畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）-板藍(lán)根多糖提取

淮陰工學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)說(shuō)明書(shū)（論文）第1頁(yè)共19頁(yè)1,引言板藍(lán)根（常用別名：靛青根、藍(lán)靛根、大青根）是一種中藥材。中國(guó)各地均產(chǎn)。板藍(lán)根分為北板藍(lán)根和南板藍(lán)根，北板藍(lán)根來(lái)源為十字花科植物菘藍(lán)（IsatistinctoriaL.）和草大青（I.indigoticaFort.）的根；南板藍(lán)根為爵床科植物馬藍(lán)（BaphicacanthuscusiaBrem.）的根莖及根。具有清熱解毒、涼血消腫、利咽之功效。在臨床上用于預(yù)防病毒性感冒和治療腮腺炎[1]。據(jù)報(bào)道，板藍(lán)根多糖具有多種生物活性，對(duì)特異性免疫和非特異性免疫均有一定的促進(jìn)作用，是一種比較理想的免疫增強(qiáng)劑[2-3]。在中國(guó)由于抗生素濫用，細(xì)菌整體的耐藥率，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美國(guó)家約45%左右。合理的使用中藥將有效減少抗生素的濫用。板藍(lán)根是抗病毒中藥的典型代表，在中國(guó)有兩千多年的應(yīng)用歷史，臨床效果良好，而體外抗病毒篩選也基本證實(shí)其確切療效，首個(gè)獲美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院資助的中藥研究項(xiàng)目。1.1多糖的提取方法多糖類(lèi)物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，廣泛存在于動(dòng)物、植物、和微生物細(xì)胞壁中，是生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)以外的又一類(lèi)重要的生物分子?？茖W(xué)研究已經(jīng)確認(rèn)糖類(lèi)物質(zhì)具有許多生物活性，包括抗腫瘤、免疫、降血糖和抗病毒等，而且對(duì)機(jī)體幾乎無(wú)毒副作用。中藥多糖因具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能及抗腫瘤降血糖等藥理作用，而且?guī)缀鯖](méi)有毒性與副作用，因此引起國(guó)內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的關(guān)注。多糖是板藍(lán)根的主要活性物質(zhì)之一[4-6]。目前，多糖較常用的提取方法有：水提法、超聲輔助提取法和酶提取法等。1.1.1水提法用水作溶劑來(lái)提取多糖是最常用的方法之一，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提。水提取的多糖多數(shù)是中性多糖。一般植物多糖提取多數(shù)采用熱水浸提法，該法所得多糖提取液可直接或離心除去不溶物；或者利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，用高濃度乙醇沉淀提純多糖；但由于不同性質(zhì)或不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖沉淀所需乙醇濃度不同，它也可以用于樣品中不同多糖組分的分級(jí)分離；還可按多糖不同性質(zhì)在粗分階段利用混合溶劑提取法對(duì)植物中不同的多糖進(jìn)行分離；其中，以乙醇沉淀最為普遍。如李宏燕等人用100g去核棗粉，加入250mL適當(dāng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇，45℃水浴回流脫脂兩次，離心分離后棗渣加水共3500mL，90℃水浴攪拌浸提8h，離心分離，合并所得多糖提取液；提取液45℃減壓濃縮，濃縮液用無(wú)水乙醇沉淀，離心分離，得粗多糖沉淀；粗多糖加水溶解后，氯仿、正丁醇脫蛋白，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至弱堿性，加0.4倍多糖液體積的H202，40℃水浴保溫4h脫色；脫色液對(duì)蒸餾水透析24h，無(wú)水乙醇沉淀，離心分離，45℃真空干燥，得到大棗多糖。溶劑提取為常用的傳統(tǒng)方法之一，有自身的優(yōu)點(diǎn)。如不需特殊設(shè)備，成本低等，但此法往往提取效率低且費(fèi)時(shí)，操作周期過(guò)長(zhǎng)。因此，近年來(lái)，伴隨著現(xiàn)代工業(yè)工程技術(shù)的迅猛發(fā)展，一些現(xiàn)代高新技術(shù)不斷被應(yīng)用到植物多糖的提取中。