遺傳工程動物

遺傳工程動物

一.轉(zhuǎn)基因動物概念所謂轉(zhuǎn)基因動物就是把外源性目的基因?qū)雱游锏氖芫鸦蚱淠遗呒?xì)胞中，后改用注入受精卵的任何一個前核，并在細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合，再將合格的重組受精卵或囊胚細(xì)胞篩選出來，采用借腹懷孕法寄養(yǎng)在雌性動物（fostermother）的子宮內(nèi),使之發(fā)育成具表達(dá)目的基因的胚胎動物,并能傳給下一代。這樣，生育的動物為轉(zhuǎn)基因動物。這類動物由于外源性目的基因的穩(wěn)定存在而賦于子代動物個體。轉(zhuǎn)基因動物研究大事記1.追溯20世紀(jì)60年代末和70年代初就有人向蛙卵和小鼠胚胎注射mRNA，研究mRNA能不能在動物卵細(xì)胞和早期胚胎中翻譯。

2.1974年，Jaenisch和Mintz首次報道應(yīng)用顯微注射法獲得SV40DNA轉(zhuǎn)基因小鼠。

3.1982年P(guān)almiter成功獲得了含金屬巰基(MTI)基因啟動子與大鼠生長基因的融合基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。體重遠(yuǎn)大于正常對照，被稱為“超級小鼠”(Supermice)。4.1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。1989年，意大利學(xué)者用精子作為載體，成功地獲得了純系轉(zhuǎn)基因小鼠。1997年2月，英國羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細(xì)胞克隆羊“多利”培育成功。1997年10月，英國羅斯林研究所宣布已克隆出3只攜帶有人凝血因子Ⅸ基因轉(zhuǎn)染綿羊。

1999年2月，上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀闭Q生，其體內(nèi)被檢測到帶有人的血清白蛋白基因，這項成果被評為當(dāng)年“中國十大科技進(jìn)展”之一。2000年6月22日晚8時整，生物胚胎工程專家張涌教授在西北農(nóng)林科技大學(xué)種羊場順利接生了一只雌性體細(xì)胞克隆山羊陽陽。2001年英國PPL公司宣布獲得世界首例轉(zhuǎn)基因克隆豬誕生。轉(zhuǎn)基因超級鼠1982年，英國的《自然》雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大鼠生長激素重組基因?qū)氲叫∈笫芫阎?培育出具快速生長效應(yīng)的“轉(zhuǎn)基因超級鼠”。轉(zhuǎn)基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快2～3倍，體積大一倍。Supermice上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所宣布：取名為“滔滔”的我國首例轉(zhuǎn)基因試管牛于1999年2月19日在上海市奉賢縣奉新動物試驗場誕生，出生時體重38公斤，經(jīng)檢測它攜帶有人血清白蛋白基因。這是繼去年成功地培育出在乳汁中含有人凝血因子IX的轉(zhuǎn)基因山羊后，該所獲得的又一項重大科研成果。2000年6月，張涌教授培育成功世界首批體細(xì)胞克隆山羊“元元”、“陽陽”。圖為利用體細(xì)胞克隆的山羊“陽陽”（左）和它的克隆體山羊。2006.12.３頭口、蹄及舌頭呈現(xiàn)出綠色熒光的轉(zhuǎn)基因克隆小豬日前在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)順利降生。這是中國培育出的首例綠色熒光的轉(zhuǎn)基因豬，也是世界上第四例通過體細(xì)胞核移植技術(shù)培育的該類轉(zhuǎn)基因豬。

二、轉(zhuǎn)基因動物基本程序(一）待轉(zhuǎn)移的目的基因的獲得與設(shè)計(二)動物遺傳背景及種系的選擇在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動物研究時要考慮遺傳背景及種的問題。(三)常用的細(xì)胞

1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動物子宮→胚胎→個體。

2）胚胎干細(xì)胞：從著床前的動物胚胎中分離多功能胚胎干細(xì)胞→基因操作→注射入動物囊胚→形成嵌合體胚胎→嵌合個體。(四)外源基因的導(dǎo)入的方法(五)轉(zhuǎn)基因動物中外源基因的檢測和傳代(一）待轉(zhuǎn)移的目的基因的獲得與設(shè)計

