TGXAS-海洋生物體 類固醇激素的測(cè)定的測(cè)定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法編制說明

PAGEPAGE1《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（征求意見稿）編制說明《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》編制組二〇二三年十二月項(xiàng)目名稱：《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》項(xiàng)目統(tǒng)一編號(hào)：2022-4802本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站、廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、上海第二工業(yè)大學(xué)、廣東海洋大學(xué)、廣西壯族自治區(qū)欽州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、廣西藍(lán)合創(chuàng)訊數(shù)據(jù)科技有限公司。本文件主要起草人：任朝興、藍(lán)文陸、韋業(yè)、龍慧琴、王其春、高桂蘭、房琴、蘇子幸、楊爽、陳燕、賀亮、吳鑫、張文武、王永峰、鄧元秋、宋寶、黃仕英、張際標(biāo)、張鵬、趙利容、吳茂銀。PAGE12PAGE63目錄1任務(wù)來源 12標(biāo)準(zhǔn)制定的必要性和意義 12.1類固醇激素的分類、來源及危害 12.2本標(biāo)準(zhǔn)研究的目標(biāo)化合物的基本信息 22.2現(xiàn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施情況和存在問題 73國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究 73.1主要國家、地區(qū)及國際組織相關(guān)分析方法研究 73.2國內(nèi)相關(guān)分析方法研究 74標(biāo)準(zhǔn)編制工作過程 94.1成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組 94.2查詢國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料 94.3確定標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)路線，制訂原則 104.4編寫標(biāo)準(zhǔn)草稿和編制說明草稿 104.5方法驗(yàn)證工作 104.6編寫標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明 105標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則和技術(shù)路線 105.1標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則 105.2標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍和主要技術(shù)內(nèi)容 105.3標(biāo)準(zhǔn)制修訂的技術(shù)路線 116方法研究報(bào)告 126.1方法研究的目標(biāo) 126.2方法原理 126.3試劑和材料 126.4儀器的選擇 126.5樣品 126.6分析步驟 136.7結(jié)果計(jì)算與表示 217方法驗(yàn)證 237.1方法驗(yàn)證方案 237.2方法驗(yàn)證過程 247.3方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)的取舍 24參考文獻(xiàn) 24附件一方法驗(yàn)證報(bào)告 29《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》編制說明1任務(wù)來源根據(jù)《廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)關(guān)于下達(dá)2022年第四十六批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)〔2022〕99號(hào)）文件精神，由廣西環(huán)境科學(xué)學(xué)會(huì)提出，廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站、廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、上海第二工業(yè)大學(xué)、廣東海洋大學(xué)、廣西壯族自治區(qū)欽州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、廣西藍(lán)合創(chuàng)訊數(shù)據(jù)科技有限公司共同起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（項(xiàng)目編號(hào)：2022-4802）。2標(biāo)準(zhǔn)制定的必要性和意義2.1類固醇激素的分類、來源及危害類固醇激素是一類由膽固醇合成代謝具有生物活性的化合物。根據(jù)其生物學(xué)功能可以分為性激素和腎上腺皮質(zhì)激素。性激素主要包括雌激素、雄激素和孕激素，腎上腺皮質(zhì)激素包括糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，許多類固醇激素藥物已經(jīng)廣泛用于人類和動(dòng)物的治療。人工合成的糖皮質(zhì)激素如地塞米松、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍等廣泛用于治療各種炎癥包括關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、哮喘、支氣管炎、皮疹、過敏、鼻子和眼睛的炎癥。人工合成的孕激素如炔諾酮，炔諾孕酮等用于避孕治療、子宮異常出血、更年期癥狀和某些癌癥治療。人工合成的雄激素如康力龍，甲睪酮，群勃龍等不僅用于臨床治療，還在養(yǎng)殖業(yè)尤其是肉牛養(yǎng)殖中作為雄性促生長(zhǎng)劑的使用以及用于提高運(yùn)動(dòng)員成績(jī)的促進(jìn)劑。環(huán)境中的類固醇激素主要來自于人和動(dòng)物的排泄物如尿液和糞便以及人工合成的類固醇激素的使用和排放。經(jīng)過人和動(dòng)物排泄過程，類固醇激素會(huì)通過污水處理廠出水口或者人為直接排放進(jìn)入到環(huán)境中。類固醇激素是內(nèi)分泌干擾物的一種，由于其在極低的濃度下（ng/L）的水平就可能對(duì)生物體的生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，導(dǎo)致生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)失衡，因而備受公眾和科學(xué)界的廣泛關(guān)注。