1.1.2超聲提取法超聲波作為一種先進(jìn)的提取方法，具有提取時(shí)間短、能耗低、效率高等特點(diǎn)，在生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。其主要原理就是超聲波產(chǎn)生“空化作用”，這種空化作用能夠產(chǎn)生局部的高溫高壓，并形成強(qiáng)大的沖擊波或高速射流，這種強(qiáng)大的高速射流能夠有效地減小、消除與水相之間的阻滯層，加大了傳質(zhì)效率。同時(shí)，高速射流對(duì)植物細(xì)胞組織產(chǎn)生一種物理剪切力，使之變形、破裂并釋放出內(nèi)含物，這就大大加速了萃取過(guò)程。另外，超聲波的許多次級(jí)效應(yīng)如熱效應(yīng)、溶化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)、生物效應(yīng)、凝聚效應(yīng)等也能加速多糖成分在溶劑中的擴(kuò)散釋放，促進(jìn)多糖與溶劑混合，有利于萃取。1.1.3酶提取法酶技術(shù)是近年來(lái)廣泛應(yīng)用到有效成份提取中的一項(xiàng)生物技術(shù)，使用酶可降低提取條件，在比較溫和的條件下分解植物組織，加速有效成分的釋放或提取。此外，使用酶還可分解提取液中淀粉、果膠、蛋白質(zhì)等非目的產(chǎn)物。此法可使后續(xù)的濃縮和脫蛋白工藝更簡(jiǎn)易、省時(shí)，粗多糖的純度更高。但會(huì)提高生產(chǎn)成本，對(duì)提取條件要求較高。楊云采用的單酶法和復(fù)合酶法提取大棗多糖，單酶法提取多糖含量最高可達(dá)44.69%，而復(fù)合酶法多糖最高含量可達(dá)68.13%。1.2多糖含量的測(cè)定本次試驗(yàn)采用苯酚—硫酸比色法測(cè)定板藍(lán)根多糖的含量。苯酚—硫酸比色法測(cè)定多糖含量是由Dubois等［7］提出的。其原理是：多糖或寡糖被濃硫酸在適當(dāng)高溫下水解，產(chǎn)生單糖，并迅速脫水成糠醛衍生物，該衍生物在強(qiáng)酸條件下與苯酚起顯色反應(yīng)，生成橙黃色物質(zhì)，在波長(zhǎng)490nm處和一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度A值與糖濃度C呈線性關(guān)系[8]，從而可用比色法測(cè)定其含量。本課題擬用超聲波輔助提取法來(lái)分離提取板藍(lán)根中的多糖，研究板藍(lán)根多糖的提取工藝以及板藍(lán)根多糖在體外的抑菌活性。2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器表1實(shí)驗(yàn)儀器儀器名稱(chēng)規(guī)格生產(chǎn)廠家數(shù)量超聲波清洗器KQ-250B昆山市超聲儀器有限公司1臺(tái)離心機(jī)DL-6000B上海安亭科學(xué)儀器廠1臺(tái)數(shù)顯恒溫水浴鍋HHS2江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司1臺(tái)紫外分光光度計(jì)UV-2000尤尼柯（上海）儀器有限公司1臺(tái)分析天平FA2004上海恒平科技有限公司1臺(tái)立式壓力蒸汽滅菌器LDZX-30FB上海申安醫(yī)療器械廠1臺(tái)電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱PHG-9123A上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司1臺(tái)智能型生化培養(yǎng)箱SPX-260A上海特成機(jī)械設(shè)備有限公司1臺(tái)2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑表2實(shí)驗(yàn)試劑藥品名化學(xué)式規(guī)格級(jí)別生產(chǎn)廠家氯化鈉NaClAR天津市密歐化學(xué)試劑有限公司無(wú)水乙醇C2H5OHAR吳江仁和化工有限公司氫氧化鈉NaOHAR蚌埠化學(xué)試劑廠甲醇CH3OHAR宜興市第二化學(xué)試劑廠苯酚C6H6OAR無(wú)錫市恒奧物貿(mào)有限公司硫酸H2SO4AR國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1板藍(lán)根多糖提取的工藝流程板藍(lán)根粉末→干燥→回流脫脂→80%乙醇浸提→超聲波輔助提取→離心取上清液→濃縮→乙醇沉淀→水溶→冷凍干燥→板藍(lán)根多糖2.2.2樣品的前處理將從中藥店購(gòu)買(mǎi)的板藍(lán)根，粉碎成粒徑約40目的粉末，置于65℃烘箱中烘干至恒重。采用索氏抽提法，用乙醚作為萃取溶劑，對(duì)板藍(lán)根粉進(jìn)行脫脂處理。