1、目的基因的來源①采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因；②通過mRNA合成cDNA；③人工合成的DNA片段；④聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增特定基因片段。2、目的基因的克隆通過載體在適當(dāng)?shù)乃拗髦锌寺∵x擇載體目的基因與載體的連接重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞通過PCR反應(yīng)克隆目的基因3、基因構(gòu)建現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的“基因”不是僅僅是目的蛋白編碼序列(codingsequence)的DNA片斷，而是包括基因表達(dá)的一整套順式作用元件(cis-actingelements)。①、啟動子（promotor）

啟動子位于基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游不遠(yuǎn)處，往往含有TATA框以及一些短的調(diào)控序列，也有一些啟動子不含TATA框而還有Inr序列。啟動子序列是構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體時首先要具備的生物元件。組織特異性啟動子(tissue-specific)在動物體中，除了那些擔(dān)負(fù)基本生命功能的持家基因(House-keepinggene)以外，絕大多數(shù)基因呈組織特異性表達(dá)。要使轉(zhuǎn)入的外源基因在特定的組織中表達(dá)，就要使用組織特異性啟動子。對大多數(shù)基因來講，我們還只能分離它近5’端的啟動子。及近5’端和近3‘端的增強(qiáng)子，有時還要將一個或幾個內(nèi)含子包括在內(nèi)，即便如此，往往還是不能達(dá)到完全的組織特異性.得到組織特異性表達(dá)啟動子啟動子表達(dá)的組織CMV各種組織WAP乳腺β-Lactoglobulin乳腺Albuminenhancer肝臟αmyosinheavychain心臟②、增強(qiáng)子（enhancer）真核基因的表達(dá)除了受位于轉(zhuǎn)錄起始位點附近的DNA序列的調(diào)控外，還要受到距離很遠(yuǎn)的一類調(diào)控序列的調(diào)控。這類序列叫做增強(qiáng)子，其本身不具有啟動子的功能，但能夠使啟動子的轉(zhuǎn)錄活性提高數(shù)百倍。③、目的基因

目的基因的序列應(yīng)該包含至少一個開放閱讀框（ORF），即含有起始密碼子和終止密碼子的一段基因序列。以往構(gòu)件目的基因時一般使用基因文庫中的cDNA序列，但實踐證明僅僅有cDNA序列往往難以得到有效表達(dá)，至少一個內(nèi)含子與cDNA序列結(jié)合會使基因得到更好的表達(dá)。④、報告基因（reportergene）或標(biāo)記基因

常用的報告基因有β-半乳糖苷酶(lacZ)、大腸桿菌氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶CAT(chloramphenicolacetyltransferasegene)、螢火蟲的熒光素酶基因（fireflyluciferasegene）、綠色熒光蛋白基因（GFP）和人生長激素基因（hGH）等。這些報告基因都能產(chǎn)生各自特有的化學(xué)或發(fā)光反應(yīng)，使對結(jié)果的觀察變得簡單明了。⑤、多聚腺苷酸化信號真核生物的mRNA在完成轉(zhuǎn)錄后，其3、端要經(jīng)歷進(jìn)一步修飾，其間相當(dāng)一段原始轉(zhuǎn)錄物被切掉，并在結(jié)尾之處裝上可多達(dá)200個的腺苷酸殘基。(二)動物遺傳背景及種系的選擇在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動物研究時要考慮遺傳背景及種系的問題（三）外源基因?qū)胧芫鸦蚺咛ゼ?xì)胞的常用方法顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法胚胎干細(xì)胞法精子載體導(dǎo)入法細(xì)胞核移植法生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法（一）、顯微注射法1.目的基因的制備與純化2.卵供體母鼠和假孕母鼠的準(zhǔn)備3.超排卵與取卵4.基因顯微注射5.受精卵移植6.目的基因的表達(dá)整合鑒定和檢測

7.建系優(yōu)點：轉(zhuǎn)基因范圍廣，轉(zhuǎn)移基因大，可達(dá)數(shù)百kb；且轉(zhuǎn)基因不含任何病毒基因組片段，絕對安全。缺點：整合機(jī)制不明確，無規(guī)律隨機(jī)整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不表達(dá)；整合位點隨機(jī)會造成轉(zhuǎn)動物基因組的重排、突變、易位缺失等；需顯微操作儀，技術(shù)性要求強(qiáng)。顯微注射法