前人對(duì)于環(huán)境中類固醇激素進(jìn)行了大量研究，在地表水、污水處理廠、水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)、畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)、污泥、土壤ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>馬帥</Author><Year>2015</Year><RecNum>4182</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[16]</style></DisplayText><record><rec-number>4182</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aez99x0a89af5feafavxszpq0rtfz5zdpsfa">4182</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>馬帥</author><author>韓平</author><author>馮曉元</author></authors></contributors><auth-address>北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京);</auth-address><titles><title>土壤環(huán)境中類固醇激素的來源、環(huán)境行為及檢測(cè)研究</title><secondary-title>農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全</secondary-title></titles><periodical><full-title>農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全</full-title></periodical><pages>41-46+62</pages><number>03</number><keywords><keyword>土壤</keyword><keyword>類固醇激素</keyword><keyword>來源</keyword><keyword>環(huán)境行為</keyword><keyword>檢驗(yàn)檢測(cè)</keyword></keywords><dates><year>2015</year></dates><isbn>1674-8255</isbn><call-num>11-5896/S</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[和生物體中均有檢出。Zhang等利用建模的方法估算7種類固醇激素在中國流域的排放量，并預(yù)測(cè)它們?cè)诃h(huán)境中的歸趨，發(fā)現(xiàn)類固醇激素每年總排泄量中人體排泄物占38%，動(dòng)物排泄物占62%，每年經(jīng)過處理進(jìn)入環(huán)境的類固醇激素排放量是2486噸，大約有83%的類固醇激素進(jìn)入水體環(huán)境。海洋是地球水域集中地，人類生產(chǎn)和使用的大部分類固醇激素會(huì)通過入海污染源途徑進(jìn)入海洋環(huán)境。近年來，海洋環(huán)境中類固醇激素也越來越受到學(xué)者的重視，部分學(xué)者對(duì)愛爾蘭都柏林灣、南海海陵灣、南海流沙灣、廣東大亞灣等和廣西北海灣等研究了類固醇激素污染分布特征及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。其中在南海海陵灣區(qū)域類固醇激素的檢出濃度范圍為0.04～40ng·L-1，風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)等級(jí)依次從污水排放場(chǎng)到碼頭、養(yǎng)殖區(qū)、旅游區(qū)再到近海地區(qū)降低。2.2本標(biāo)準(zhǔn)研究的目標(biāo)化合物的基本信息本標(biāo)準(zhǔn)研究的目標(biāo)化合物的基本信息如下表2-1。表2-1本標(biāo)準(zhǔn)研究的目標(biāo)化合物的基本信息化合物英文名稱CAS號(hào)分子量分子式結(jié)構(gòu)式理化性質(zhì)諾龍Nondrolone434-22-0274.398C18H26O2結(jié)晶固體，熔點(diǎn)：120-125oC雄烯二酮Androstensdione63-05-8286.41C19H26O2熔點(diǎn)：170-173oC表睪酮EpiTestosterone481-30-1288.42C19H28O2白色或奶油色白色結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)：218-220oC甲睪酮17-Methyltestosterone58-18-4302.451C20H30O2白色結(jié)晶性粉末，無臭，無味，溶于乙醇、甲醇、乙醚和其他大多數(shù)有機(jī)溶劑，微溶于植物油，幾乎不溶于水，熔點(diǎn)：162-168oC炔諾酮Norethindrone68-22-4298.42C20H26O2白色結(jié)晶粉末，不溶于水，微溶于乙醇，略溶于丙酮，溶于氯仿，熔點(diǎn)：205-206oC孕酮(黃體酮)Progesterone57-83-0314.46C21H30O2白色結(jié)晶性粉末，無臭，溶于醇、丙酮和二氧六環(huán)，微溶于植物油，不溶于水，熔點(diǎn)：128-132oC甲地孕酮Megestrol3562-63-8342.47C22H30O3白色或微黃色結(jié)晶性粉末，無臭。在空氣中穩(wěn)定。熔點(diǎn)202～209℃，極易溶于氯仿，溶于丙酮，略溶于乙酸乙酯，微溶于無水乙醇，不溶于水甲羥孕酮Medroxyprogesterone520-85-4344.5C22H32O3白色或類白色結(jié)晶性粉末，無臭。不溶于水，易溶于氯仿，微溶于無水乙醇。熔點(diǎn)202～208℃可的松Cortisone53-06-5360.44C21H28O5白色結(jié)晶性粉末，溶于乙醇、丙酮、和冷甲醇，極少溶于乙醚、苯和氯仿，微溶于水（25℃，28mg/100ml），水溶液呈中性。在濃硫酸中呈深紅色溶液，并有深綠色熒光。熔點(diǎn)：223-228oC氫化可的松（皮質(zhì)醇）Hydrocortisone50-23-7362.46C21H30O5白色或類白色結(jié)晶性粉末，不溶于水，難溶于乙醚，微溶于氯仿，溶于丙酮、乙醇地塞米松Dexamethason50-02-2392.46C22H29FO5白色或類白色結(jié)晶性粉末，無臭，甲醇、乙醇、丙酮或二氧六環(huán)中略溶，在三氯甲烷中微溶，在乙醚中極微溶解，在水中幾乎不溶，熔點(diǎn)：255-264oC雌酮(雌酚酮)Estrone53-16-7270.37C18H22O2白色板狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末幾乎不溶于水，溶于\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"二氧六環(huán)、\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"吡啶和氫氧化堿溶液，微溶于乙醇(1：400)、\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"丙酮、苯、\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"氯仿、乙醚和\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"植物油。17-α雌二醇17alpha-Estradiol57-91-0272.38C18H24O2粉末，溶于乙醇、丙酮及堿性水溶液，略微溶于乙醚及氯仿，不溶于水及稀酸。熔點(diǎn)：176-180oC17β-雌二醇(雌二醇)