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥板藍(lán)根粉末4g，裝入濾紙包中，封好包口。用長(zhǎng)鑷子將裝有板藍(lán)根粉末的濾紙包放入抽提筒中，連接好抽提器各部分，向提取管中加入無(wú)水乙醚，使其正好虹吸一次，再向提取管中加入石油醚，使液面達(dá)到第一次的70%位置，接通冷凝水水流，調(diào)節(jié)水溫至70—80℃，使冷凝下滴的乙醚成連珠狀（120～150滴/min或回流7次/h以上），回流5小時(shí)取出濾紙包，在通風(fēng)處使乙醚揮發(fā)。用80%乙醇浸提除去料粉中的單糖、多酚、低聚糖和苷類(lèi)等小分子雜質(zhì)，將料粉晾干。2.2.3提取工藝的確定2.2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制本實(shí)驗(yàn)采用苯酚—硫酸比色法測(cè)定多糖的含量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密稱(chēng)取105℃下干燥至恒重的葡萄糖100mg于100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，制得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mL于100mL容量瓶中定容。分別吸取1mL于5支編號(hào)試管中，加入5%苯酚溶液1mL搖勻。勻速加入5mL濃硫酸，立即搖勻后置于冷水浴冷卻至室溫。分別移取0.5mL于5支編號(hào)的50mL容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度[9]。以蒸餾水同法處理，作為空白參比，于紫外分光光度計(jì)在490nm下測(cè)定吸光度，記錄數(shù)值，繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.3.2超聲波輔助提取的單因素實(shí)驗(yàn)通過(guò)文獻(xiàn)的查閱，影響多糖提取率的因素主要有料水比、超聲提取功率、超聲提取時(shí)間和提取溫度這四個(gè)因素。由于設(shè)備條件限制，實(shí)驗(yàn)室中KQ-250B型超聲波清洗機(jī)功率不可調(diào)，所以本實(shí)驗(yàn)分別以超聲波提取時(shí)間、提取溫度和料水比為實(shí)驗(yàn)因素，多糖提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。(1)超聲波提取時(shí)間準(zhǔn)確稱(chēng)取料粉2.0g，分別放于5支50mL離心管中，調(diào)節(jié)超級(jí)恒溫水浴鍋使超聲波清洗機(jī)中的水溫恒定在60℃，控制料水比為1:25，分別進(jìn)行超聲輔助提取10min、20min、30min、40min以及50min，將提取液以2000rpm離心15min，收集上清液，再按照同樣的超聲提取條件重復(fù)提取一次，合并提取液。向提取液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，靜置24h析出多糖，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min獲得粗多糖沉淀。再次粗多糖溶于水，冷凍干燥即得到板藍(lán)根粗多糖。稱(chēng)取一定量的粗多糖，加水定容，用苯酚—硫酸比色法測(cè)定多糖的含量，并計(jì)算提取率。用繪圖軟件繪制超聲提取時(shí)間與多糖提取率的關(guān)系曲線。(2)提取溫度準(zhǔn)確稱(chēng)取料粉2.0g，分別放于5支50mL離心管中，控制料水比為1:25，提取時(shí)間為40min，通過(guò)調(diào)節(jié)超級(jí)恒溫水浴鍋使提取過(guò)程分別在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下進(jìn)行。將提取液以2000rpm離心15min，收集上清液，再按照同樣的超聲提取條件重復(fù)提取一次，合并提取液。向提取液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，靜置24h析出多糖，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min獲得粗多糖沉淀。再次粗多糖溶于水，冷凍干燥即得到板藍(lán)根粗多糖。稱(chēng)取一定量的粗多糖，加水定容，測(cè)定多糖的含量，并計(jì)算提取率。用繪圖軟件繪制提取溫度與多糖提取率的關(guān)系曲線。(3)料水比確稱(chēng)取料粉2.0g，分別放于4支50mL離心管中，再準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0g料粉分裝于2支50mL離心管中。