T-SPPHN 002-2024 十字花科蔬菜病毒病綜合防控技術(shù)規(guī)程

ICS01.040.65CCSB15/19CodeofPreventionTechnologyoftheCruciferaeVegetableViralDiseases湖南省植物保護學會發(fā)布I本文件是根據(jù)GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由湖南省植物保護學會提出。本文件由湖南省植物保護學會歸口。本文件起草單位為湖南省植物保護研究所、全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務中心、山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所、云南農(nóng)業(yè)大學、江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所、中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所。本文件主要起草人：劉勇、張德詠、燕飛、張松柏、劉慧、李方方、史曉斌、李凡、吳元華、何自福、張卓、季英華。1十字花科蔬菜病毒病綜合防控技術(shù)規(guī)程本標準規(guī)定了蔬菜十字花科病毒病的術(shù)語和定義、發(fā)生流行規(guī)律、病害診斷、防治原則、防治方法、統(tǒng)防統(tǒng)治、防控檔案等技術(shù)要求。本標準適用于大白菜、蘿卜、油菜、卷心菜等十字花科蔬菜病毒病的綜合防控。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4285GB8321NY/T393農(nóng)藥安全使用標準農(nóng)藥合理使用準則綠色食品農(nóng)藥使用準則3術(shù)語和定義GB/T35333和界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。下列術(shù)語和定義適用于本標準。3.1綜合防控技術(shù)Syntheticalpreventioncontroltechnology是在“預防為主、綜合防治”的植保方針基礎(chǔ)上，以確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境安全為目標，以減少農(nóng)藥使用為目的，優(yōu)先采取生態(tài)調(diào)控、生物防治、物理防治和科學用藥等資源節(jié)約型、環(huán)境友好型技術(shù)來控制農(nóng)作物病蟲害的植物保護措施。3.2十字花科蔬菜Cruciferaevegetables茄科蔬菜主要包括大白菜、蘿卜、油菜、卷心菜等蔬菜。3.3病毒病virusdisease即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、專一性或廣譜性等。植物病原病毒一般活體寄生，但某些病毒亦可在發(fā)病植株殘體中長期存活；病毒在植物體內(nèi)進行核酸（RNA或DNA）和蛋白外殼復制并組成新病毒粒子，粒子在植物維管束中迅速移動致使植物周身感染并發(fā)病。24發(fā)生流行規(guī)律十字花科蔬菜病毒病主要由蕪菁花葉病毒（Turnipmosaicvirus，TuMV）引起、其次由黃瓜花葉病毒（Cumbermosaicvirus，CMV）和煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）等病毒引起。TuMV和CMV均可由蚜蟲和汁液接觸傳染，而TMV主要是靠汁液接觸傳染。4.1接觸傳染病毒病流行規(guī)律病毒病由液汁接觸和傳毒害蟲傳播為主，整枝，打叉，搭架，采果等農(nóng)事活動中，只要造成寄主微創(chuàng)口，即可侵入危害，病毒可在多種植物上越冬，病殘體、帶毒種子均可成為病毒病的初侵染源，此外，土壤瘠薄、黏重、板結(jié)、排水不良和偏施氮肥都會加重病情發(fā)展。4.2蟲傳病毒病流行規(guī)律在北方，十字花科蔬菜病毒病的毒源可在冬季十字花科蔬菜、棚室十字花科蔬菜和野生十字花科植物上越冬。冬季不種十字花科蔬菜的地區(qū)，病毒主要在窖藏的大白菜、甘藍、蘿卜留種株、田間宿根植物或越冬野菜上越冬。在南方，由于終年長有上述十字花科植物，則無明顯越冬現(xiàn)象。