臍血干細胞分化與應(yīng)用

關(guān)于臍血干細胞分化與應(yīng)用“干細胞”的概念在數(shù)十年前就已有介紹，但是直到目前，仍然還無法從形態(tài)或表型界定干細胞，而只能根據(jù)其功能定義。干細胞具有兩種特定的功能。增殖功能指干細胞具有自我更新能力，可以生成更多的干細胞；分化功能則指干細胞能分化成為各種祖細胞，后者可以進一步分化成各種特定成熟細胞系。因此，目前干細胞的最好界定方法是功能學(xué)法。第2頁,共32頁，星期六，2024年，5月胚胎干細胞(embryonicstemcells,ES)被認為是最多能的干細胞群體，具有最大的發(fā)展?jié)撃?，對胚胎細胞或組織的利用還存在倫理學(xué)爭議。成體干細胞。在許多成人組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種干細胞群體存在，如骨髓中的造血干細胞，以及其他骨髓衍生干細胞(BMSC)能分化為血細胞和多種組織細胞。為了避免潛在的倫理學(xué)問題，克服免疫不相容性，在未來的組織工程中自身成人干細胞可能成為理想的選擇。臍帶血干細胞的特性和用途可能有效地替代骨髓和外周血。第3頁,共32頁，星期六，2024年，5月體外實驗技術(shù)以識別干細胞表面標記物作為基礎(chǔ)，如CD34、AC133、STRO-1和神經(jīng)營養(yǎng)素受體p75等已經(jīng)用于干細胞的純化實驗，包括細胞淘選、熒光激活細胞分類、免疫磁性選擇和免疫吸附柱分離等。目前有證據(jù)表明，如果利用某種單一的標記物分子進行干細胞分離，而對不表達該標記物的新干細胞群體尚未充分研究，則不能完全肯定分離結(jié)果。例如，干細胞活性與CD34分子在細胞膜上的表達不完全相關(guān)，小鼠體內(nèi)存在一大群“靜默”干細胞，它們不表達CD34分子但仍具有完整的重建能力。在人體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)存在類似的CD34陰性休眠生血干細胞。因此，在未來實驗中應(yīng)設(shè)計新的方案，以成熟細胞系的標記物作為細胞轉(zhuǎn)移基礎(chǔ)會更有效。第4頁,共32頁，星期六，2024年，5月為了克服干細胞數(shù)量少的不足，眾多學(xué)者已經(jīng)在探索干細胞的體外擴增方法。但是，如何在長期的擴增過程中使干細胞不分化而又保持其多系分化能力成為一大難題。在干細胞臨床實際應(yīng)用中，理論上認為需要一個無基質(zhì)、無血清的體外系統(tǒng)，并用已知的細胞因子和生長因子維持。白細胞介素-3(IL-3)、干細胞因子(SCF)和Flt-3配體(FL)具有非細胞系特異性的早期生血刺激作用，可用于臍血干細胞的增殖培養(yǎng)。血小板衍生生長因子(PDGF)-BB和表皮生長因子(EGF)是最有效的人類骨髓衍生干細胞克隆生長支持因子。從人類發(fā)育中的腦皮層中已成功分離出神經(jīng)前細胞，并利用表皮生長因子和纖維母細胞生長因子-2(FGF-2)使其擴增。進一步的研究，如系統(tǒng)性分析生長因子受體的表達，將有助于設(shè)計新的干細胞體外擴增培養(yǎng)方案。第5頁,共32頁，星期六，2024年，5月在干細胞研究中，熱點之一是調(diào)控細胞向預(yù)定群體分化。過去數(shù)年間，關(guān)于干細胞在體內(nèi)以及體外分化成各種成熟細胞的報道大批涌現(xiàn)。干細胞最重要的細胞外調(diào)控信號之一是生長和分化因子。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)家族成員對胚胎干細胞和神經(jīng)脊干細胞有顯著的促分化效應(yīng)，Wnt家族分子在多種不同的細胞分化中也起著重要作用。但是，由于還無法得到純化的功能性Wnt蛋白，對于多種Wnt因子的確切效應(yīng)的更深入研究受到了限制。除了各種分泌因子外，整合膜蛋白和整合素、細胞外基質(zhì)在干細胞調(diào)控微環(huán)境中也發(fā)揮作用。第6頁,共32頁，星期六，2024年，5月細胞產(chǎn)生的具有生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。產(chǎn)生和作用的高效性、多樣性、瞬時性。細胞因子的作用通過與細胞表面相應(yīng)受體結(jié)合而起作用。一般培養(yǎng)細胞中細胞因子的使用量為5ng~100ng/ml,有量效關(guān)系。細胞因子間有協(xié)同作用、相加作用、拮抗作用用于細胞增殖的細胞因子