17β-Estradiolum50-28-2272.38C18H24O2白色或乳白色無臭結(jié)晶性粉末；無臭。在\t"/item/17%CE%B2-%E9%9B%8C%E4%BA%8C%E9%86%87/_blank"二氧六環(huán)、丙酮及其他有機(jī)溶劑溶解，在乙醇中略溶，不溶于水。雌三醇Estriol50-27-1288.38C18H24O3白色結(jié)晶粉末，難溶于水，微溶于乙醇(1：500)、乙醚、氯仿、二氧六環(huán)和植物油，易溶于吡啶和氫氧化堿溶液。熔點(diǎn)：280-282oC17a-乙炔雌二醇(炔雌醇)17A-ethinylestradiol4717-40-2296.40C20H24O2無色針狀晶體，幾乎不溶于水，能溶乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、二嗯烷2.2現(xiàn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施情況和存在問題2.2.1現(xiàn)行污染物分析方法標(biāo)準(zhǔn)的局限性國內(nèi)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)中針對(duì)海洋生物體中類固醇激素的測(cè)定目前仍是空白，國外美國EPA1694利用HPLC-MS/MS技術(shù)，采用同位素標(biāo)識(shí)物為內(nèi)標(biāo)物定量測(cè)定環(huán)境樣品中的藥物及個(gè)人護(hù)理用品，適用于廢水、地表水、地下水、固廢不同環(huán)境基體，但也僅是分析抗生素。2.2.2污染物分析儀器、設(shè)備、方法等的最新進(jìn)展環(huán)境中類固醇激素的分析方法主要有：免疫分析法(Immunoassay)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC－MS)、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC－MS)和氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(GC－MS/MS)。免疫分析法對(duì)于具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)的激素時(shí)，傳統(tǒng)的免疫法的選擇性不高，導(dǎo)致準(zhǔn)確率降低和交叉反應(yīng)，除此之外還有靈敏度低、低通量等的缺陷而使其使用受限。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀具有高靈敏度、選擇性好、能效高等優(yōu)點(diǎn)解決了傳統(tǒng)免疫法的問題，但是類固醇激素目標(biāo)物揮發(fā)性差，使得樣品在分析前需要復(fù)雜的衍生化處理，使實(shí)驗(yàn)步驟變得繁瑣復(fù)雜也增加了實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間。液質(zhì)聯(lián)用法(LC－MS)、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)無需衍生化處理，不僅具有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的優(yōu)點(diǎn)，也簡(jiǎn)化了前處理技術(shù)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，超高液相色譜技術(shù)和三重四級(jí)桿質(zhì)譜技術(shù)大大的提高了儀器的靈敏度、同時(shí)滿足準(zhǔn)確定性?直接進(jìn)樣?快速檢測(cè)等要求。3國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究3.1主要國家、地區(qū)及國際組織相關(guān)分析方法研究經(jīng)查閱有相關(guān)科研文獻(xiàn)中涉及到海洋生物體中類固醇激素的測(cè)定方法。金偉等用氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定水和生物體中的雄烯二酮（MP）、雙氫睪酮、睪酮和孕酮，4種目標(biāo)化合物檢出限分別為0.1～0.5ng·L-1和0.6～0.8ng·g-1,定量限分別為0.4～1.8ng·L-1和1.9～2.6ng·g-1,加標(biāo)回收率分別為89.3％～101.4％和77.3％～92.1％。馮慧等采用超聲輔助萃取-吸附劑凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同步檢測(cè)環(huán)境固體樣品中22種甾體激素，方法檢出限為0.025～0.696μg·kg-1，加標(biāo)回收率達(dá)到63.5%以上。周永順等建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）同時(shí)檢測(cè)生物體中24種皮質(zhì)類固醇激素（CSs）的分析方法，結(jié)果為24種CSs的平均回收率為64.9%～125.1%。3.2國內(nèi)相關(guān)分析方法研究關(guān)于類固醇激素的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，目前國內(nèi)還沒有測(cè)定海洋生物體中的這類藥物方法，但在化妝品、動(dòng)物源性食品中的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法較多，見表3-1。表3-1化妝品、動(dòng)物源食品中類固醇激素的標(biāo)準(zhǔn)方法方法出處方法號(hào)目標(biāo)化合物前處理分析方法檢出限適用范圍中國檢驗(yàn)檢疫總局GB/T21981-2008雄烯二酮、甲睪酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、甲羥孕酮、孕酮、可的松、氫化可的松等超聲提取→SPE柱凈化高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法0.4～2.0μg/kg豬肉、牛奶等動(dòng)物源食品中國檢驗(yàn)檢疫總局GB/T22957-2008糖皮質(zhì)激素溶劑提取→SPE柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法0.2～1.0μg/kg河豚魚、鰻魚、烤鰻中國檢驗(yàn)檢疫總局GB/T34918-2017性激素溶劑提取→SPE柱凈化超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法0.156mg/kg化妝品中國檢驗(yàn)檢疫總局GB/T40154-2021糖皮質(zhì)激素超聲提取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法0.03μg/g化妝品中國檢驗(yàn)檢疫總局SN/T1980-2007孕激素超聲提取→SPE柱凈化高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法1.0～2.0μg/kg動(dòng)物源性食品中國檢驗(yàn)檢疫總局SN/T2222-2008糖皮質(zhì)激素培養(yǎng)-提取→SPE柱凈化高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法0.75～10μg/kg動(dòng)物源性食品中國檢驗(yàn)檢疫總局SN/T2677-2010雄性激素提取→SPE柱凈化高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法0.001～0.01mg/kg動(dòng)物源性食品農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告-2-2008糖皮質(zhì)激素提取→SPE柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法\動(dòng)物源性食品農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部1063號(hào)公告-5-2008糖皮質(zhì)激素提取→SPE柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法\飼料農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部282號(hào)公告-1-2020雌激素提取→SPE柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法\飼料4標(biāo)準(zhǔn)編制工作過程4.1成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》項(xiàng)目任務(wù)下達(dá)后，立即成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，制定標(biāo)準(zhǔn)編寫方案，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作。為高質(zhì)量編制團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)編制工作組分工如下，見表4-1。表4-1標(biāo)準(zhǔn)編制小組分工主要起草人(單位)承擔(dān)的工作任朝興（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，負(fù)責(zé)項(xiàng)目申請(qǐng)立項(xiàng)、整體構(gòu)思、編制思路及整體定位、項(xiàng)目技術(shù)把控及項(xiàng)目的整體組織和推進(jìn)等。