感病的十字花科蔬菜、田間野生十字花科雜草都是重要初侵染源，春季通過有翅蚜蟲遷飛傳播擴散蔓延，全年均可發(fā)病，但以春、秋季節(jié)發(fā)病造成的損失最為嚴重，尤其是秋季，整個的病毒年侵染循環(huán)中，蚜蟲起著非常重要的作用。5病害診斷5.1病害田間診斷大白菜病毒病在大白菜生長的幼苗期和成株期均可染病，但不同時期受侵染后，發(fā)病程度有所差異，侵染越早，發(fā)病越重。大白菜受病毒病侵染后會表現(xiàn)各種癥狀，幼苗期受害后，會出現(xiàn)沿葉脈褪綠，花葉及皺縮，有的有壞死斑，至成株期還可表現(xiàn)孤丁、抽風、不能包心、結(jié)球，葉片扭曲畸形、質(zhì)脆、植株矮化（參見附錄A）。蘿卜感病后，多整株發(fā)病呈現(xiàn)各種癥狀（參見附錄A），葉片出現(xiàn)葉色不均勻，深綠和淺綠相間，花葉，濃綠部分常突起呈皰狀，皺縮，有時畸形，有的顯現(xiàn)為淡綠色至黃綠色花葉，有的葉片扭曲、蕨葉，外圍的老葉變黃，葉面皺縮變形，重病株矮化。油菜染病后，從心葉發(fā)病，產(chǎn)生沿葉脈兩側(cè)裉綠，葉片呈黃綠相間的花葉，明脈或葉脈呈半透明狀，嚴重時葉片皺縮卷曲或畸形，花葉狀皺縮，整株矮縮，老葉片上出現(xiàn)壞死斑（參見附錄A）。5.2生物學檢測用于生物學檢測病毒的常用鑒別寄主植物有心葉煙、三生煙、本氏煙、莧色藜、矮牽牛等。采用摩擦接種的方法對病毒進行接種培養(yǎng)。具體方法和檢測結(jié)果見附錄B.1。5.3分子生物學檢測3采用硅粒吸附法提取植物總RNA。以硅粒吸附法提取的總RNA為模板，選取隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄（RT），轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，使用Alpha凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。擴增片段與預期目標條帶大小一致，則為陽性樣品，表明植物葉片中攜帶該病毒見附錄B.3。6防治原則根據(jù)十字花科蔬菜病毒病和傳毒害蟲的發(fā)生規(guī)律及危害特點，本著“預防為主，綜合防治”的指導思想，從農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)整體出發(fā)，保護生物多樣性，控制生產(chǎn)環(huán)境，減少病毒來源，具體以農(nóng)業(yè)防治、物理防治、生物防治為主，選用抗病品種、種子脫毒、培育無毒種苗、清潔田園、減少田間寄主的存在等措施，降低病蟲害暴發(fā)幾率，積極保護利用自然天敵，惡化病蟲的生存條件，提高農(nóng)作物抗蟲能力，盡量減少化學農(nóng)藥的使用，當農(nóng)業(yè)防治、物理防治、生物防治防治病蟲害無法控制在經(jīng)濟閥值以下時，輔以高效、低毒、低殘留和低污染的農(nóng)藥，將病蟲危害損失降到最低限度。7防治方法7.1種植抗病品種抗病品種是十字花科蔬菜病毒病防控的基礎(chǔ)，各地應因地制宜選擇適宜當?shù)胤N植的優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆性強、商品性好的，且與栽培季節(jié)和栽培方式相適宜的優(yōu)良品種。一般葉色深綠，幫色深綠的較白幫的抗病。7.2選種及種子消毒7.2.1選種無病株留種：選留采種株時，要嚴格挑選，在采種田淘汰病株，減少毒源，從無病優(yōu)質(zhì)的良種株上采集種子。7.2.2種子消毒先用清水浸泡種子3-4h，再放入10%磷酸三鈉溶液中浸20-30min，撈出洗凈后催芽；或?qū)⒏煞N子放入70℃的恒溫箱中，干熱處理72h，經(jīng)檢查發(fā)芽率正常后備用。7.3農(nóng)業(yè)防治7.3.1合理間、套、輪作盡量不與十字花科作物鄰作，與早、中甘藍地保持一定距離。選用空茬地或倒茬地，合理輪作，避免十字花科作物重茬栽培，實行2-3年的輪作。前茬以蔥、蒜茬為好，因其含有相當數(shù)量的辛辣素，具一定殺菌或抑菌作用，可減少病害的發(fā)生，還可選擇前茬種植豆類、瓜類等的田塊。7.3.2適期播種不要播種過早，使幼苗期避開高溫干旱氣候，播種過早，正值高溫干旱，不利于幼苗生長，植株抗病力弱利于病毒病的發(fā)生。