基因工程的基本操作程序課件 【知識精講精研】高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三

基因工程的基本操作程序基因工程從社會中來普通棉花轉(zhuǎn)基因抗蟲棉將蘇云金桿菌中的Bt抗蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入普通棉花我國是棉花的生產(chǎn)和消費大國。棉花在種植過程中，常常會受到一些害蟲的侵襲，其中以棉鈴蟲最為常見。如何能培育出自身就能抵抗蟲害的棉花新品種呢？從社會中來培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程蘇云金桿菌

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細胞抗蟲棉提取表達Bt基因?qū)肱c載體拼接重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測與鑒定Bt基因一、目的基因的篩選與獲取1.目的基因在基因工程的設(shè)計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等相關(guān)的基因。目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲。當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。1.Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理？2.抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會不會對人畜產(chǎn)生危害？Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響。一、目的基因的篩選與獲取蘇云金桿菌制成殺蟲劑掌握目的基因的功能掌握目的基因的結(jié)構(gòu)防治棉花害蟲發(fā)現(xiàn)殺蟲作用與Bt基因有關(guān)掌握Bt基因的序列深入了解Bt基因的表達產(chǎn)物(Bt抗蟲蛋白)Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因。一、目的基因的篩選與獲取2.篩選合適的目的基因從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中篩選，是較為有效的方法之一。認識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法隨著測序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）、序列比對工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機會和可能。一、目的基因的篩選與獲取3.目的基因的獲取方法（3）利用PCR獲取和擴增目的基因（1）從基因文庫中獲取（2）人工合成一、目的基因的篩選與獲取

基因比較小、核苷酸序列已知,通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成基因組文庫（包含一種生物的所有基因）部分基因文庫（包含一種生物的一部分基因）

（cDNA文庫）利用PCR獲取和擴增目的基因PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。PCR是一項根據(jù)

的原理，在

提供參與DNA復(fù)制的

與

，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件PCR——聚合酶鏈式反應(yīng)（1）PCR的原理：DNA半保留復(fù)制（2）體外PCR所需的基本條件耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2種）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）四種脫氧核苷酸激活真核細胞和細菌的DNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTP(dNTP)

dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。

引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為20~30個核苷酸。在細胞中為一段單鏈RNA，在PCR中為一段人工合成的單鏈DNA。什么是引物子鏈延伸子鏈延伸引物是決定PCR特異性的關(guān)鍵。-5′3′-引物5

′--3′5′--3′引物3′--5′利用PCR獲取和擴增目的基因3′5′子鏈的延伸方向是5′→3′DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有鏈的3′端引物的作用:

引物為DNA聚合酶提供了游離的3′端，使DNA聚合酶從3′端延伸子鏈。(DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能)引物參與的組分在PCR的作用目的基因DNA4種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)引物緩沖液Mg2+高溫使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈維持反應(yīng)體系的pH激活DNA聚合酶的活性（3）PCR的過程DNA解旋為單鏈高溫(95℃)變性低溫(50℃)復(fù)性中溫(72℃)延伸引物結(jié)合到互補DNA鏈Taq酶從引物起始進行子鏈的合成PCR過程可以在PCR擴增(PCR儀)中自動完成。第1步：變性5

′-3

′--3

′-5

′5

′-3

′--3

′-5

′當溫度超過90℃時，雙鏈DNA解聚為單鏈。95℃（3）PCR的過程5

′-3

′--3

′-5

′5

′--3

′-5

′3

′-第2步：復(fù)性

當溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。50℃長度相同但C-G含量高的引物需要設(shè)定的復(fù)性溫度較高（3）PCR的過程5

′--3

′-5

′3

′-第3步：延伸5

′--3

′-5

′3

′-5

′--3

′-5

′3

′-當溫度上升到72℃左右時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。72℃（3）PCR的過程第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)產(chǎn)物。5′--3′3′-5’3′--5′5′--3′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′5′--3′3′--5′（3）PCR的過程5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’常采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來鑒定PCR擴增產(chǎn)物。第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)產(chǎn)物。一個DNA，一對引物（A與B），通過PCR擴增n次：①子代DNA分子數(shù)為：___個②子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為：__個③子代只含有目的基因數(shù)目：_____個④子代DNA分子中含引物A（或B）的DNA分子數(shù)為：______個⑤復(fù)制過程中共需引物_______個⑥第n次復(fù)制需要引物___個2n22n-12n＋1-22n2n-2nPCR擴增DNA規(guī)律歸納思考：PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’聚合酶鏈式反應(yīng)——過程歸納利用PCR獲取和擴增目的基因條件①____：DNA的兩條鏈。②____：分別與模板DNA兩條模板鏈相結(jié)合的兩種小的核酸片段。③原料：含A、T、G、C四種__________。④酶：