任朝興（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）藍(lán)文陸（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）張際標(biāo)（廣東海洋大學(xué)）對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行撰寫與修改；按專家提出的意見修改標(biāo)準(zhǔn)文本；匯總和撰寫編制說明，匯總征求意見，撰寫標(biāo)準(zhǔn)解讀、上報(bào)函等技術(shù)資料，協(xié)調(diào)有關(guān)單位方法驗(yàn)證工作。韋業(yè)（廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心）王其春（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）房琴（上海第二工業(yè)大學(xué)）張鵬（廣東海洋大學(xué)）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的研制工作：包括實(shí)驗(yàn)方案以及方法文本、研制報(bào)告、編制說明的撰寫并征集意見等工作。龍慧琴（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）賀亮（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）房琴（上海第二工業(yè)大學(xué)）吳鑫（廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心）蘇子幸（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）張文武（廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心）楊爽（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）陳燕（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）負(fù)責(zé)采樣、分析工作、監(jiān)測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。鄧元秋（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）王永峰（廣西壯族自治區(qū)欽州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心）黃仕英（廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心）王永峰（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）宋寶（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）趙利榮（廣東海洋大學(xué)）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證工作：包括驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)證報(bào)告的撰寫及校核工作。藍(lán)文陸（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站）高桂蘭（上海第二工業(yè)大學(xué)）吳茂銀（廣西藍(lán)合創(chuàng)訊數(shù)據(jù)科技有限公司）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)文本的校核工作：包括標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明的校核工作。4.2查詢國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料標(biāo)準(zhǔn)編制小組根據(jù)國家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)修訂工作管理辦法的相關(guān)規(guī)定，檢索、查詢和收集國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料，了解掌握測(cè)定分析方法的國內(nèi)外最新技術(shù)發(fā)展情況，對(duì)現(xiàn)有各種方法和監(jiān)測(cè)工作需求開展調(diào)查研究。通過調(diào)研了解到目前國外尚無海洋生物體中類固醇激素的限值標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)分析方法，美國環(huán)保署（EPA）頒布了采用高分辨氣相色譜/高分辨質(zhì)譜分析水、土壤、生物體和生物體中的類固醇和激素（EPAmethed1698）。該方法利用GC-MS/MS技術(shù)，采用同位素標(biāo)識(shí)物為內(nèi)標(biāo)物定量測(cè)定環(huán)境樣品中類固醇激素。國內(nèi)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)體系中針對(duì)海洋生物體中類固醇激素的測(cè)定目前仍是空白，但有針對(duì)動(dòng)物源食品、化妝品中此類藥物的分析方法標(biāo)準(zhǔn)。4.3確定標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)路線，制訂原則2022年6月，編寫項(xiàng)目任務(wù)計(jì)劃，確定了本標(biāo)準(zhǔn)的具體內(nèi)容、原則、技術(shù)路線等內(nèi)容，明確了生物體中的類固醇激素成分為本標(biāo)準(zhǔn)的分析對(duì)象。采用超聲波提取和固相萃取凈化預(yù)處理技術(shù)，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用分析方法，提高分析的準(zhǔn)確度和靈敏度。4.4編寫標(biāo)準(zhǔn)草稿和編制說明草稿2023年6月，本標(biāo)準(zhǔn)編制組經(jīng)過大量文獻(xiàn)調(diào)研和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定海洋生物體中類固醇激素的方法，編制完成了《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)方法文本。4.5方法驗(yàn)證工作2023年6月-12月，組織了6家有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證，在收回了全部的驗(yàn)證報(bào)告基礎(chǔ)上，進(jìn)行了數(shù)據(jù)的匯總和分析整理工作，并編寫完成了《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》驗(yàn)證匯總報(bào)告。4.6編寫標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明2023年12月，編寫《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的標(biāo)準(zhǔn)文本征求意見稿及編制說明，并對(duì)文本和編制說明進(jìn)行修改。5標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則和技術(shù)路線5.1標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則1）方法的檢出限和測(cè)定范圍滿足相關(guān)環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)保工作的要求。2）方法準(zhǔn)確可靠，滿足各項(xiàng)方法特性指標(biāo)的要求。3）方法具有普遍適用性，易于推廣使用。5.2標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍和主要技術(shù)內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)適用于海洋生物體中類固醇激素的測(cè)定。使用固相萃取技術(shù)，選擇不同的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，對(duì)物質(zhì)中的目標(biāo)成分進(jìn)行選擇性萃取，利用LC-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，獲得滿意的回收率，并驗(yàn)證固相萃取技術(shù)作為樣品前處理技術(shù)的可行性。