47.3.3清潔田園，加強管理一茬白菜、蘿卜或甘藍等蔬菜收獲后，很多病菌附著于殘葉上，應徹底清除這些田間殘枝敗葉及殘根，平常也應及時清除田間及周圍的十字花科雜草。注意防病，及時拔除病株，接觸過病株的手和工具，要及時用肥皂水或磷酸三鈉水溶液沖洗。7.3.4水肥管理苗期不能缺水，“三水齊苗、五水定棵”，以小水勤灌為宜，即播后澆第1次水，幼苗出土時澆第2次水，幼苗出齊后澆第3次水，4-5片真葉時澆第4次水，7-8片真葉時澆第5次水，這樣可促進壯苗，增強苗期抗逆性，同時又可防止地溫升高，是防治病毒病的有效措施。如遇到雨天，還要及時排水防澇。要施足充分腐熟的優(yōu)質(zhì)有機肥、增施磷、鉀肥，少量多次追施N肥、及時蹲苗，促進幼苗生長，增強植株抗病能力。7.4物理防治7.4.1銀灰膜避蟲根據(jù)蚜蟲對銀色的忌避性，在蚜蟲發(fā)生期，苗床及菜田采用銀色反光膜驅(qū)蚜。每畝（30~40）條。7.4.2色板誘殺利用蚜蟲對黃色或綠色有較強趨性的特性，在田間放置30cm×40cm的誘蟲黃板或綠板300塊/hm2，減少菜苗上的蚜量。將黃板或綠板呈棋盤式均勻插置田間，黃板或綠板底部略高出植株頂端20cm左右，黃板或綠板粘滿害蟲后及時更換。7.5農(nóng)藥防治在上述措施無法控制在病毒病和傳毒害蟲經(jīng)濟閥值以下，且病毒病和傳毒害蟲出現(xiàn)大面積爆發(fā)時，采用農(nóng)藥防治。農(nóng)藥使用應符合國家綠色食品農(nóng)藥使用準則。7.5.1農(nóng)藥防治病毒病病毒病均以防為主，可在發(fā)病初期使用高效、低毒、低殘留農(nóng)藥進行防治。注意，由于十字花科蔬菜生育期普遍較短，一般只有30-50天，因此采收之前7-10天，必須停止用藥。防治病毒病常用藥劑的用量及用法見附錄C。7.5.2農(nóng)藥防治蚜蟲當田間有蟲率（5~15）%時開始用藥，優(yōu)先采用植物源農(nóng)藥，嚴禁使用禁毒農(nóng)藥或高毒農(nóng)藥，防治蚜蟲常用藥劑的用量及用法見附錄C。8深化病蟲測報，確保統(tǒng)防統(tǒng)治根據(jù)田間調(diào)查情況結(jié)合氣象因素分析，及時對病蟲害進行預測預報，當病蟲害達到影響經(jīng)濟閥值時，當?shù)卣畱M織種植戶對整片作物進行科學的病蟲害防治。59建立防控檔案在田間調(diào)查十字花科病毒病發(fā)生情況時，具體調(diào)查內(nèi)容見附錄D。6附錄A（資料性附錄）十字花科作物病毒病癥狀大白菜病毒病在大白菜生長的幼苗期和成株期均可染病，但不同時期受侵染后，發(fā)病程度有所差異，侵染越早，發(fā)病越重。大白菜受病毒病侵染后會表現(xiàn)各種癥狀，幼苗期受害后，會出現(xiàn)沿葉脈褪綠，花葉及皺縮，有的有壞死斑，至成株期還可表現(xiàn)孤丁、抽風、不能包心、結(jié)球，葉片扭曲畸形、質(zhì)脆、植株矮化（參見附錄A）。A1辣椒病毒病為害癥狀蘿卜感病后，多整株發(fā)病呈現(xiàn)各種癥狀（參見附錄A），葉片出現(xiàn)葉色不均勻，深綠和淺綠相間，花葉，濃綠部分常突起呈皰狀，皺縮，有時畸形，有的顯現(xiàn)為淡綠色至黃綠色花葉，有的葉片扭曲、蕨葉，外圍的老葉變黃，葉面皺縮變形，重病株矮化。A2蘿卜病毒病為害癥狀油菜染病后，從心葉發(fā)病，產(chǎn)生沿葉脈兩側(cè)裉綠，葉片呈黃綠相間的花葉，明脈或葉脈呈半透明狀，嚴重時葉片皺縮卷曲或畸形，花葉狀皺縮，整株矮縮，老葉片上出現(xiàn)壞死斑（參見附錄A）。A3油菜病毒病為害癥狀7（規(guī)范性附錄）病毒病檢測方法B.1病毒生物學檢測B.1.1病毒摩擦接種方法目撒到待接種葉的表面（也可直接將金剛砂加在研磨液中），在營養(yǎng)缽內(nèi)插上標簽，注明處理及時間；用手指或研棒、棉球和紗布蘸取少許汁液，在待接種葉面上輕輕均勻地涂擦，沿一個方向抹，一般沿從葉基到葉尖方向，涂擦時用另一只手指托住葉片，注意用手涂擦前需用肥皂洗凈手指；用清水沖洗接過種的葉片，將植株放于溫室（最好22~25℃)。用緩沖液接種植株作對照；接種后的純化，將帶毒葉片用接種緩沖液研磨后采用摩擦汁液接種的方法接種于枯斑寄主上，待枯斑寄主表現(xiàn)單斑后，將單個斑點剪下，用接種緩沖液研磨再次接種至枯斑寄主，出現(xiàn)單斑癥狀后再次取下單斑接種于枯斑寄主，出現(xiàn)斑點后再取單個斑點接種于系統(tǒng)寄主，出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀后再取葉片進行保存和檢測。