造血干細胞：Flt-3ligand,SCF,TPO,IL-3,IL-7,IL-11

樹突狀細胞：GM-CSF,G-CSF,IL-1beta,IL-4,TNFalpha

神經(jīng)干細胞：EGF,FGF-basic

間充質(zhì)干細胞：EGF,PDGF-AA

胚胎干細胞：FGF-basic

用于細胞分化誘導(dǎo)的細胞因子

Activins,BMPs,Cripto-1,Dkk-1,FGF-8,GDFs,Lif,Nodal,Noggin,Notch,Shh,TGFbeta,Wnts第7頁,共32頁，星期六，2024年，5月第8頁,共32頁，星期六，2024年，5月造血干細胞CD133、CD34等+間充質(zhì)干細胞CD13、29、44、105等+SCF、CSF

、IL-3,6

等可刺激細胞擴增采用密度梯度離心法和貼壁法分離采用密度梯度離心法和免疫磁珠法分離調(diào)整培養(yǎng)基偏酸性，1%pen-strep不同誘導(dǎo)分化條件分化為不同細胞第9頁,共32頁，星期六，2024年，5月臍血造血干細胞的含量等于或超過骨髓。造血譜系標記,如CD3、CD14、CD19、CD34、CD45等呈陽性。在體外對臍血祖細胞進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)使用SCF加G-CSF、

GM-CSF、IL-3、IL-6等作為刺激因子培養(yǎng)

,細胞集落形成增加,臍血中的造血干細胞有更大的潛在分化和增殖能力。從臍血中分離出單核細胞,在體外培養(yǎng),貼壁細胞形態(tài)表現(xiàn)為破骨細胞樣細胞和間充質(zhì)樣細胞兩種,間充質(zhì)樣細胞表達多種間葉祖細胞(MPCs)的相關(guān)抗原(SH-2、SH-3、SH-4、ASMA、MABl470、CDl3、CD29、CD44、CD105)。用含2%和5%較低血清濃度的條件下,臍血單個核細胞可分化成較為均一的間充質(zhì)樣細胞,并可以在數(shù)量上擴增的同時,保持其多向分化的潛能，在一定條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞、心肌細胞、肝細胞等。第10頁,共32頁，星期六，2024年，5月采用MiniMACS分選系統(tǒng)分離臍血CD34+細胞,其純度可達到(83.13±10.73)%,得率一般為1%。采用新鮮的臍血分離CD34+單個核細胞。一般(2～5)×108臍血單個核細胞能分離出(3～5)×106CD34+細胞。第11頁,共32頁，星期六，2024年，5月臍血、成人外周血和骨髓CD34+含量（x±S）

標

本

標本數(shù)（n）

CD34+含量（%）

成人骨髓73.19±1.05*Δ

臍血

482.14±1.23**成人外周血

480.19±0.14

*骨髓與臍血比較P<0.05；**臍血與外周血比較P<0.001

Δ骨髓與外周血比較P<0.001

臍血中CD34+含量與新生兒性別、體重、臍血血象和產(chǎn)婦年齡的關(guān)系

（1）臍血中CD34+含量與新生兒性別關(guān)系：

男性CD34+細胞百分率為1.87±0.79

女性CD34+細胞百分率為2.51±1.49

兩者比較有顯著性差異（P<0.001），女性高于男性。

（2）新生兒體重、產(chǎn)婦年齡（24~39歲）與CD34+百分比無相關(guān)性（P>0.05）

（3）臍血血象與臍血CD34+細胞含量關(guān)系無相關(guān)性（P>0.05）第12頁,共32頁，星期六，2024年，5月

臍血和成人外周血淋巴細胞表型及NK細胞活性（x±S）

臍血成人血CD350.0±12.4Δ73.3±8.9CD440.1±12.440.7±7.1CD813.8±4.3Δ27.0±5.5CD4/CD83.2±1.5Δ1.6±0.4CD1616.9±6.2Δ11.9±6.3NK-A17.8±12.4Δ40.8±21.6

Δ臍血與成人血比較，P<0.01。

第13頁,共32頁，星期六，2024年，5月臍血清與成人外周血清中IL-2、TNFα、SIL-2R水平（x±S）

標本樣品數(shù)量IL-2（pg/ml）TNFα（pg/ml）SIL-2R（pg/ml）臍血404240181.4±113.35.51±0.92214.0±96.1成人血373537305.2±125.47.45±1.58112.1±72.5