5.3標(biāo)準(zhǔn)制修訂的技術(shù)路線《海洋《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》選擇6家具有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證形成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)方法適用性研究實(shí)際樣品測(cè)試建立《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》樣品前處理方法研究選擇6家具有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證形成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)方法適用性研究實(shí)際樣品測(cè)試建立《海洋生物體類固醇激素的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》樣品前處理方法研究樣品采集、運(yùn)輸與保存儀器分析與方法研究樣品采集、運(yùn)輸與保存儀器分析與方法研究質(zhì)量控制與質(zhì)量保證技術(shù)研究參照文獻(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)際試驗(yàn)情況，確定采樣與保存技術(shù)建立液相色譜分離方法，考察色譜柱類型、梯度洗脫優(yōu)化等條件考察超聲波提取條件和固相萃取凈化參數(shù)質(zhì)量控制與質(zhì)量保證技術(shù)研究參照文獻(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)際試驗(yàn)情況，確定采樣與保存技術(shù)建立液相色譜分離方法，考察色譜柱類型、梯度洗脫優(yōu)化等條件考察超聲波提取條件和固相萃取凈化參數(shù)建立質(zhì)譜分析方法，選擇母離子和相應(yīng)子離子，優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能等重要參數(shù)。建立質(zhì)譜分析方法，選擇母離子和相應(yīng)子離子，優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能等重要參數(shù)?？闪炕笜?biāo)包括：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)、平行樣品的相對(duì)偏差、實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率、方法檢出限等可量化指標(biāo)包括：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)、平行樣品的相對(duì)偏差、實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率、方法檢出限等6方法研究報(bào)告6.1方法研究的目標(biāo)建立適用于海洋生物體中類固醇激素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。6.2方法原理采用超聲波提取技術(shù)對(duì)海洋生物體進(jìn)行前處理，用高效液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）檢測(cè)樣品中的類固醇激素化合物，按多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式，根據(jù)保留時(shí)間和特征離子定性，內(nèi)標(biāo)法定量。6.3試劑和材料6.3.1實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水。6.3.2試劑為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜純化學(xué)試劑，在使用前均進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)，滿足方法要求才可使用。6.3.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等均為購置市售有證標(biāo)準(zhǔn)品。6.3.4本方法使用市售商品化固相萃取柱HLB柱，填料為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，通用于非極性到極性化合物。6.4儀器的選擇本標(biāo)準(zhǔn)制定組通過調(diào)研國內(nèi)外文獻(xiàn)及試驗(yàn)摸索，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定類固醇激素，既免去了繁瑣的衍生化前處理過程，只需萃取富集，又具備較高的靈敏度。6.5樣品6.5.1采樣器皿的洗滌對(duì)所有與樣品直接接觸的器皿，均應(yīng)采取措施保證其潔凈度，避免造成污染或干擾。6.5.2采樣步驟樣品采集參照《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運(yùn)輸》（GB17378.3-2007和《近岸海域環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范第五部分近岸海域生物質(zhì)量監(jiān)測(cè)》（HJ442.5-2020）的相關(guān)規(guī)定，制定樣品采集方法及質(zhì)控措施，用預(yù)先洗滌干凈并烘干的旋蓋廣口棕色玻璃瓶盛裝樣品。6.5.3樣品的保存采集的樣品應(yīng)盡快分析，確需保存時(shí)，應(yīng)按照GB17378.3的相關(guān)規(guī)定保存。6.5.4冷凍干燥除去樣品中的石子、貝殼、玻璃等異物，取適量樣品進(jìn)行冷凍干燥。冷凍干燥后的樣品一部分用于測(cè)定含水率，一部分用于前處理。6.5.5含水率的測(cè)定生物體樣品含水率的測(cè)定按照GB17378.5執(zhí)行。6.5.6超聲波提取調(diào)節(jié)超聲波功率，以保證試樣在提取時(shí)能夠完全被翻動(dòng)。6.5.7固相萃取凈化不同固相萃取柱的比較由于類固醇激素化合物具有親酯性，而HLB柱填料為親水親酯型聚合物，C18柱填料是鍵合硅膠材料，C18柱和HLB柱均具有較好的穩(wěn)定性，均能用于環(huán)境內(nèi)分泌污染物的檢測(cè)。但C18柱的pH耐受范圍為2-8，而HLB柱的pH耐受范圍為1-14，耐受范圍寬。再者C18柱具有疏水性質(zhì)，而HLB柱具有親水性質(zhì)，所以在使用過程中如果出現(xiàn)小柱干涸的情況，C18柱會(huì)影響回收率，而HLB柱不會(huì)。通過空白加標(biāo)回收率結(jié)果，C18柱對(duì)雄烯二酮和炔諾酮的吸附效果不如HLB柱好，綜上，本實(shí)驗(yàn)室選取HLB柱。淋洗液的種類淋洗要洗掉固定相內(nèi)不需要的樣品組分，所以淋洗液要略強(qiáng)于或等于上樣溶劑，淋洗液多為水。實(shí)驗(yàn)采用10%甲醇-水淋洗時(shí)，目標(biāo)化合物已有少量損失，故實(shí)驗(yàn)采用純水作為淋洗液。洗脫液的選擇實(shí)驗(yàn)還考察了甲醇和乙酸乙酯的配比對(duì)目標(biāo)化合物回收率水平的影響。結(jié)果表明，甲醇和乙酸乙酯作為洗脫液配比為1:1時(shí)，回收率最高。最終選擇甲酸-乙酸乙酯溶液（1:1）作為洗脫液。6.6分析步驟本方法采用超聲波提取樣品，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水中目標(biāo)物。方法包括樣品采集、樣品提取、凈化、儀器分析、數(shù)據(jù)處理和質(zhì)量管理等方面的內(nèi)容。6.6.1液相色譜條件甲酸可以增加氫離子濃度，促進(jìn)[M+H]+分子離子峰的形成，提高離子化效率和靈敏度，同時(shí)也會(huì)抑制離子化效率。當(dāng)水相中添加了甲酸后，各組分的色譜峰形變窄，色譜峰形對(duì)稱，目標(biāo)化合物的色譜峰峰形明顯改善，響應(yīng)更強(qiáng)，根據(jù)廠商多年實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，加酸濃度為0.1%。同時(shí)我們還對(duì)流動(dòng)相梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，由于雄烯二酮和炔諾酮的保留時(shí)間一致，未能使它們的色譜峰達(dá)到完全分離，其他組分均能達(dá)到基線分離?？紤]到我們使用的是質(zhì)譜檢測(cè)器，采用的是多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，對(duì)未達(dá)到基本分離的目標(biāo)化合物也能進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析，不影響分析結(jié)果。6.6.2質(zhì)譜條件優(yōu)化采用電噴霧電離源（ESI）在正離子模式下對(duì)雄激素、孕激素和糖皮質(zhì)激素化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，均有較好的響應(yīng)。選定[M+H]+為母離子，進(jìn)行選擇性離子掃描（SIM），以確定源內(nèi)碎裂電壓，再進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，以不同的碰撞能量將待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子打碎，尋找子離子碎片。采用MRM模式，以子離子響應(yīng)最強(qiáng)時(shí)的參數(shù)來確定碰撞能量，表1為目標(biāo)化合物的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件。表6-1類固醇激素的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件化合物名稱母離子m/z子離子m/z駐留時(shí)間s錐孔電壓V碰撞能eV雄激素諾龍（Nondrolone）275.2109.1*4.723525257.33510雄烯二酮