(二)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法慢病毒性載體體積較小，不適合攜帶太大的(>10kb)的DNA片段。使用病毒性載體時，要注意安全。為了確保病毒性載體的安全性，以下技術(shù)已經(jīng)用于構(gòu)建病毒性載體：

首先，消除其復(fù)制能力，使其不能自我增殖。因此只能反轉(zhuǎn)錄一次。

其次，改變其包裝性狀，使其只能在特定細(xì)胞系中包裝而獲得感染能力。此外，引入基因突變，使其轉(zhuǎn)錄功能失活。雖然通過酶切修飾和重組等技術(shù)可以去除或者減少病毒性載體的治病性，但是，不同來源的病毒性載體，其結(jié)構(gòu)和安全性可能有所不同，要選擇適當(dāng)?shù)穆《拘暂d體，必要時要進(jìn)行進(jìn)一步修飾重組并反復(fù)驗證，確保安全。在包裝時，每次只能包裝一種載體，以免發(fā)生DNA重組，從而產(chǎn)生致病性。

第三，在專用工作臺上操作，并且要采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施。逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)LTR:Longterminaterepeat1、逆轉(zhuǎn)錄病毒法制備轉(zhuǎn)基因動物目的基因插入?yún)^(qū)域逆轉(zhuǎn)錄病毒法基本步驟構(gòu)建病毒載體轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞收集病毒顆粒感染受精卵胚胎移植表達(dá)gag,pol,env

細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒法制備轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)缺點

優(yōu)點轉(zhuǎn)基因效率高單位點、單拷貝整合，易分析插入位點雞卵等含卵黃多的受精卵適宜

缺點隨機(jī)整合攜帶外源DNA片段大小受限，一般小于10kb易產(chǎn)生嵌合體（mosaic)，實驗周期長有安全隱患，有可能因DNA重組產(chǎn)生活病毒。（三）.胚胎干細(xì)胞法將ES細(xì)胞植入動物囊胚后,可參與宿主胚胎的形成,直至達(dá)到種系嵌合,因此,可將其作為一種載體,把外源DNA導(dǎo)入ES細(xì)胞就可以實現(xiàn)由此發(fā)育而成的轉(zhuǎn)基因動物。該方法的優(yōu)點是外源基因的整合率很高,約50%,整合率在生殖細(xì)胞中的比例約為30%。缺點是不易建立ES細(xì)胞系。利用胚胎干細(xì)胞法制備轉(zhuǎn)基因小鼠的過程1.分離培養(yǎng)ES細(xì)胞。

2.ES細(xì)胞基因操作。

3.獲取囊胚期胚胎，以作為ES細(xì)胞的移植受體。4.通過顯微操作將ES細(xì)胞注射到囊胚期胚胎的囊胚腔內(nèi)，形成嵌合體。

5.將注射過ES細(xì)胞的胚胎，移植到交配后3d的假孕母鼠子宮內(nèi)，培育出轉(zhuǎn)基因小鼠。優(yōu)點：基因轉(zhuǎn)移效率大大提高，且能進(jìn)行定位基因轉(zhuǎn)移。缺點：需要多代才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動物，這對飼養(yǎng)成本高，產(chǎn)仔數(shù)較少的大型哺乳類動物來說，要獲得轉(zhuǎn)基因動物是一件需要大量資金投入的事情。(四）精子載體法

意大利Lavitrano等1989年首次報道利用精子作為載體獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。

精子載體法是精子和外源DNA混合培養(yǎng)時，外源DNA可直接進(jìn)入精子的頭部，通過受精將外源基因引入動物細(xì)胞中。外源DNA導(dǎo)入精細(xì)胞的方法有DNA與精子共育法、電穿孔導(dǎo)入法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。（五）細(xì)胞核移植法先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)氩⒑Y選。然后將帶轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎.（六）生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法四、外源DNA整合、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的分子檢測1）外源基因的整合檢測PCRDot-blotSouthern-blot2）外源基因的轉(zhuǎn)錄檢測northern-blot原位雜交3）外源基因的表達(dá)檢測血液生化ELASA