P值<0.01<0.01<0.01不同血清培養(yǎng)體系中臍血CFU-GM產(chǎn)率（x±S，n=5）

刺激因子

臍血清臍血清+GM-CSF胎牛血清

胎牛血清+GM-CSF

集落產(chǎn)率/10.6±3.837.4±11.6*012.8±4.0

1×105

細胞

*臍血清與胎牛血清比較P<0.01

臍血清對臍血細胞有體外促增殖作用，而胎牛血清則無此作用，說明臍血清含有促CFU-GM生長的造血活性物質(zhì)。在培養(yǎng)體系中加入GM-CSF時，集落數(shù)都增加，但臍血清組增加顯著，說明臍血清中含有與外源性GM-CSF協(xié)同因子。

第14頁,共32頁，星期六，2024年，5月臍血清與成人外周血清中集落刺激活性（CSA）、白細胞介素3（IL-3）、粒巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）水平臍血、成人血清中CSA、IL-3、GM-CSF活性比較（x±S）

血清臍血清（U/ml）外周血清（U/ml）

CSA248.30±155.974.38±1.89GM-CSF197.78±111.01112.09±91.91*IL-3638.3±205.966.8±39.3

臍血中含有高水平的CSA，之中以IL-3含量為主，而GM-CSF含量很低。t值12.9，

P值<0.001

研究方法：1．粒系集落計數(shù)法

2．臍血粒巨噬細胞集落形成單位（CFU-GM）微量培養(yǎng)法

3．MTT法第15頁,共32頁，星期六，2024年，5月(1)來源豐富,易于獲得;(2)取血時對于母體和嬰兒均無痛苦;(3)臍血可以長期儲存

;(4)發(fā)生移植物抗宿主病的發(fā)生率低

;HLA-DR、CD80、CD86陰性表達;其中,HLA-DR位點是異基因移植時免疫排異反應(yīng)發(fā)生的主要位點;CD80和CD86是移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)生的最重要共刺激通路B7/CD28的信號分子。(5)臍血中含各種原始細胞如造血干細胞、間充質(zhì)干細胞,具有較強的增殖分化的能力;(6)臍血中各種病毒感染的幾率相對較少。近年來,臍血由于其獨特的生物學(xué)特點,儲存數(shù)量及進行臍血治療的患者日益增多。第16頁,共32頁，星期六，2024年，5月第17頁,共32頁，星期六，2024年，5月SCF/CSF/IL-3等刺激細胞擴增bFGF/EGF/NGF/IGF等促進細胞定向分化CD34+細胞向神經(jīng)元樣細胞的分化多種細胞因子的組合會更好。但細胞因子和細胞因子之間存在協(xié)同作用、拮抗作用、疊加作用等IL-3能促進G0期造血干細胞（靜默干細胞）進入細胞增殖周期，IL-6可協(xié)同IL-3支持多能干細胞分化增殖。第18頁,共32頁，星期六，2024年，5月臍血單個核細胞106/cm2

接種于MesencultTM培養(yǎng)液(StemCell公司)中,調(diào)整培養(yǎng)基偏酸性，1%pen-strep，37℃、5%CO2培養(yǎng)。1周后,更換培養(yǎng)基,棄掉未貼壁細胞。以后每3d換液1次。細胞長到80%融合時,用1∶1的2.5g/L的胰蛋白酶和0.2g/LEDTA混合液消化(在顯微鏡下控制消化時間),以8.0×103/cm2

