殘基的交聯(lián)有競爭現(xiàn)象;混合固定液對蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用不及單獨(dú)用戊二醛三、脫水１.脫水的定義：脫水是指將組織內(nèi)所含的游離水完全去除過程，屬于包埋前必經(jīng)步驟。２.脫水的必要性〔１〕才能保證包埋劑完全深入生物樣品內(nèi)?！玻病臣僭O(shè)含有水分的生物樣品進(jìn)入電鏡的高真空中，樣品就會急驟收縮并放出水蒸氣，這樣就會使電鏡的高真空遭到損壞，并且造成鏡筒的污染。３.常用的脫水劑及脫水程序抽提取代;假設(shè)脫水急驟，常易引起組織塊中滲透壓等條件的猛烈變化，樣品消滅猛烈收縮，會導(dǎo)10~1551具體的脫水程序徹底清洗樣品 30分鐘以上(中間換緩沖液數(shù)次)30％乙醇或丙酮 10~15分鐘50％乙醇或丙酮 10~15分鐘70％乙醇或丙酮 10~15分鐘(如因工作安排關(guān)系，4℃冰箱內(nèi)過夜)80％乙醇或丙酮 10~15分鐘90％乙醇或丙酮 10~15分鐘100％乙醇或丙酮230游離和培育細(xì)胞的脫水時間可適當(dāng)縮短。４.脫水時的留意事項(xiàng)脫水肯定要徹底，特別是100％乙醇或丙酮應(yīng)確定保證無水，為此可事先參加吸水劑(如無水硫酸鈉、無水硫酸銅等)進(jìn)展吸水處理。假設(shè)當(dāng)天完不成浸透、包埋操作時，應(yīng)將樣品停40C、7070％的濃度時所引起的組織塊體積變化最小。高濃度的脫水劑，尤其100％脫水劑中決不行停留過夜，不僅可引起組織內(nèi)過多物100％脫水時，更要留意樣品塊不要在空氣中停留時間過長，否則會造成樣品枯燥，使樣品內(nèi)產(chǎn)生小氣泡致使包埋劑難以浸透。潮濕季節(jié)在空氣中暴露時間過長也會吸水受潮。四、浸透１.浸透的定義：是用一種溶液或混合液漸漸取代組織內(nèi)的脫水劑，使細(xì)胞內(nèi)外全部空隙被這種溶液填充。.〔經(jīng)過脫水處理后的樣品，即可用包埋劑進(jìn)展浸透〕樣品中的脫水劑，使細(xì)胞內(nèi)外全部空隙都被包埋劑所填充。３.浸透的技術(shù)操作由于包埋劑的粘度要比脫水劑大得多，所以要用環(huán)氧丙烷與包埋劑配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度漸漸增加，以提高樣品的質(zhì)量。環(huán)氧丙烷能與環(huán)氧樹脂類的包埋劑較好地混溶，有助于到達(dá)逐級浸透的目的。浸透液的配制和使用方法如下:環(huán)氧丙烷:包埋劑=3:1(V/V)30~60分鐘環(huán)氧丙烷:包埋劑=1:1(V/V)30~60分鐘環(huán)氧丙烷:包埋劑=1:3(V/V)30~60分鐘100%包埋劑 1~2小時五、包埋１.包埋的定義：是將浸透好的樣品塊放到適當(dāng)?shù)哪＞咧校嗌习褚喊?，?jīng)加溫聚合形成一種固體基質(zhì)，結(jié)實(shí)地支持組織，又不混亂其空間聯(lián)系。２.包埋的目的：一方面要支撐樣品本身的超微構(gòu)造，另一方面使能切片。３.抱負(fù)的包埋劑應(yīng)當(dāng)具備以下條件能與脫水劑(乙醇、丙酮等)完全混溶粘度低、易操作、而且易于滲入樣品內(nèi)部聚合后質(zhì)地均勻，體積變化小。能耐受電子束的照耀與轟擊在浸透過程中，對細(xì)胞成分抽提少，可保存其微細(xì)結(jié)在電鏡高倍放大下，不顯示包埋劑本身的任何微細(xì)構(gòu)造包埋后具有良好的切片性能，包括均勻性、可塑性、硬度和彈性等對人體無毒害作用廣且材料來源豐富，操作簡便，價格廉價。常見的包埋介質(zhì)的缺點(diǎn)聚合損傷:包埋介質(zhì)滲透到組織中而引起組織過分膨脹所造成的 組織損傷。用甲基丙烯酸酯包埋時，聚合損傷嚴(yán)峻，達(dá)15%~20%，環(huán)氧樹脂和聚醋樹脂較小些，僅2%。電子束損傷有的包埋介質(zhì)在電子轟擊下會蒸發(fā)，或分解，損傷樣品的超微構(gòu)造。收縮損傷包埋介質(zhì)在聚合時因聚合反響而引起的體積收縮，對樣品的損傷叫收縮損傷。粘度損傷樹脂都是格外粘稠的液體，操作時很不便利。包埋液中的各成分因太粘稠很難混合均勻。另外攪拌時很難避開產(chǎn)生氣泡，最終都將影響包埋效果。滲透壓損傷毒性４包埋劑的種類１〕甲基丙烯酸酯1949Newman期對超薄切片起過很大的推動作用。其優(yōu)點(diǎn)是粘度低，極易浸透，具有良好的切片性能及良好的反差；但因其本身的缺點(diǎn)：聚合后收縮率大，造成樣品損傷，在電子束的照耀下易升華，并導(dǎo)致組織構(gòu)造破壞和鏡筒污染，現(xiàn)在根本上不承受了。不過，有人有時還用它作為某些樣品的包埋介質(zhì)，如在電鏡細(xì)胞化學(xué)中有時應(yīng)用它。２〕環(huán)氧樹脂類這是當(dāng)前承受最多的包埋劑。它具有三維交聯(lián)構(gòu)造，包埋后可保存細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)構(gòu)造，2％左右)，耐受電子束轟擊性能好。其缺點(diǎn)是粘度較大，操作不便、切片較為困難，而且反差較弱。包埋塊切片時的難易，與樹脂、固化劑、增塑劑及催化劑之間的比例有關(guān)，而且還取決于聚合的溫度、時間等因素。2.4.6－三甲氨基甲基苯酚簡稱為DMP30，其主要作用是可以催化聚合反響，但本身并不參加到樹脂鏈中。DDSAMNA)等，它們參與樹脂三維聚合中的交聯(lián)反響，并被吸取到樹脂鏈中。常用的增塑劑為鄰苯二甲酸二丁酯(簡稱DBP)，其主要作用是提高包埋塊的彈性和韌性，改善其切割性能。Epon812，國內(nèi)也較普遍承受。同時國內(nèi)也常用國產(chǎn)的環(huán)氧樹脂618，下面分別介紹?！玻薄矱pon812Epon812是一種甘油基脂肪族環(huán)氧樹脂，溶于乙醇和丙酮，不溶于水?！玻病?18Epon812618程度影響反差，粘度也較大，操作較困難些，但其比Epon812好切片，又國產(chǎn)易得，在618〔３〕聚醋樹脂聚醋樹脂包埋介質(zhì)具有環(huán)氧樹脂的優(yōu)點(diǎn)，切片簡潔，好染色，包埋塊硬，適用于細(xì)菌和植物組織等硬樣品。但因不大穩(wěn)定，沒被廣泛承受。５.包埋劑的配制單純用某一種物質(zhì)作包埋劑往往效果不抱負(fù)，因此，常用多種物質(zhì)配制成復(fù)