實驗動物分類及質(zhì)量控制

實驗動物分類及質(zhì)量控制第一節(jié)實驗動物的分類生物學分類遺傳學分類微生物學分類1.實驗動物生物學分類不同動物門的概況原生動物門：最低等的單細胞動物。草履蟲、變形蟲等海綿動物門：最低等的多細胞動物。腔腸動物門：水螅等。扁形動物門：多數(shù)為寄生蟲。絳蟲、血吸蟲等線形動物門：多寄生于動物和人體內(nèi)?；紫x、鉤蟲等。環(huán)節(jié)動物門：有真體腔的多細胞動物。蚯蚓、水蛭等。軟體動物門：烏賊（骨板）等。節(jié)肢動物門：昆蟲綱動物最多。蒼蠅、蚊子等。棘皮動物門：海星，海膽等。元索動物門：文昌魚。脊椎動物門：進化上最高等的一門動物。哺乳綱最高等，多數(shù)實驗動物選自此綱。常用哺乳綱實驗用動物的分類位置目的名稱實驗用動物種類單孔目Monotremata有袋目Marsupialia貧齒目Edentata食蟲目Insectivora翼手目Chiroptera靈長目Primates兔形目Lagomorpha嚙齒目Rodentia

鯨目Cetacea食肉目Carnivora鰭足目Pinnipedia長鼻目Proboscidea海牛目Sirenia奇蹄目Perissodactyla偶蹄目Artiodactyla至今無袋鼠犰狳、穿山甲刺猬蝙蝠獼猴、松鼠猴、狨猴、黑猩猩兔、鼠兔小鼠、大鼠、金黃地鼠、豚鼠、沙鼠、黑線姬鼠、田鼠江豚貓、犬、雪貂海狗至今無至今無馬、驢、騾豬、羊、牛、鹿2.實驗動物遺傳學分類在生物分類學上，動物“種”是動物分類的基本單位，是自然選擇形成；一般情況下，同種動物交配能順利繁殖后代，而異種動物存在生殖隔離。各種實驗動物經(jīng)過人類的長期馴化、培育和選擇，已與其祖先有著極顯著的差異?；靖拍?---種Species基本概念----品種Stock品種是種以下的非自然的單位，是人為選擇的產(chǎn)物。人類根據(jù)不同需要把動物的外形和生物學特性進行改良，選擇和定向培育，使之具備某些生物學特性，這些特性能穩(wěn)定遺傳，就把同種動物中具有不同遺傳特性的動物分為不同的品種。KM小鼠是封閉群小鼠中的一個品種，屬我國常用的實驗小鼠，1994年列入國際實驗動物理事會出版的實驗小鼠目錄?；靖拍?---品系Strain品系是根據(jù)不同的實驗目的，采用近親交配方式繁殖，且遺傳背景明確的動物。作為一個品系，必須具備獨特的生物學特性，相似的外貌和穩(wěn)定的遺傳特性。如C57BL/6小鼠是近交系小鼠中的一個品系，屬低癌，高補體活性的小鼠；全身黑色被毛；其生物學特性穩(wěn)定地代代相傳。因此，品種和品系是實驗動物分類的基本單位。實驗動物遺傳學分類近交系InbredStrain突變系Mutantstrain重組近交系Recombinantinbredstrain重組同類系Recombinantcongenicstrain封閉群Outbredcolony雜交群動物Hybridanimal近交系

InbredStrain近交系動物的概念經(jīng)至少連續(xù)20代的全同胞兄妹交配培育而成，品系內(nèi)所有個體都可追溯到起源于第20代或以后代數(shù)的一對共同祖先，該品系稱為近交系（InbredStrain）。經(jīng)連續(xù)20代以上親代與子代的交配，與全同胞兄妹的交配有同等效果。近交系數(shù)應大于99％。近交系數(shù)（CoefficientofInbreeding,F）動物個體的基因組成中純合子在基因的出現(xiàn)率。后代個體基因位點固定同一祖先基因的比率。犬和貓連續(xù)全同胞兄妹交配20代，需要20年左右的時間；