酶。⑤其他條件：需要一定的

溶液和能嚴格控制溫度的溫控設(shè)備。模板引物脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合緩沖由于延伸后得到的_____又可以作為下一個循環(huán)的_____，

因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加_____，

即呈_____形式擴增（約為2n，其中n為擴增循環(huán)的次數(shù)）。產(chǎn)物模板一倍指數(shù)聚合酶鏈式反應(yīng)——過程歸納目的基因DNA________后________，____與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合；然后以_________為模板在

作用下進行_____，即將4種___________加到___________，如此重復(fù)循環(huán)多次。受熱變性解為單鏈引物延伸單鏈DNA耐高溫的DNA聚合酶引物的3′端脫氧核苷酸每次循環(huán)一般可以分為_____、_____、_____三步。變性復(fù)性延伸變性：加熱至90℃以上，___________________;

復(fù)性：冷卻至

℃左右，引物與單鏈DNA結(jié)合；延伸：加熱至72℃左右，

從引物起始進行

互補鏈的合成。如此重復(fù)循環(huán)多次。雙鏈DNA解旋為單鏈50耐高溫的DNA聚合酶思考:用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。mRNA雜交雙鏈單鏈DNA雙鏈cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶RNA鏈

DNA鏈

比較項目細胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化邊解旋邊復(fù)制場所主要在細胞核內(nèi)酶解旋酶、DNA聚合酶等溫度細胞內(nèi)溫和條件結(jié)果合成整個DNA分子聯(lián)系①模板:均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②原料:均為四種脫氧核苷酸③酶:均需DNA聚合酶④引物:都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端合成子鏈DNA在高溫下變性解旋全部解旋后再復(fù)制細胞外(主要在PCR擴增儀內(nèi))耐高溫的DNA聚合酶控制溫度，需在不同溫度下進行擴增特定的DNA片段或基因二、基因表達載體的構(gòu)建獲得目的基因后直接轉(zhuǎn)入受體嗎？

不是，游離的DNA片段進入受體細胞，一般會直接被分解，就算可以進行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細胞分裂進行復(fù)制，導(dǎo)致子代細胞不再含有目的基因。基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作。1.基因表達載體的作用①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且遺傳給下一代;②使目的基因在受體細胞中能夠表達和發(fā)揮作用。質(zhì)粒2.基因表達載體的組成標記基因復(fù)制原點終止子限制酶切位點位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點，是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，具有驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄的作用。便于重組DNA的篩選，如抗性基因、熒光標記基因等能夠在受體細胞中自我復(fù)制或整合到受體DNA上供目的基因插入載體中位于基因下游，使轉(zhuǎn)錄在所需的地方停止下來。啟動子目的基因、啟動子、終止子、標記基因、復(fù)制原點等

項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學(xué)成分位置作用DNA片段DNA片段mRNA上三個相鄰堿基mRNA上三個相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出RNA決定轉(zhuǎn)錄的結(jié)束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結(jié)束二、基因表達載體的構(gòu)建3.基因表達載體構(gòu)建的流程相同的限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶切割DNA連接酶目的基因限制酶切割位點獲取目的基因限制酶切割位點質(zhì)粒重組DNA分子限制酶限制酶目的基因與載體的結(jié)合過程，實際上是基因重組的過程。選擇限制酶切割位點的基本原則：①切割目的基因時：