調(diào)節(jié)超級(jí)恒溫水浴鍋使超聲波清洗機(jī)中的水溫恒定在60℃，設(shè)置超聲波提取時(shí)間為30min，分別向離心管中加水，使料液比分別為1:5、1:10、1:15、1:20、1:25以及1:30。由于離心管容積為50mL，所以對(duì)于料水比為1:30的這項(xiàng)，取兩支離心管，每支裝1g料粉，加30mL水，使料水比為1:30，并且控制其他提取條件一樣將提取液以2000rpm離心15min，收集上清液，再按照同樣的超聲提取條件重復(fù)提取一次，合并提取液。向提取液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，靜置24h析出多糖，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min獲得粗多糖沉淀。再次粗多糖溶于水，冷凍干燥即得到板藍(lán)根粗多糖。稱(chēng)取一定量的粗多糖，加水定容，測(cè)定多糖的含量，并計(jì)算提取率。用繪圖軟件繪制料水比與多糖提取率的關(guān)系曲線。2.2.3.3正交試驗(yàn)在做正交試驗(yàn)之前，首先列出本實(shí)驗(yàn)的因素水平表。在超聲輔助提取板藍(lán)根多糖的工藝中，主要影響因素有三個(gè)：提取時(shí)間X1、提取溫度X2以及料液比X3。參考單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，取最佳單因素條件及其附近的值，作為正交試驗(yàn)中的三個(gè)水平，如表3：表3因素水平表水平X1（min）X2（℃）X3(g/mL)135551:20240601:25345651:30本實(shí)驗(yàn)中的正交試驗(yàn)為三因素三水平的試驗(yàn)，可以利用L9（34）正交表，映射成的正交表如表4所示，該表僅包含9個(gè)水平組合，就能反映包含27個(gè)水平組合的情況[10]。表4正交表試驗(yàn)號(hào)X1X2X3111121223133421252236231731383219332準(zhǔn)確稱(chēng)取料粉2.0g，分別放于5支50mL離心管中，按表4中所列出的提取條件進(jìn)行超聲輔助提取，將提取液以2000rpm離心15min，收集上清液，再按照同樣的超聲提取條件重復(fù)提取一次，合并提取液。向提取液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，靜置24h析出多糖，以2000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min獲得粗多糖沉淀。再次粗多糖溶于水，冷凍干燥即得到板藍(lán)根粗多糖，計(jì)算提取率。計(jì)算每一個(gè)因素的極差，通過(guò)直觀分析法找到影響提取率的主要因素，找到最佳因素水平組合。2.2.4體外抑菌實(shí)驗(yàn)2.2.4.1大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制為了使抑菌圈效果更好，應(yīng)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌接種。由于大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線根據(jù)培養(yǎng)條件的不同，各個(gè)周期維持時(shí)間也不一樣。所以需要預(yù)先測(cè)量并繪制一條大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線。取250mL三角瓶?jī)蓚€(gè)，在無(wú)菌操作條件下，分別加入100mL的LB培養(yǎng)基，一瓶作為實(shí)驗(yàn)組，一瓶作為對(duì)照。向?qū)嶒?yàn)組中接種一環(huán)大腸桿菌的保藏菌種，并和對(duì)照組一起放到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)時(shí)間0h、4h、8h、12h、16h、20h和24h時(shí)，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組取出并搖勻，以對(duì)照組作為參比溶液，實(shí)驗(yàn)組為被測(cè)溶液，于波長(zhǎng)600nm處測(cè)吸光度值，根據(jù)OD值繪出生長(zhǎng)曲線。2.2.4.2抑菌圈實(shí)驗(yàn)配制LB固體培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌，待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)倒平板。