病理、免疫組織化學(xué)基因產(chǎn)物的檢測western-blot4.基因動物品系或品種的建立

第一代轉(zhuǎn)基因動物是半合子轉(zhuǎn)基因動物，因為外源基因僅在一條染色體上穩(wěn)定整合。只有通過選種選配，將兩個半合子轉(zhuǎn)基因動物成功交配，才能得到純合子轉(zhuǎn)基因動物，建立轉(zhuǎn)基因動物家系，外源DNA才能在后代中穩(wěn)定遺傳

純系轉(zhuǎn)基因動物的培育

Founder小鼠╳正常小鼠

F1陽性小鼠（AO）

F1陽性小鼠（AV）╳正常小鼠近親繁殖以得到純合小鼠

F2陽性小鼠（AO）

F2（AO）╳F2（AO）

F3（1/4AA，1/2AO，1/4OO）

F3（AA）╳F3（AA）純合子小鼠交配得到穩(wěn)定品系

F4（AA）G0代編號檢測（3周齡）PCRSouthernG0代整合檢測--：棄去+：保留X野生型G1代--：棄去+：半合子X半合子--：棄去+：純合子G2代表型檢測founder鼠互交五.轉(zhuǎn)入基因的整合和表達(dá)外源基因進(jìn)入細(xì)胞后的命運整合到染色體內(nèi)

隨機(jī)整合定點整合游離在細(xì)胞漿內(nèi)暫態(tài)表達(dá)在核酸酶的作用下降解隨機(jī)整合（Randominsertion）

外源基因隨機(jī)插入到染色體的任意部位。插入到致死基因序列內(nèi)：胚胎死亡插入到功能基因序列內(nèi)：基因失活插入到某調(diào)控區(qū)作用范圍：外源基因表達(dá)增強(qiáng)/減弱轉(zhuǎn)基因的整合和表達(dá)特征①1-100拷貝左右的外源基因以頭尾相連成串的方式整合到小鼠染色體上;②外源基因的整合絕大部分是隨機(jī)整合;

③轉(zhuǎn)入基因整合是穩(wěn)定的，一部分按孟德爾方式遺傳給后代，還有一部分為嵌合體

④轉(zhuǎn)基因表達(dá)的強(qiáng)弱與整合的拷貝數(shù)無關(guān)，而與“位置效應(yīng)”有關(guān);⑤轉(zhuǎn)基因的特異性表達(dá)可以只在一種類型細(xì)胞中或少數(shù)幾種不同類型細(xì)胞中，也可以在許多類型細(xì)胞中表達(dá);⑥轉(zhuǎn)基因構(gòu)件中原核生物的序列可能會抑制某些基因表達(dá);⑦沒有內(nèi)含子的cDNA基因的表達(dá)比基因組DNA基因表達(dá)要弱得多;⑧少數(shù)轉(zhuǎn)基因位點的兩側(cè)序列有重排現(xiàn)象。提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)的策略1.導(dǎo)入大片段（LCR序列）2.共整合和基因搭救這可能是一種很有用的策略，即將表達(dá)水平較高的基因與另外一些表達(dá)水平低的基因一同整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中(同一位點串聯(lián)整合)，這樣的處理對增強(qiáng)表達(dá)水平低的基因構(gòu)件的表達(dá)具有明顯的作用。3.增添基質(zhì)附著區(qū)核基質(zhì)附著區(qū)(MAR)可能是結(jié)構(gòu)基因的界域，它將染色質(zhì)分成許多可獨立調(diào)控的單元。構(gòu)件太大MAR＋LCR＋轉(zhuǎn)基因構(gòu)件不受位置效應(yīng)的表達(dá)六、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用1、研究基因的結(jié)構(gòu)和功能及其表達(dá)與調(diào)控

2、建立人類疾病動物模型3、研究人類疾病基因治療

4、研制生物反應(yīng)器，生產(chǎn)天然活性藥物蛋白

6、改良和培育動物新品種

腫瘤轉(zhuǎn)基因小鼠的模型

SV40T小鼠腫瘤模型的建立猿猴病毒SV40作為一種致瘤DNA腫瘤病毒被廣泛證實可引起物多種腫瘤形成，其致瘤作用主要通過其早期區(qū)域基因編碼產(chǎn)物大T抗原實現(xiàn)。SV40T影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白P53的功能；SV40T與腫瘤抑制蛋白RB，使其喪失功能。此外還與多種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白作用，致使細(xì)胞分裂加速，形成腫瘤，是致癌機(jī)理研究的較為透徹的一種蛋白。