。②切割質(zhì)粒時：

。能切下目的基因且不破壞目的基因至少保留一個完整的標記基因，便于篩選思考分析——單酶切的缺點用同一種限制酶或產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶分別切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段重組質(zhì)粒abcda、b、c、d四個黏性末端相同。限制酶切割DNA連接酶連接啟動子方向目的基因轉(zhuǎn)錄方向思考分析——單酶切的缺點缺點1：在DNA連接酶的作用下，質(zhì)粒自身環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接思考分析——單酶切的缺點缺點2：在DNA連接酶的作用，目的基因自身環(huán)化。abcd限制酶切割DNA連接酶連接DNA連接酶連接思考分析——單酶切的缺點abcd限制酶切割DNA連接酶連接反向連接重組DNA缺點3：在DNA連接酶的作用，目的基因與質(zhì)粒反向連接，造成目的基因不能正確表達。思考分析——雙酶切用兩種限制酶切割質(zhì)粒和含有目的基因的DNA片段重組質(zhì)粒限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd黏性末端a與c相同；黏性末端b與d相同。思考分析——雙酶切限制酶a切割限制酶b切割限制酶a切割限制酶b切割DNA連接酶連接abcd質(zhì)粒不會自身環(huán)化目的基因不會自身環(huán)化優(yōu)點1優(yōu)點2優(yōu)點3目的基因與質(zhì)粒不會發(fā)生反向連接確保目的基因與載體定向連接，減少重組雜物。分別使用兩種限制酶切割目的基因和載體如何選擇限制酶來切割圖甲和圖乙？現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用

獲取一個目的基因需限制酶切割

次,共產(chǎn)生

個游離的磷酸基團。兩4PstⅠ、EcoRⅠ三、將目的基因?qū)胧荏w細胞常用的受體細胞：有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細胞等。導(dǎo)入方法植物細胞：動物細胞：微生物細胞：花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法(感受態(tài)細胞法)由于受體細胞有植物、動物、微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，因此，基因表達載體的構(gòu)建也會有差別。三、將目的基因?qū)胧荏w細胞——植物細胞1.花粉管通道法我國科學(xué)家獨創(chuàng)的一種方法。①可以用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。②可以在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。②當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞，農(nóng)桿菌能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移的DNA)

轉(zhuǎn)移到被侵染的細胞，并將其整合到該細胞的染色體DNA上。采用最多三、將目的基因?qū)胧荏w細胞——植物細胞轉(zhuǎn)化目的基因進入_________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持_____和_____的過程。受體細胞穩(wěn)定表達此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實驗中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實質(zhì)都是基因重組。方法①將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細胞，并再生成植株；②可以將花序直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進行篩選、鑒定等。受體細胞為_______體細胞受體細胞為_______受精卵三、將目的基因?qū)胧荏w細胞——植物細胞Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細胞表現(xiàn)出新性狀的植物將目的基因插入染色體DNA中植物細胞三、將目的基因?qū)胧荏w細胞——植物細胞

__________插入Ti質(zhì)粒的________中形成重組Ti質(zhì)粒重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入_______轉(zhuǎn)化植物細胞目的基因插入植物細胞中的________________上目的基因在植物細胞中穩(wěn)定存在并__________表達目的基因T-DNA農(nóng)桿菌染色體DNA三、將目的基因?qū)胧荏w細胞——植物細胞①兩次拼接第一次拼接：目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)：被插入目的基因的T-DNA拼接到受體

細胞染色體的DNA上。②兩次導(dǎo)入第一次導(dǎo)入：將含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)：含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細胞。

三、將目的基因?qū)胧荏w細胞——動物細胞顯微注射法受精卵注射器固定吸管顯微注射儀將含有目的基因的表達載體提純→顯微注射入動物的受精卵→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物受體細胞：受精卵三、將目的基因?qū)胧荏w細胞——微生物細胞1.原核生物作為受體細胞的優(yōu)點①繁殖快②單細胞③遺傳物質(zhì)少2.導(dǎo)入方法：Ca2+處理法(感受態(tài)細胞法)大腸桿菌感受態(tài)細胞Ca2+混合表達載體緩沖液溶于吸收DNA，完成轉(zhuǎn)化使大腸桿菌處于一種易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)

用CaCl2處理大腸桿菌，增加細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒進入宿主細胞。體細胞不同，將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法也不相同，下列受體細胞與導(dǎo)入方法匹配錯誤的是()選項受體細胞導(dǎo)入方法A棉花細胞花粉管通道法B大腸桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法C羊受精卵顯微注射技術(shù)D枯草桿菌感受態(tài)細胞法B現(xiàn)學(xué)現(xiàn)用受體細胞植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、花粉管通道法顯微注射技術(shù)感受態(tài)細胞法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上↓轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中↓導(dǎo)入植物細胞↓整合到受體細胞的DNA上