培養(yǎng)基冷卻后，用移液槍移取100μl大腸桿菌菌液分別加至3個(gè)平板中，使用涂布棒將其涂布均勻。先用75%的酒精對(duì)牛津杯消毒，再用無(wú)菌水沖洗，用鑷子取出并將牛津杯直立于培養(yǎng)基上，稍稍壓緊，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。在平板四周等間距放四個(gè)牛津杯，并在相應(yīng)位置標(biāo)上1、2、3、4。將1g板藍(lán)根多糖用100mL容量瓶定容配制成濃度為10-2g/mL的板藍(lán)根多糖溶液，將濃度為10-2g/mL的板藍(lán)根多糖溶液再稀釋3個(gè)濃度梯度。用移液槍吸取濃度為10-2g/mL的板藍(lán)根多糖溶液將1號(hào)牛津杯注滿；更換槍頭，吸取濃度為10-3g/mL的板藍(lán)根多糖溶液將2號(hào)牛津杯注滿；接著依次吸取濃度為10-4g/mL和濃度為10-5g/mL的板藍(lán)根多糖溶液將3號(hào)和4號(hào)牛津杯也注滿最后蓋上陶瓦蓋，37℃條件下恒溫培養(yǎng)20h，取出用直尺測(cè)量并記錄抑菌圈的大小。2.2.4.3多糖的抑菌穩(wěn)定性研究為了探究板藍(lán)根多糖的抑菌機(jī)制，以及在不同環(huán)境下的抑菌效果，分別選取100℃高溫和強(qiáng)紫輻射為測(cè)試條件。對(duì)于高溫環(huán)境的測(cè)試，將配制好的濃度為10-2g/mL的板藍(lán)根多糖溶液分別吸取5mL放到4支小試管中，給4只小試管編號(hào)1、2、3、4,把1號(hào)試管作為對(duì)照，2號(hào)3號(hào)和4號(hào)試管分別置于100℃沸水中5min、10min和20min。由于抑菌圈能很好地反映藥物的抑菌活性，所以仍然用抑菌圈實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)多糖溶液的穩(wěn)定性。培養(yǎng)基的配置、大腸桿菌的涂布以及牛津杯的擺放與之前實(shí)驗(yàn)一樣。吸取對(duì)應(yīng)編號(hào)的試管中的多糖溶液，把對(duì)應(yīng)位置處的牛津杯注滿，蓋好陶瓦蓋37℃培養(yǎng)20小時(shí)。對(duì)于紫外線對(duì)多糖活性的影響，由于紫外線很難穿透玻璃，所以將配制好的濃度為10-2g/mL的板藍(lán)根多糖溶液分別吸取10mL放到4個(gè)培養(yǎng)皿中，給4個(gè)培養(yǎng)皿編號(hào)1、2、3、4,把1號(hào)培養(yǎng)皿作為對(duì)照，2號(hào)3號(hào)和4號(hào)培養(yǎng)皿分別紫外照射10min、20min和30min，取出后在無(wú)菌操作條件下，分別將對(duì)應(yīng)位置的牛津杯注滿，蓋上陶瓦蓋，37℃培養(yǎng)20小時(shí)。通過(guò)對(duì)抑菌圈大小的分析，確定板藍(lán)根多糖在不同條件下的抑菌活性，以探討板藍(lán)根多糖的抑菌機(jī)制。2.2.4.4MIC的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)采用倍比稀釋法測(cè)定板藍(lán)根多糖的MIC值。在無(wú)菌操作條件下，取5支試管，用記號(hào)筆依次標(biāo)號(hào)1、2、3、4、5。向每支試管中加入5ml滅菌過(guò)的LB液體培養(yǎng)基，向1號(hào)試管中加入5ml濃度為10-2g/mL的板藍(lán)根多糖溶液，充分混勻后取出5ml加入到2號(hào)試管中，依此做倍比稀釋至第5號(hào)試管。將活化10小時(shí)后的菌液稀釋100倍，用移液槍吸取50μl依次加入到每支試管，用脫脂棉塞好，放在37℃下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h~24h。取出后觀察溶液的澄清度，培養(yǎng)液澄清的最低中藥濃度為板藍(lán)根多糖的MIC。3結(jié)果與討論3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示：圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖1可以看出，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為C（μg/mL）=0.06A490+0.00139，相關(guān)系數(shù)為R2=0.997，在測(cè)得樣品中多糖的含量后，按下式計(jì)算樣品中多糖提取率。