的密度接種于傳代培養(yǎng)瓶中進行擴增培養(yǎng)。第19頁,共32頁，星期六，2024年，5月定向誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元樣細胞分化：取傳至第3代的MSCs按4×105/L密度接種于事先放置有消毒蓋玻片的六孔板內(nèi)制備細胞爬片，用含有1mmol/Lβ-巰基乙醇的DMEM（20％FCS）預(yù)誘導(dǎo)24h，PBS洗滌3遍后，換成含10g/L二甲基亞砜和100mmol/L丁化羥基苯甲醚的無血清DMEM進行誘導(dǎo)，每隔30分鐘在倒置相差顯微鏡觀察細胞型態(tài)變化。第20頁,共32頁，星期六，2024年，5月貼壁細胞以間充質(zhì)細胞為主，同時有大量破骨樣細胞傳代后，破骨樣細胞減少，逐漸形成MSCs傳代1-2周后，MSCs融合，增殖能力強第21頁,共32頁，星期六，2024年，5月第22頁,共32頁，星期六，2024年，5月心血管、腦血管、外周血管等缺血性病變引起多種臨床疾病，如冠心病、心肌梗塞、腦血栓、脈管炎、股骨頭壞死、糖尿病足等….10幾年前人們已開始血管再生的試驗研究和臨床應(yīng)用。如將VEGF質(zhì)粒直接注入閉塞的外周動脈,4周后血管造影顯示側(cè)支血管增加,多普勒超聲檢查示血流量增加80%,外周動脈閉塞的間歇性跛行和冠心病應(yīng)用中有明顯療效。近年,內(nèi)皮前體細胞(EPC)與血管新生的關(guān)系及在治療性血管新生中的作用受到特別的注意。第23頁,共32頁，星期六，2024年，5月成年后EPC主要分布于骨髓,外周血液中也有少量EPC,約為2～4EPC/ml,在急性心肌梗死時為10～40EPC/ml,臍帶血中可達1000～4000EPC/ml,其特異的細胞表面標志為CD34+、Flk21+與AC133+。VEGF是EPC的增殖與分化的必需誘導(dǎo)因子,GM-CSF也促進EPC的增生與分化,而血管抑制素(angiostatin)起抑制作用。此外,他汀類藥物可將EPC從骨髓動員至外周血并增加其功能與活性。動物實驗：

1）給后肢缺血的裸鼠注入人臍血EPC能顯著增加局部血流量與微血管密度。

2）給心肌梗死的裸鼠靜脈注射EPC可促進新血管的形成,并減少缺血心肌細胞的凋亡。

3）年幼(3月)小鼠骨髓EPC能促進老年(18月)小鼠的心肌血管增生與心臟功能改善。

4）將VEGF基因轉(zhuǎn)染至EPC,使后者具有更高的增殖活性與功能,動物實驗已證實,轉(zhuǎn)染有VEGF的EPC增加細胞的增殖與參與血管形成,促進缺血心肌與肢體的血管新生,達到改善功能與保護肢體的目的。

第24頁,共32頁，星期六，2024年，5月LygaseClosedCircleCohesiveEndsLinearDoubleStrandedOpenedCircle第25頁,共32頁，星期六，2024年，5月血管新生是當前醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究的熱點,治療性血管新生在心臟血管與外周血管狹窄的動物實驗中有很好的效果,并且已在數(shù)百例心與外周動脈缺血患者進行了臨床一、二期試驗治療,取得了一定的成績。但由于對人有效灌注所需的管腔面積要比實驗動物大得多,因此取得理想治療效果要困難得多。一些重要的問題尚待進一步解決:①確定合適的劑量以及更合理地聯(lián)合運用多種誘導(dǎo)因子?②延長轉(zhuǎn)染的基因在體內(nèi)的表達時間?③是否有使機體其他部位不該增生的血管增生的危險?

治療性血管新生為心與外周血管疾病的防治開辟了一個新的途徑,并可能特別適用于那些不能用藥物、介入和/或手術(shù)治療,或治療效果不好的患者。此外,這種新的治療方法也可促進創(chuàng)傷愈合與手術(shù)傷口愈合,將有廣泛的應(yīng)用前景。第26頁,共32頁，星期六，2024年，5月血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種內(nèi)皮細胞專一性絲裂原和血管新生強烈的刺激因子。內(nèi)皮細胞表面的兩個酪氨酸激酶受體Flt-1與Flt-1/KDR與VEGF結(jié)合后,傳導(dǎo)相應(yīng)的增殖與遷移信號,使內(nèi)皮細胞增殖,形成新的毛細血管并重構(gòu)與穩(wěn)定。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及其受體FGR2,血管生長素1(Ang-1)及其受體Tie-1與Tie-2,胎盤生長因子(PlGF),肝細胞生長因子(HGF),血管生成素(angiogenin)、血小板衍生生長因子(PDGF)與環(huán)氧化酶-2也是重要的促血管新生因子。這些因子相互協(xié)同,并且在細胞分化的不同階段發(fā)揮不同的作用。VEGF在血管新生的起始與維持階段都有作用,bFGF主要參與初期過程,而Ang-1、PlGF與PDGF主要影響血管的成熟與穩(wěn)定。第27頁,共32頁，星期六，2024年，5月Ficoll密度梯度離心法得臍血單個核細胞MACS法臍血CD34+單個核細胞分離細胞培養(yǎng):將分離所得CD34+和CD34-單個核細胞分別接種于60mm培養(yǎng)皿中,加入M-199培養(yǎng)基,20%FCS、牛腦提取物作為內(nèi)皮細胞生長補充,抗生素、生長因子VEGF30ng和bFGF24ng,于37℃,5%CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3、7、14