（Androstensdione）287.396.84.754024108.9*4023表睪酮

（Epitestosterone）289.496.9*5.303525108.93527睪酮-D3

（Testosterone-D3）292.397.0*4.923020109.03025甲睪酮

（17-Methyltestosterone）303.297.25.203323109.2*3323孕激素炔諾酮

（Norethindrone）299.2109.1*4.793827231.13820炔諾酮-d6（替代物）

（Norethindrone-d6）305.3113.0*4.763525237.03517孕酮(黃體酮)

（Progesterone）315.297.1*5.612823297.12816孕酮(黃體酮)-D9

（Progesterone-D9）324.4100.2*5.582820113.12820甲地孕酮

（Megetrol）343.397.0*5.282525224.02525甲羥孕酮

（Medroxyprogesterone）345.297.1*5.452626123.22624糖皮質(zhì)激素可的松（Cortisone）359.2121.03.953027163.1*3025氫化可的松（皮質(zhì)醇）（Hydrocortisone）363.2309.24.113014327.2*3015氫化可的松-1,2-d2（Cortisone-1,2-d2）365.1311.24.093014329.2*3014地塞米松

（Dexamethason）393.2355.2*4.453010373.23011雌激素雌酮(雌酚酮)Estrone269.2142.94.023048144.9*303617-α雌二醇17-alpha-Estradiol271.2144.9*4.143040239.2303917β-雌二醇(雌二醇)17-beat-Estradiol271.1144．9*4.003040182.93036雌三醇Estriol287.2145.03.183039171.0*3037雌三醇-D3Estriol-D3290.2147.0*3.172540173.02531注：帶*的為定量離子，對(duì)于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。注：帶*的為定量離子，對(duì)于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。6.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線配制質(zhì)量濃度分別為0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20μg/、50μg/L和100μg/L的類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列（此為參考濃度）。在該濃度范圍內(nèi)各組分的相關(guān)系數(shù)均大于0.995。圖6-1類固醇激素總離子流色譜圖6.6.4方法檢出限按照《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ168-2020）的相關(guān)規(guī)定，連續(xù)分析7個(gè)接近于檢出限濃度（1.0μg/kg）的實(shí)驗(yàn)室空白加標(biāo)樣品，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差S。用公式:MDL=S×t(n-l,0.99)，（t（6,0.99）=3.143）進(jìn)行計(jì)算。其中：t(n-l,0.99)為置信度為99%、自由度為n-1時(shí)的t值；n為重復(fù)分析的樣品數(shù)。測(cè)定下限為4倍檢出限。經(jīng)全過程分析，數(shù)據(jù)結(jié)果見表6-2。表6-2方法檢出限計(jì)算結(jié)果（取樣量2g，n=7）單位：μg/kg化合物測(cè)定值平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差檢出限測(cè)定下限1234567諾龍70.20.8雄烯二酮50.20.8表睪酮70.20.8甲睪酮70.20.8炔諾酮80.20.8孕酮1.00.70.270.83.2甲地孕酮1.03.2甲羥孕酮0.81.0可的松40.41.6氫化可的松20.72.8地塞米松50.20.8雌酮0.91.01.00.91.00.91.00.90.060.20.817-α雌二醇50.10.417β-雌二醇1.01.20.070.20.8雌三醇.5方法的精密度對(duì)三個(gè)濃度水平分別為低濃度（5.0μg/kg）、中濃度（10.0μg/kg）、高濃度（25.0μg/kg）類固醇激素加標(biāo)樣品進(jìn)行了精密度測(cè)試（見表6-3到表6-5），每個(gè)濃度水平配制6份平行樣品。從表中可以看出，低、中、高濃度測(cè)試的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.0%～17.5%、7.4%～20.1%、5.4%～22.2%，說明方法的精密度良好。表6-3低濃度樣品測(cè)試的精密度數(shù)據(jù)化合物測(cè)定值（μg/kg)平均值（μg/kg)標(biāo)準(zhǔn)偏差（μg/kg)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)123456諾龍4.03.73.83.33.44.13.70.328.6雄烯二酮4.34.0113.1表睪酮5.00.5512.8甲睪酮4.00.256.2炔諾酮3.90.5514.2孕酮4.10.4210.4甲地孕酮4.30.4410.3甲羥孕酮4.50.4510.1可的松4.10.4511.0氫化可的松3.24.0721.3地塞米松4.64.04.24.00.4912.4雌酮4.50.368.017-α雌二醇4.60.418.917β-雌二醇4.30.6013.8雌三醇4.30.276.4表6-4中濃度樣品測(cè)試的精密度數(shù)據(jù)化合物測(cè)定值（μg/kg)平均值（μg/kg)標(biāo)準(zhǔn)偏差（μg/kg)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)123456諾龍8.81.0912.4雄烯二酮7.80.9812.6表睪酮7.71.0413.4甲睪酮7.91.2215.6炔諾酮8.10.9411.6孕酮8.00.729.0甲地孕酮7.80.8010.3甲羥孕酮8.08.07.28.00.536.6可的松7.39.007.2氫化可的松7.01.0713.4地塞米松8