多糖提取率（%）=粗多糖中多糖質(zhì)量/預(yù)處理板藍(lán)根粉的質(zhì)量×100%3.2單因素實(shí)驗(yàn)3.2.1超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響圖2提取時(shí)間對(duì)板藍(lán)根多糖提取率的影響從圖2可以看出，在超聲處理10min~40min時(shí)多糖的得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)有明顯的提高，表明超聲波能在短時(shí)間內(nèi)破碎細(xì)胞，使存在于板藍(lán)根細(xì)胞壁和細(xì)胞壁之間的多糖物質(zhì)釋放出來(lái)。當(dāng)提取時(shí)間在40min左右時(shí)多糖得率增長(zhǎng)緩慢，提取時(shí)間超過(guò)40min后提取率反而下降?？赡艿脑蚴浅暡ㄐ纬傻臋C(jī)械振動(dòng)有較強(qiáng)的剪切力，使得大分子多糖斷裂成小的片段，從而在后處理的過(guò)程中損失增大而使得率降低。另外，在測(cè)定多糖含量的過(guò)程中可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)40min時(shí)，粗多糖中的多糖含量略微降低，可能的原因是板藍(lán)根細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的超聲破碎，細(xì)胞內(nèi)的色素以及其他一些可溶性雜質(zhì)混入提取液。因此初步確定多糖的超聲提取時(shí)間在40min左右。3.2.2提取溫度對(duì)提取率的影響圖3提取溫度對(duì)板藍(lán)根多糖提取率的影響從圖3可以看出，當(dāng)提取溫度低于50℃時(shí)，提取率很低，高于50℃時(shí)提取率有顯著提高，但是當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高，超過(guò)60℃時(shí)提取率卻不再增加。說(shuō)明溫度對(duì)于提取過(guò)程有明顯的促進(jìn)作用。但是考慮到溫度過(guò)高可能會(huì)對(duì)多糖活性有破化作用，同時(shí)溫度過(guò)高給后續(xù)操作帶來(lái)不便，成本費(fèi)用增加。故提取溫度應(yīng)為60℃左右。3.2.3料水比對(duì)提取率的影響圖4料液比對(duì)板藍(lán)根多糖提取率的影響從圖4可以看出，隨著料水比的增加提取率不斷增大，原因可能是超聲波將堅(jiān)硬的細(xì)胞壁有效破碎，在溶出有效成分的同時(shí)，溶出一些其它液質(zhì)，而增加溶劑的比例，可以有效降低溶液的黏度，有利于傳質(zhì)擴(kuò)散。但是當(dāng)料水比大于1:25時(shí)，多糖提取率增加不明顯，考慮到在實(shí)際操作中溶液體積過(guò)大不利于后續(xù)的濃縮和醇沉實(shí)驗(yàn)操作，并且實(shí)驗(yàn)成本增加。由此初步確定多糖的超聲提取的料液比為1：25左右。3.3正交實(shí)驗(yàn)3.3.1板藍(lán)根多糖提取正交實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響板藍(lán)根中多糖提取的三個(gè)因素（超聲時(shí)間、提取溫度、料水比）進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。表5板藍(lán)根多糖提取正交實(shí)驗(yàn)因素超聲時(shí)間提取溫度料水比多糖得率（%）11119.47212210.36313311.25421311.75522110.16623213.43731212.97832313.2493319.58K131.0834.1929.21K235.3433.7636.76K335.7934.2636.24k110.3611.409.74k211.7811.2512.25k311.9311.4212.08R1.570.872.34在極差分析中R值反映了該因素的水平改變對(duì)板藍(lán)根多糖提取率影響的大小。因此從表中可以看出，各因素影響主次順序?yàn)榱纤?gt;超聲時(shí)間>提取溫度。最佳提取工藝為超聲時(shí)間40min、溫度65℃、固液比1:25。3.4體外抑菌實(shí)驗(yàn)3.4.1大腸桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制圖5大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線從圖5可以看出，大腸桿菌生長(zhǎng)的4個(gè)時(shí)期區(qū)分非常明顯。