雞和兔也要花費較長時間。體型較大動物的近交系培育很難獲得成功；因為成功率低，往往成為經(jīng)濟上的沉重負擔。通常禽類和兔類等實驗動物的血緣系數(shù)達到80％以上時(相當于親兄妹交配4代)，即可稱為近交系。目前已培育出兔、犬、貓、雞、羊、豬等的若干近交品系。血緣系數(shù)（CoefficientofRelationship，R）兩個個體間的遺傳學相似性。無血緣關系雙親的同胞間血緣系數(shù)是50%。親同胞交配近交系數(shù)和血緣系數(shù)的上升世代近交系數(shù)血緣系數(shù)世代近交系數(shù)血緣系數(shù)00%50%1190.0%97.0%125.060.01292.597.6237.572.71394.098.1350.079.21495.198.5459.484.31596.198.8567.287.91696.899.0673.490.51797.499.2778.592.61897.999.3882.694.11998.399.5985.995.32098.699.61088.696.3近交系動物的命名

一般以大寫英文字母命名，亦可以用大寫英文字母加阿拉伯數(shù)字命名，符號應盡量簡短。如A系，TA1系等。

非正規(guī)的命名，如以為人知，則可保留沿用。129615等C3hC3HC3HBalb/c,129,A,C57BL/6亞系（Substrain）：一個近交系內(nèi)各個分支的動物之間存在有遺傳差異，即稱該近交系出現(xiàn)了亞系。亞系的命名是在原品系的名稱后加“/”，后標注亞系符號：加數(shù)字C57BL/6,C57BL/10培育或生產(chǎn)單位或個人的英文縮寫：A/HeCBA/J一個保持者同時保持一個近交系2個以上亞系：C57BL/6J,C57BL/10J命名法出現(xiàn)前，已為人們熟知的近交系，保留原部規(guī)范的表示方法：BALB/c，C57BR/cd。支系（Subline）：近交系或亞系經(jīng)人工技術處置后，則稱為支系。胚胎移植e乳母代乳f人工飼喂h卵巢移植o人工飼喂結合乳母代乳fh胚胎冷凍p近交系的遺傳學特性優(yōu)點1.基因純合性

經(jīng)過連續(xù)20代以上的近親繁殖,近交品系個體基因已有98.6%以上純合；品系內(nèi)任何二個動物交配所產(chǎn)生的后代，也應是純合子。因此，同一近交系動物的基因是一致的，沒有暗藏的隱性基因。2.同基因性

同一個近交品系中所有個體在遺傳上是同源的，個體間極為相似，具有基本相同的遺傳組成和遺傳特點，也就是基因型相同。因此，同品系個體間可進行組織或腫瘤移植，也可用一只動物檢測該品系的基因型。3.表現(xiàn)型的均一性同一近交系動物，在相同環(huán)境因素的作用下，由于同基因性，其表現(xiàn)型是均一的，如血型、組織型、體重、毛色、可遺傳疾病的發(fā)病率、對藥物的反應、甚至行為類型等。因此,使用較少量的近交系動物可達到生物統(tǒng)計需要的精密度。4.遺傳穩(wěn)定性近交系動物的基因高度純合，堅持近親交配則增加其在特定部位純合子，減少了遺傳變異，使動物的基因型可長期處于穩(wěn)定狀態(tài)，導致近交系動物長期遺傳穩(wěn)定性。近交系動物的遺傳變異僅發(fā)生在少量殘留雜合基因，或基因的突變，而這種機率非常低。5.個體性每個品系在遺傳上都是獨特的，有些品系可能發(fā)生一些疾病，成為研究人類疾病理想的模型。有些情況品系間的差別顯示在量上，而不是在質(zhì)上，在研究上非常有用?？稍诒姸嗟慕幌抵?，篩選出對某些因子敏感，和不敏感的品系，以達到不同的研究目的。6.分布廣泛性近交系動物個體具備品系的全能性，任何個體均可攜帶該品系全部基因庫，引種僅需1-2對動物。不少近交系動物已分布在世界各地，意味著：不同地區(qū)，不同國家的科學家有可能重復或驗證已取得的理論和數(shù)據(jù)。7.背景資料和數(shù)據(jù)較完整近交系動物在培育和保種過程中都有詳細記錄，一些常用品系具有相當數(shù)量的背景資料；有大量文獻記載了各種品系的生物學特性。這些有關品系的特征、壽命和自發(fā)性疾病等資料，對今后的研究工作的設計和動物實驗結果的解釋提供便利條件。8.可分辨性