B.1.2病毒的保存將經(jīng)過三次單斑純化后毒源，再次接種至系統(tǒng)寄主上，待其出現(xiàn)系統(tǒng)癥狀后，取發(fā)病葉片使用冷凍干燥的方法處理后，寫明標簽，存于-80℃冰箱。將經(jīng)分離純化后得到的不同病毒的病毒分離物分別接種至病毒敏感植物上，觀察其癥狀(見圖B1、圖B2、圖B3)。圖B1CMV分離物接種至莧色藜上的癥狀（a）：枯斑；接種至心葉煙上的癥狀（b）：系統(tǒng)花葉。圖B2TMV分離物接種至心葉煙上的癥狀（a）：枯斑；接種至三生煙上的癥狀（b）：系統(tǒng)花葉。8B.2分子生物學檢測B.2.1GB溶液4.0M0.2M25mM1M2.5%（W/V）異硫氰酸胍NaAc（pH5.2）EDTA(pH8.0)KAcPVP-40B.2.210%NLS將1g月桂酰醇（NLS）溶于10mL水中即得10%NLS溶液。B.2.3WB溶液1mMEDTA(pH8.0)20mMTris-HCl(pH7.5)10mMNaClB.2.4NaI溶液6MNaI0.15MNa2SO3B.2.5硅溶液將60g二氧化硅溶于500mL水中，靜置24h，倒掉470mL上清，再加水至500mL，靜置5h，倒掉440mL上清，用HCl將剩下的60mL沉淀調(diào)pH值至2.0，高壓滅菌后，200μL/管分裝，-20℃保存。B.2.6模板RNA的制備采用硅粒吸附法提取植物總RNA。取病葉0.1g，加3mLGB溶液，研磨至勻漿；取500μL研磨液，加100μLNLS，70℃溫育10min，不時上下顛倒混勻，冰上放置5min，13000rpm/min離心10min；取300μL上清，加150μL無水乙醇，300μLNaI，25μL硅溶液，混勻，溫室下不停顛倒混勻10min；6000rpm/min離心1min，倒去上清；加500μL洗滌液（WB:無水乙醇=1:1）洗滌，6000rpm/min離心1min，倒掉上清，重復該步驟；沉淀加ddH2O150μL,70℃溫育4min，1min后將離心管蓋打開，隨即蓋上；13000rpm/min離心3min，取上清，-20℃保存。B.2.7RT-PCR擴增B.2.7.1反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自全式金，以硅粒吸附法提取的總RNA為模板，選取隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄（RT轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈具體反應體系及步驟見表B1。表B1病毒反轉(zhuǎn)錄體系試劑體積TotalRNARandomPrimer2×TSReactionMixRIEnzymeMixgDNARemover總體積20μL上述混合液25℃孵育10min，42℃孵育30min，85℃加熱5min，-20℃保存。B.2.7.2反應引物TuMV、CMV、TMV的特異性RT-PCR引物見表B2。表B2TuMV、CMV、TMV的特異性RT-PCR引物病毒名稱（前引/后引）引物序列片段長度TuMVTuMV-FTAAACGGAATGTGGGTGATGATGG333bpTuMV-RGTCCTCGGTCGTATGCCTTTCCCMVCMV-FATGGACAAATCTGRATCWMCC764bpCMV-RCTGGATGGACAACCCGTTCTMVTMV-FCGGTCAGTGCCGAACAAGAA690bpTMV-RATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT(K=G或T；W=A或T；V=A，C或G；S=G或C；Y=C或T；R=A或G；B=G，C或T)B.2.7.3反應體系TuMV、CMV、TMV的特異性RT-PCR引物反應體系見表B3表B3CMV、TMV特異性RT-PCR引物反應體系試劑體積10×Buffer2.0μL2.5mMdNTP前引后引酶0.3μLcDNA加水定容至20μLB.2.7.4反應程序TuMV、CMV、TMV的特異性RT-PCR反應程序見表B4表B4CMV、TMV的特異性RT-PCR反應程序病毒名稱反應程序TuMVCMVTMVB.2.7.5瓊脂糖凝膠電泳1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5μL擴增反應物與2mLSYBR