0h至4h為遲緩期，休眠狀態(tài)的大腸桿菌為適應(yīng)新的環(huán)境，生長(zhǎng)緩慢；5h至8h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，這個(gè)時(shí)期，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，大腸桿菌成對(duì)數(shù)快速增長(zhǎng)；9h至20h為穩(wěn)定期，由于培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷被消耗，有害代謝產(chǎn)物積累以及pH值下降等原因，大腸桿菌繁殖速度下降而死亡的細(xì)菌數(shù)不斷增加，細(xì)菌的總數(shù)處于穩(wěn)定的狀態(tài)；20h到24h為衰亡期，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，而毒素大量積累，大腸桿菌的繁殖速度逐漸減緩而死亡菌數(shù)明顯增多，衰亡速度超過(guò)繁殖速度，細(xì)菌總數(shù)呈下降趨勢(shì)。所以應(yīng)在培養(yǎng)時(shí)間10h左右接種，過(guò)早，雖然菌種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但是菌濃度太低；過(guò)遲，雖然菌濃度合適但是菌活性明顯降低。3.4.2抑菌圈的測(cè)定對(duì)大腸桿菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示：圖6板藍(lán)根多糖的抑菌圈結(jié)果如圖6所示，數(shù)字①代表的濃度是10-2g/mL，測(cè)量得到其抑菌圈直徑為1.8cm；數(shù)字②代表的濃度是10-3g/mL抑菌圈直徑1.6cm；數(shù)字③代表的濃度是10-4g/mL抑菌圈直徑1.2cm；數(shù)字④代表濃度是10-5g/mL抑菌圈直徑1.2cm。通過(guò)對(duì)抑菌圈直徑大小的分析，當(dāng)板藍(lán)根多糖濃度高于10-3g/mL是，多糖溶液有明顯的抑菌效果。當(dāng)板藍(lán)根多糖濃度濃度低于10-4g/mL時(shí)抑菌效果不明顯。所以當(dāng)板藍(lán)根溶液濃度大于10-3g/mL時(shí)有較明顯的抑菌效果。3.4.3多糖的抑菌穩(wěn)定性研究高溫測(cè)試結(jié)果如圖7所示：圖7板藍(lán)根多糖的高溫測(cè)試結(jié)果圖中，位置①是作為對(duì)照組的，未處理的濃度為10-2g/mL的板藍(lán)根多糖溶液，用直尺量得其抑菌圈直徑為1.8cm可以看出抑菌效果很明顯。位置②是100℃高溫處理5min的板藍(lán)根多糖溶液，抑菌圈直徑1.2cm可以看出盡管其抑菌效果受到一定程度的影響，但仍具有抑菌的效果。位置③和④處，分別放置的是高溫處理10min和20min的板藍(lán)根多糖溶液，幾乎看不到抑菌圈的存在。所以10min左右的高溫處理可以讓板藍(lán)根多糖完全喪失抑菌活性。所以高溫對(duì)于板藍(lán)根多糖的抑菌活性有明顯的抑制效果。紫外測(cè)試結(jié)果如圖8所示圖8板藍(lán)根多糖的紫外照射測(cè)試結(jié)果圖8中，位置①處放的是作為對(duì)照組的，未處理的濃度為10-2g/mL的板藍(lán)根多糖溶液，量得抑菌圈直徑為1.8cm。從抑菌圈的大小，可以看出未經(jīng)處理的板藍(lán)根多糖溶液具有很明顯抑菌效果。位置②放的是紫外照射10min的板藍(lán)根多糖溶液，抑菌圈直徑為1.1cm，抑菌效果受到明顯的影響，抑菌效果微弱。位置③和位置④處分別是紫外照射20min和30min的板藍(lán)根多糖溶液，看不出抑菌圈的存在，所以經(jīng)過(guò)20min以上的紫外照射處理，板藍(lán)根多糖會(huì)完全失去抑菌活性。從以上的研究可以看出板藍(lán)根多糖很容易受到溫度、紫外輻射等外因素的影響而失去抑菌活性。所以想要發(fā)揮板藍(lán)根多糖的抑菌效果，需要保持合適的溫度，并且避免光照。3.4.4MIC的測(cè)定對(duì)板藍(lán)根多糖溶液通過(guò)試管倍比稀釋法進(jìn)行MIC的測(cè)定，結(jié)果如圖9所示：圖9板藍(lán)根多糖MIC的實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖9可以看出，1號(hào)以及2號(hào)試管中培養(yǎng)基澄清，表示沒(méi)有大腸桿菌生長(zhǎng)；而3號(hào)至5號(hào)試管中培養(yǎng)基渾濁，表明有大腸桿菌生長(zhǎng)，按照最小抑菌濃度MIC的定義，最低沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度為MIC。由于本實(shí)驗(yàn)采用的是倍比稀釋法，所以5支試管中板藍(lán)根多糖溶液濃度分別是0.01g/ml、0.005g/mL、0.0025g/mL、0.00125g/mL和0.00625g/mL。因此可以確定板藍(lán)根多糖的MIC為5mg/mL。

結(jié)論本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)研究了板藍(lán)根多糖的最佳提取工藝條件，得出板藍(lán)根多糖的最佳提取工藝為超聲時(shí)間40mi