每個近交系都有自己獨特的生化標志基因。研究者在掌握了遺傳質(zhì)量監(jiān)測方法后，通過建立品系的遺傳概貌，和定期的遺傳檢測，可以分辨混雜在一起的兩個，或兩以上外貌近似的品系動物。固定基因時，有害的隱性基因也會純合，出現(xiàn)不利的性狀而造成育種失??；近交還可能導致多基因之間喪失平衡，從而使高度純化的動物對不良環(huán)境的調(diào)節(jié)適應能力降低；近交使動物失去為保持足夠生物適合度所必需的最低水平的基因雜合性，從而影響動物生長率，壽命，對疾病的感受性，生活力，體力及繁殖能力。近親交配的弊端近交系的應用鑒于近交系動物具備上述特性，其應用首推遺傳學研究，可消除雜合遺傳背景的影響，以較少的動物取得較一致的動物實驗結果。近交系的應用

其次，近交系動物在腫瘤研究工作中應用最廣泛，被培養(yǎng)的品系也最多；對腫瘤的病因?qū)W、發(fā)病學、實驗治療和新抗癌藥物的研究等都作出重大貢獻。近交系的應用

隨著生物醫(yī)學科學研究的發(fā)展，已培育成功各種人類疾病的動物模型，如：高血壓大鼠、癲癇大鼠糖尿病小鼠、白血病小鼠，白內(nèi)障小鼠、先天性肌萎縮小鼠、免疫缺陷型小鼠等等。這些近交系動物家系清楚，取材方便，是進行基因連鎖分析比較理想的實驗材料。近交系的應用

在某些涉及組織細胞或腫瘤異種移植的實驗中，個體間組織相容性一致與否，是實驗成敗的關鍵。因此，近交系動物成為不可缺少的實驗動物。近交系動物的保種目前最廣泛采用的是建立全同胞親兄妹交配核心群保持過程中的技術問題選擇與淘汰近交系動物培育的交配方式全同胞兄妹交配純交：2個純合子交配互交：2個雜合子交配回交：父女或母子交配近交系保種中的基本概念基礎群（核心群）：以品系保種為目的的動物群稱為基礎群，也叫核心群。譜系擴大群：核心群中非留種的動物及其后代，當核心群發(fā)生意外可能斷種時，向核心群導入做種。生產(chǎn)群：來源于譜系擴大群的后代，隨機交配，不超過4個世代。近交系的保種方法

1.平行法：繁殖群進行平行線式，即每代每對各留1對動物。容易形成亞系。2.單線法：設4-6個雌雄同居組，其中一個是其他3-5組已交配動物的雙親，可避免亞系形成，容易斷種。3.優(yōu)選法：每代設來自同一親本的2-3個雌雄交配組，每個交配組與其2-3對子代作為一個家系，在2-3個家系間挑選繁殖和健康較好的家系作為種群，其余家系作生產(chǎn)群或供作實驗。該法可擴大繁殖，避免亞系，選擇比較合理。近交系保種的注意事項連續(xù)進行近親交配的必要性。通常同時保持2-3個世代。保持單線譜系。盡可能作詳細記錄并加以保存。避免計劃外雜交。近交系動物的生產(chǎn)少量生產(chǎn)核心群內(nèi)得到大量生產(chǎn)紅綠燈制突變系