.40.809.5雌酮9.21.1012.017-α雌二醇9.10.9410.417β-雌二醇9.00.899.9雌三醇8.710.0310.8表6-5高濃度樣品測(cè)試的精密度數(shù)據(jù)化合物測(cè)定值（μg/Kg)平均值（μg/Kg)標(biāo)準(zhǔn)偏差（μg/Kg)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)123456諾龍25.326.717.820.319.426.022.63.8517.1雄烯二酮24.618.222.422.821.121.0表睪酮25.625.018.322.23.0913.9甲睪酮19.216.520.822.024.417.820.12.8814.3炔諾酮17.617.117.918.323.3712.2孕酮16.823.017.017.415.015.9甲地孕酮21.825.024.226.322.321.623.51.938.2甲羥孕酮21.523.818.825.020.318.421.32.6712.6可的松21.820.424.719.118.317.320.32.7013.4氫化可的松22.928.525.022.618.622.323.33.314.0地塞米松20.121.720.325.025.324.422.82.3810.4雌酮25.226.921.122.322.459.117-α雌二醇25.625.118.420.322.220.822.12.812.817β-雌二醇28.023.921.820.721.7212.9雌三醇22.724.020.120.819.119.421.01.9方法的正確度分別加入低濃度（10.0ng）、中濃度（20.0ng）、高濃度（50.0ng）類固醇激素配制樣品，進(jìn)行正確度測(cè)試（見表6-6到表6-8），每個(gè)濃度水平配制6份平行樣品。從表中可以看出，低中高三種不同質(zhì)量的加標(biāo)樣品，加標(biāo)回收率范圍分別為75.0%～91.0%、78.0%～104%、75.2%～105%，說明方法的正確度良好。表6-6低濃度樣品測(cè)試的正確度數(shù)據(jù)化合物測(cè)定值（μg/kg)平均值（μg/kg)回收率(%)123456諾龍8.074.3雄烯二酮8.58.010.49.393.3表睪酮10.085.3甲睪酮8.180.8炔諾酮7.57.09.57.777.2孕酮7.09.28.09.081.5甲地孕酮9.59.07.78.686.0甲羥孕酮9.689.7可的松8.282.3氫化可的松6.48.09.58.282.2地塞米松7.979.2雌酮9.089.717-α雌二醇9.092.217β-雌二醇7.486.3雌三醇9.085.2表6-7中濃度樣品測(cè)試的正確度數(shù)據(jù)化合物測(cè)定值（μg/kg)平均值（μg/kg)回收率(%)123456諾龍16.219.618.020.217.514.317.688.2雄烯二酮17.517.212.015.615.415.815.677.9表睪酮17.218.813.615.014.214.015.577.3甲睪酮15.212.416.016.319.814.515.778.5炔諾酮13.518.514.616.217.616.916.281.1孕酮17.017.415.816.815.413.516.079.9甲地孕酮13.515.717.117.515.414.015.577.7甲羥孕酮16.016.017.216.815.214.315.979.6可的松14.618.017.516.516.016.716.682.8氫化可的松13.718.718.314.016.6地塞米松18.217.517.215.018.514.816.984.3雌酮18.419.317.518.491.817-α雌二醇20.318.317.519.218.714.818.190.717β-雌二醇19.818.215.019.418.416.817.989.7雌三醇17.320.017.315.415.018.417.286.2表6-8高濃度樣品測(cè)試的正確度數(shù)據(jù)化合物測(cè)定值（μg/kg)平均值（μg/kg)回收率(%)123456諾龍50.553.435.640.538.852.045.190.3雄烯二酮49.236.444.845.542.242.043.486.7表睪酮51.250.036.544.388.7甲睪酮38.432.941.644.048.735.640.280.4炔諾酮36.546.536.237.474.8孕酮36.546.536.237.474.8甲地孕酮43.650.048.452.644.5甲羥孕酮43.047.637.650.040.536.842.685.2可的松43.640.849.438.236.534.540.581.0氫化可的松43.640.849.438.236.534.540.581.0地塞米松40.243.440.650.050.648.745.691.2雌酮50.453.842.244.644.748.147.394.617-α雌二醇50.453.842.244.644.748.147.394.617β-雌二醇56.047.843.541.443.340.145.490.7雌三醇45.448.040.241.538.238.842.084.06.7結(jié)果計(jì)算與表示6.7.1定性分析在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)；每種化合物的質(zhì)譜定性離子至少應(yīng)包括一個(gè)母離子和兩個(gè)子離子，且樣品中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差不超過表6-9規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。表6-9定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差單位：%相對(duì)離子豐度KK＞5020＜K＜5010＜K＜20K≤10允許最大偏差202530506.7.2定量分析采用內(nèi)標(biāo)法定量，根據(jù)平均相對(duì)響應(yīng)因子計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)系列第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物的相對(duì)響應(yīng)因子RRF，按照公式（1）計(jì)算?！?）式中：RRFi——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物的相對(duì)響應(yīng)因子，無量綱；