腦癌胰腺癌轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器

□定義：將目的基因?qū)雱游矬w內(nèi)形成轉(zhuǎn)基因生物，由于基因表達(dá)，可以從轉(zhuǎn)基因動物的特定組織或器官（乳汁、血液等）獲得目的基因產(chǎn)物。使轉(zhuǎn)基因動物象一個活的發(fā)酵罐一樣來生產(chǎn)目的基因的產(chǎn)物。

□步驟（圖）：采用上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因羊，可從羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA（組織溶解酶原激活劑）。十大神奇轉(zhuǎn)基因動物

這些五彩斑斕的腦細(xì)胞是單個的神經(jīng)元，鮮艷的色彩幫助科學(xué)家將它們區(qū)分開來。哈佛大學(xué)的杰夫-里奇曼為首的科研小組在實驗鼠的基因組中導(dǎo)入水母的綠色熒光蛋白基因，使其在紫色光線的照射下呈現(xiàn)出綠色熒光。這種綠色熒光基因?qū)π∈鬅o害，只起到標(biāo)記作用。熒光鼠七.轉(zhuǎn)基因動物存在的問題發(fā)展趨勢

1.轉(zhuǎn)基因動物的成功率和成活率極低2.難以控制轉(zhuǎn)基因在宿主基因組中的行為3.大部分轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平極低，而極少部分轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平過高4.陽性轉(zhuǎn)基因動物篩選不易八.轉(zhuǎn)基因動物的安全性問題外源基因的插入可能對宿主動物自身有影響,造成基因污染對生態(tài)平衡以及物種的多樣性造成不良影響;轉(zhuǎn)基因移植可能加大“人畜共患病”的傳播機(jī)會,給人類帶來災(zāi)難性的損壞;

轉(zhuǎn)基因動物制品的安全性也是值得謹(jǐn)慎的一個環(huán)節(jié),因為它有可能導(dǎo)致過敏等反應(yīng);轉(zhuǎn)基因動物的研究將導(dǎo)致一場社會倫理的大討論。小結(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是在基因重組基礎(chǔ)上建立新的多細(xì)胞真核生物的方法。這是一個具有重大意義的革命性的突破。它為我們培育新的物種提供了新的思路，為我們研究基因的功能，研究疾病發(fā)生的機(jī)理提供了有力的手段

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二.基因敲除動物

(geneknockoutanimals)什么是基因敲除技術(shù)？1987-89年

MartinEvans，OliverSmithies和MarioCapecch領(lǐng)導(dǎo)的幾個研究小組首次對胚胎干細(xì)胞中特定目標(biāo)基因進(jìn)行失活，培育出了第一只基因敲除小鼠。到目前為止，已經(jīng)培育出上千種基因敲除小鼠。三種技術(shù)的融合

二、基因敲除的基本程序1、構(gòu)建打靶載體

1）同源序列

2）打靶載體常含兩種篩選標(biāo)志

neor：新霉素抗性基因，陽性篩選標(biāo)志，neor基因插入用于打靶的外源DNA中，當(dāng)重組后，細(xì)胞能在含新霉素的培養(yǎng)基中生長。neorHSV-tkHSV-tk(更昔洛韋)：單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，陰性篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產(chǎn)物，產(chǎn)生自殺效果。

HSV-tk基因插入外源基因外側(cè)的載體序列中。同源重組時，Tk-基因往往丟失；隨機(jī)整合時，Tk-基因連同打靶載體整合到核基因組上，而同時獲得neo和HSV-tk兩個基因的打靶細(xì)胞。啟動子HSV-TK同源序列同源序列Neo隨機(jī)整合同源重組2、將載體導(dǎo)入ES細(xì)胞選取發(fā)育第4-5天的胚胎干細(xì)胞(ES)

。把外來基因轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞。并篩選打靶成功的細(xì)胞。3、將基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。4、將10-20個胚泡植入假孕小鼠子宮。5