Mutantstrain突變系動物的定義是指保持有特殊的突變基因的品系動物，也就是正常染色體的基因發(fā)生了變異，具有各種遺傳缺陷的品系動物。生物在長期繁殖過程中，子代發(fā)生變異，其變異的遺傳基因等位點可遺傳下去，或即使沒有明確的遺傳基因等位點，但經(jīng)過淘汰和選拔后，仍能維持穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)，這種變化了的能保持遺傳//特性的品系，稱為變品系。常用突變系肌肉萎縮癥dy肥胖癥ob侏儒癥dw糖尿病db現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)小鼠突變基因893個，兔76個，大鼠105個，豚鼠38個。與人類疾病相類似的突變型動物已用作動物模型進行研究。重組近交系

Recombinantinbredstrain重組近交系—定義以兩個無關的高度近交品系進行交配，產(chǎn)生F2代后，再行全同胞交配達20代以上而育成的一個近交系。該品系動物既具有其雙親品系的特性，又具有重組后一組內(nèi)和每個重組近交系的特性。重組近交系已廣泛應用于新的多態(tài)性基因位點和新的組織相容性位點的鑒定、多態(tài)性位點的多效性及其連鎖性的研究；還用于動物壽命、自發(fā)性和誘發(fā)性疾病的研究；以及生理學、藥理學、形態(tài)學和行為學等方面的研究。重組近交系的命名由兩個親代近交系的縮寫名稱中間加大寫英文字母X命名。由相同雙親交配育成的一組近交系用阿拉伯數(shù)字予以區(qū)分。如：由BALB/c與C57BL/6雜交育成的一組近交系分別命名為CXB1、CXB2……。重組同類系

Recombinantcongenicstrain重組同類系—定義由兩個近交系雜交后，子代與兩個親代中的一個近交系進行數(shù)次回交（通常回交2次），再經(jīng)無特殊基因選擇的近親交配而育成的近交系。重組同類系的命名由兩個親代近交系的縮寫名稱中間加小寫英文字母c命名，其中用作回交的親代近交系（稱受體近交系）在前，供體近交系在后。由相同雙親育成的一組同類系用阿拉伯數(shù)字予以區(qū)分。如：由BALB/c為受體近交系，以STS為供體近交系（S），經(jīng)2代回交育成的一組重組同類系分別命名為CcS1、CcS2…。同源導入近交系

congenicinbredstrain通過雜交-互交或回交等方式將一個基因?qū)氲浇幌抵?，由此形成的一個新的近交系與原來的近交系只是在一個很小的染色體片段上的基因不同，稱為同源導入近交系。封閉群(遠交群)

Closedcolonyor

Outbredstock封閉群動物的概念以非近交交配方式進行繁殖生產(chǎn)的一個實驗動物種群，5年以上不從其外部引入新個體的條件下，至少連續(xù)繁殖4代以上，稱為一個封閉群，或叫遠交群。引種于某親本或同源親本的動物，讓其不以近交形式，也不與群外動物雜交而繁衍的動物群，目的是要求整個群體盡量防止近親交配而保持遺傳變異，也就是說，既保持群體的一般特性，又保持動物的雜合性。封閉群可分為起源于近交系,但并不進行全同胞交配的維持群和起源于非近交系,亦不進行全同胞交配的維持群例如ddN小鼠，Wistar大鼠、我國各研究單位長期自行繁殖的KM小鼠、青紫蘭兔、新西蘭白兔、大耳白兔等均屬此類。封閉群動物的命名封閉群由2-4個大寫英文字母命名，種群名稱前標明保持者的英文縮寫名稱，第一個字母須大寫，后面的字母小寫，一般不超過4個字母。保持者與種群名稱之間用冒號分開。如：N：NIH表示美國國立衛(wèi)生研究院（N）保持的NIH封閉群小鼠。Ssmu:KM表示上海第二醫(yī)科大學保持的KM封閉群小鼠。封閉群動物的遺傳學特性及應用對于封閉群的研究，無論在理論上還是實踐上，無論在國內(nèi)還是國外，都落后于近交系。其原因在于封閉群是屬于群體遺傳理論范疇，不僅群體遺傳學本身產(chǎn)生較晚，而且該理論又不能機械地套用于封閉群。至今，對封閉群動物的研究工作幾乎都局限于實驗小鼠和大鼠，且資料也甚少。1.基因庫大，雜合率高封閉群是一種長期與外界隔離，雌雄個體間能夠隨機交配的動物群，其遺傳組成比較接近自然狀態(tài)下的動物群體結構，具有類似于人類群體遺傳異質(zhì)性的遺傳組成。其基因的雜合率較高，個體間的基因型不一致，因此，群體基因庫較近交系大。2.群體基因頻率基本保持穩(wěn)定封閉群動物不從其外部引入新基因，又堅持隨機交配，從而使群體在一定范圍內(nèi)保持相對穩(wěn)定的遺傳特征。群體基因頻率可達到哈臺—溫伯格平衡。3.封閉群內(nèi)個體間差異程度