Ai——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物定量離子的峰面積（或峰高）；

Ais——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)定量離子的定量離子的峰面積（或峰高）；

——標(biāo)準(zhǔn)系列中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/L；

——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，μg/L。目標(biāo)化合物或替代物的平均相對(duì)響應(yīng)因子用公式（2）計(jì)算?！?）式中：——目標(biāo)化合物或替代物的平均相對(duì)響應(yīng)因子，無量綱；RRFi——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物的相對(duì)響應(yīng)因子，無量綱；

n——標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)數(shù)。試樣中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，按公式（3）計(jì)算?！?）式中：——試樣中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，μg/L；Ax——試樣中目標(biāo)化合物或替代物的峰面積（或峰高）；Ais——試樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積，（或峰高）；——試樣中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/L；——目標(biāo)化合物或替代物的平均相對(duì)響應(yīng)因子，無量綱；樣品中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度按公式（4）計(jì)算。……（4）式中：——樣品中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，單位為微克每千克（μg/kg）；

——試樣中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，單位為微克每升（μg/L）；

V1——試樣定容體積，單位為毫升（mL）；m——取樣量，單位為克（g）；wH2O——干樣含水率（%）6.7.3結(jié)果表示測(cè)定結(jié)果小數(shù)點(diǎn)后位數(shù)的保留與方法檢出限一致，最多保留三位有效數(shù)字。7方法驗(yàn)證7.1方法驗(yàn)證方案7.1.1參與方法驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室、驗(yàn)證人員的基本情況組織6家實(shí)驗(yàn)室參加了方法驗(yàn)證工作，具體參加人員名單如下表7-1。表7-1參加驗(yàn)證的人員情況登記表姓名性別年齡職務(wù)或職稱所學(xué)專業(yè)從事相關(guān)分析工作年限驗(yàn)證單位韋業(yè)男42工程師環(huán)境工程14廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)監(jiān)測(cè)中心吳鑫男38副科長(zhǎng)生物技術(shù)7廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心張文武男25一級(jí)科員環(huán)境工程3廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心黃仕英女46工程師應(yīng)用化學(xué)13廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心高桂蘭女47教授分析化學(xué)21上海第二工業(yè)大學(xué)房琴女25/資源與環(huán)境6上海第二工業(yè)大學(xué)陳帥男36副教授環(huán)境工程9上海第二工業(yè)大學(xué)張雅迪女22/資源與環(huán)境1上海第二工業(yè)大學(xué)竇立群男23/資源與環(huán)境5上海第二工業(yè)大學(xué)張鵬男35副教授海洋化學(xué)3廣東海洋大學(xué)張際標(biāo)男52教授海洋化學(xué)20廣東海洋大學(xué)趙利容女46副教授海洋化學(xué)14廣東海洋大學(xué)李業(yè)燕女36高級(jí)工程師環(huán)境科學(xué)11年廣西壯族自治區(qū)環(huán)境科學(xué)研究院宋寶男27助理工程師應(yīng)用化學(xué)3年廣西壯族自治區(qū)環(huán)境科學(xué)研究院根據(jù)影響方法的精密度和正確度的主要因素和數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求，編制方法驗(yàn)證報(bào)告，驗(yàn)證數(shù)據(jù)主要包括檢出限、測(cè)定下限、精密度以及實(shí)際樣品加標(biāo)回收率等。7.1.2方法驗(yàn)證方案如下：方法檢出限測(cè)定：配制濃度為1.0μg/kg空白加標(biāo)樣7份進(jìn)行全過程分析測(cè)定，計(jì)算7次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差S，此時(shí)檢出限公式MDL＝S×3.143。方法的測(cè)定下限：參照HJ168，以4倍方法檢出限確定為本方法目標(biāo)物的測(cè)定下限。方法精密度測(cè)定：配制濃度為5.0μg/kg、10.0μg/kg和25.0μg/kg的加標(biāo)樣品，每個(gè)濃度水平各6份平行樣進(jìn)行全過程分析，對(duì)上述測(cè)定結(jié)果后將各自6次的結(jié)果計(jì)算平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。加標(biāo)回收率：在生物體樣品加入標(biāo)準(zhǔn)溶液為10.0ng、20.0ng和50.0ng，平行配制6份，經(jīng)全過程分析測(cè)定，將6次測(cè)定結(jié)果分別計(jì)算平均值、加標(biāo)回收率。7.2方法驗(yàn)證過程（1）通過篩選確定有資質(zhì)方法驗(yàn)證單位。按照方法驗(yàn)證方案準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品，與驗(yàn)證單位確定驗(yàn)證時(shí)間。在方法驗(yàn)證前，確保參加驗(yàn)證的操作人員應(yīng)熟悉和掌握方法原理、操作步驟及流程。方法驗(yàn)證過程中所用的試劑和材料、儀器和設(shè)備及分析步驟應(yīng)符合方法相關(guān)要求。（2）《方法驗(yàn)證報(bào)告》見附件一。7.3方法驗(yàn)證結(jié)論（1）由于不同品牌、不同型號(hào)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀靈敏度可能會(huì)有差異，本標(biāo)準(zhǔn)在進(jìn)行方法驗(yàn)證時(shí)，盡可能選擇了覆蓋市場(chǎng)的不同品牌液質(zhì)聯(lián)用儀，獲得的數(shù)據(jù)能夠全面反映各種品牌型號(hào)儀器的檢出限水平。本方法檢出限為方法檢出限為0.5μg/kg～1.9μg/kg。（2）本課題組在進(jìn)行方法驗(yàn)證報(bào)告數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，異常值的檢驗(yàn)和處理按照GB/T6379.6-2009標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)未發(fā)現(xiàn)異常值。（3）方法精密度和準(zhǔn)確度統(tǒng)計(jì)結(jié)果能滿足方法特性指標(biāo)要求。詳細(xì)結(jié)果見附件《方法驗(yàn)證報(bào)告》。8重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)本文件研制過程中無重大分歧意見。9自我承諾承諾標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容和各項(xiàng)指標(biāo)不低于國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。也不存在內(nèi)容或某項(xiàng)指標(biāo)低于推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)的情況。參考文獻(xiàn)馬帥,韓平,馮曉元.土壤環(huán)境中類固醇激素的來源?環(huán)境行為及檢測(cè)研究[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全,2015(03):41-46+62.ZHONGR,ZOUH,GAOJ,etal.AcriticalreviewonthedistributionandecologicalriskassessmentofsteroidhormonesintheenvironmentinChina[J].SciTotalEnviron,2021,786:147452.LIUS,CHENH,ZHOUGJ,etal.Occurrence,source,analysisandriskassessmentofandrogens,glucocorticoidsandprogestagensintheHailingBayregion,SouthChinaSea[J].SciTotalEnviron,2015,536:99-107.KiddKA，BlanchfieldPJ，MillsKH，etal．Collapseofafishpopulationafterexposuretoasyntheticestrogen［J］．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2007，104(21):8897-8901．KugathasS,RunnallsTJ,SumpterJP.Metabolicandreproductiveeffectsofrelativelylowconcentrationsofbeclomethasonedipropionate,asyntheticglucocorticoid,onfatheadminnows[J].Environmentalscience&technology,2013,47(16):9487-9495.LarsenMG,BaatrupE.Functionalbehaviorandreproductioninandrogenicsexreversedzebrafish(Daniorerio)[J].EnvironmentalToxicologyandChemistry,2010,29(8):1828-1833.Kidd,K.A.,Graves,S.D.,McKee,G.I.,Dyszy,K.,Podemski,C.L.,2020.Effectsofwhole-lakeadditionsofethynylestradiolonleechpopulations.Environ.Toxicol.Chem.39(8),1608–1619.Kidd,K.A.,Paterson,M.J.,Rennie,M.D.,Podemski,C.L.,Findlay,D.L.,Blanchfield,P.J.,Liber,K.,2014.Directandindirectresponsesofafreshwaterfoodwebtoapotentsyntheticoestrogen.Phil.Trans.R.Soc.BBiol.Sci.369(1656),20130578./10.1098/rstb.2013.0578.LiuS,ChenH,XuXR,etal.Threeclassesofsteroidsintypicalfreshwateraquaculturefarms:Comparisontomarineaquaculturefarms[J].ScienceoftheTotalEnvironment,2017,609:942.DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.07.207.PeckM,GibsonRW,KortenkampA,etal.SedimentsaremajorsinksofsteroidalestrogensintwoUnitedKingdomrivers[J].EnvironmentalToxicologyandChemistry,2004,23(4):945-952.汪福順,劉叢強(qiáng),灌瑾,等.貴州阿哈水庫生物體中重金屬二次污染的趨勢(shì)分析[J].長(zhǎng)江流域資源與環(huán)境,2009,18(4):379-383.米曉霞,李思聰,王凱強(qiáng),等.豬血漿中33種類固醇激素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)）,2014,33(8):873-880.李貴洪,譚紅,梁發(fā)明等.環(huán)境水體中類固醇激素的分析方法研究進(jìn)展[J].貴州科學(xué),2016,34(02):64-69.ChenCY,WenTY,WangGS,etal.SciTotalEnviron,2007,378(3):352.KumarV,NakadaN,YasojimM,etal.Chemosphere,2009,77(10):1440.王玲.環(huán)境中類固醇類內(nèi)分泌干擾物的檢測(cè)技術(shù)及其降解行為研究[D].山東大學(xué),2007.DOI:10.7666/d.y1067759.馮慧,徐欣,彭鵬等.環(huán)境固體樣品中多種甾體激素的同步檢測(cè)方法及條件優(yōu)化[J].中國環(huán)境監(jiān)測(cè),2023,39(02):214-224.馬有寧,桂文君,程敬麗等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定斑馬魚性腺中13種類固醇激素[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2016,35(04):460-465.NeliusSwart,EdmundPool.Rapiddetectionofselectedsteroidhormonesfromsewageeffluentsus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