主要取決于其祖代起源若封閉群祖代起源于同一個近交系動物，其個體遺傳差異較小。若起源于非近交系的一般封閉群，個體間差異較大，且可攜帶隱形的有害基因，或致死基因，易于誘發(fā)突變。封閉群動物的遺傳組成具有很高的雜合性其繁殖力和生活力較強

表現(xiàn)為平均胎產(chǎn)仔數(shù)多，胎間隔短，仔鼠離乳率高，生長快，成熟早，抗病力強，壽命長；生產(chǎn)成本低，可大量供應廣泛用于各種預試驗、學生教學和常規(guī)的藥物篩選和毒性試驗中。封閉群動物的保持和生產(chǎn)隨機繁殖法分組循環(huán)法最大限度避免近交法雜交群動物

Hybridanimal雜交群動物—定義也稱雜交一代或系統(tǒng)雜交動物。是指兩個近交品系動物之間進行有計劃交配所獲得的第一代動物，簡稱F1動物。由于親本本身是純合的，F(xiàn)1個體間雖然是雜合的，但是雜合的比較均一。F1的優(yōu)點具有雜交優(yōu)勢、生命力強、適應性和抗病力強、繁殖旺盛。具有純系動物疾病相似的遺傳均質(zhì)性。雖然不是純合子，但基因型是整齊一致的，遺傳性是穩(wěn)定的，表現(xiàn)型也一致。對各種實驗結果重復性好。具有親代雙親的特點。國際上分布廣，實驗結果便于在國際上進行重復和交流。第二節(jié)實驗動物

遺傳學質(zhì)量控制隨著生物醫(yī)學科研的發(fā)展及其需要，目前已培育成功數(shù)百種近交品系和封閉群動物，加上不同的亞系和新建的突變?nèi)海浞N（品系）數(shù)量愈千。在各單位的實驗動物飼育繁殖部門，一般都保持幾個或幾十近交系。多個品系動物生產(chǎn)繁殖過程中，無法確保絕對不發(fā)生計劃外雜交。有必要進行實驗動物的遺傳質(zhì)量控制

科研人員都希望證明各自所得到的品系動物的遺傳背景是符合標準的；

生產(chǎn)繁殖部門希望確證：所提供的實驗動物符合遺傳控制的質(zhì)量。當今，人類已步入21世紀生命科學新時代，世界范圍內(nèi)蓬勃發(fā)展新技術革命。隨著各種新技術，新檢測方法的建立，可用于實驗動物遺傳質(zhì)量檢測的新技術也越來越多。

國際實驗動物理事會提出了實驗動物質(zhì)量檢測必須符合“4E原則”。準確

Exact簡便Easy

有效Efficient

經(jīng)濟Economic目前常用的檢測方法生化標志基因位點檢測免疫學技術檢測：皮膚移植形態(tài)學分析下頜骨測量、毛色基因測試。染色體帶型檢測分子生物學標記技術檢測法生化標記檢測法不同近交系有相當多的同工酶同種異構蛋白具有多態(tài)性生化標記檢測具有很高的靈敏性，它能證實近交系和確定亞系間的遺傳關系，具有較高的應用價值。方法簡便快速、比較經(jīng)濟，但精確度不高。

在實驗動物國家標準《哺乳類實驗動物的遺傳質(zhì)量控制》（GB14923-2010）

對近交系小鼠選擇位于10條染色體上的14個生化位點作為生化標記檢測

對近交系大鼠選擇位于6條染色體上11個生化位點作為生化標記檢測。

在實驗動物國家標準《哺乳類實驗動物的遺傳質(zhì)量控制》（GB14923-2010）中規(guī)定：對基礎群，凡在子代留有種鼠的親本動物都應進行檢測；對生產(chǎn)群動物每年至少進行一次遺傳質(zhì)量檢測，每次應采樣≥6只。

免疫學檢測-皮膚移植

實驗證明動物具有接受或排斥所植皮膚的能力。每個近交系的全部個體在遺傳上高度純合，所以，同品系的個體間能互相接受皮膚移植；而不同品系的個體間植皮就會互相排斥。

皮膚移植也是的常用的遺傳質(zhì)量檢測方法，在國家推薦標準（GB/T14927.2-2001）《實驗動物近交系小鼠/大鼠皮膚移植法》中，對該方法的基本操作步驟有詳細的介紹和規(guī)定。

小鼠和大鼠的檢測中普遍采用的是快速、有效的尾部皮膚移植法。植皮后至少觀察100天，只有在100天以上植皮雙方均不發(fā)生排斥，才能證實待測小鼠或大鼠的遺傳純合性。

在對已知品系檢測時，若急性排斥占手術例數(shù)30%，須重新考慮采樣，以確認是技術性還是其他原因造成的結果。供體受體移植結果近交系同品系同性別接受近交系不同品系排斥近交系本品系同其他品系雜交F1接受近交系♀同品系♂接受近交系♂同品系♀排斥雜交F1F1親代品系排斥雜交F1雜交F2接受雜交F2雜交F1排斥（少數(shù)接受）實驗動物皮膚移植規(guī)律

皮膚移植法優(yōu)點：易掌握、高度靈敏、經(jīng)濟、不需昂貴設備、對植皮接果的排斥或接受容易判斷。

皮膚移植法不足：該方法費時：為檢測非H-2組織相容性基因的差異，需觀察100天后才能作出判斷；飼養(yǎng)植皮動物需一定飼養(yǎng)空間；會出現(xiàn)一些系技術或其他非免疫因素植皮實驗失敗。該方法不是鑒別新品系的理想方法。

形態(tài)學分析-下頜骨

下頜骨形態(tài)是高度遺傳的性狀，由多態(tài)性位點確定。下頜骨的形態(tài)和大小在小鼠的近交系間存在明顯差異，所以，下頜骨分析是一種合理的方法。該方法是一種靈敏和有效的鑒別和檢測亞系變異（源于遺傳混雜和突變）的技術。正常環(huán)境因素及飼養(yǎng)管理對下頜骨形態(tài)幾乎沒有什么影響，50日齡后下頜骨基本上不再生長，其形態(tài)也不再發(fā)生變化。

檢測前，制作測量用的標準直角坐標底板，在顯微鏡下，放大10倍測量在直角坐標底板上下頜骨11個形態(tài)特征參考點的距離每次取樣10只為1組，制備下頜骨標本后，在近交系核心群中隨機取60日齡以上的成年雄鼠，

將所測量值的平均數(shù)作統(tǒng)計分析，利用判別函數(shù)確定下頜骨形態(tài)。如果測量值集中，則表明在被測小鼠間無顯著的遺傳差異。下頜骨形態(tài)分析是一種靈敏、經(jīng)濟、簡便、可同時檢驗大量的遺傳位點的遺傳監(jiān)測方法。若配以掃描機將下頜骨形態(tài)掃入電腦，經(jīng)電腦測量其形態(tài)特征參考點的距離，并由電腦完成統(tǒng)計分析，既可減少人為誤差，還可加快統(tǒng)計分析的速度。形態(tài)學檢測-毛色基交配小鼠毛色主要受A、B、C三個等位基因控制，它們分別在不同的染色體上。cc基因是其他毛色基因的上位基因。白化小鼠cc等位基因是已知的，A，B是待測基因。毛色基因交配測試可把隱性的毛色基因顯示出來。A-B-C-為野生色A-bbC-為桂皮色aaB-C-為黑色aabbC-為棕色DB