快速核酸檢測儀校準(zhǔn)規(guī)范

快速核酸檢測儀校準(zhǔn)規(guī)范1范圍本規(guī)范適用于基于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)或核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的快速核酸檢測儀的校準(zhǔn)。2引用文件本規(guī)范引用了下列文件：JJF1007—2007溫度計(jì)量名詞術(shù)語及定義JJF1101—2019環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備溫度、濕度參數(shù)校準(zhǔn)規(guī)范JJF1265—2022生物計(jì)量術(shù)語及定義JJF1527—2015聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范GB/T41407—2022微流控芯片核酸恒溫?cái)U(kuò)增儀技術(shù)要求YY/T1173—2010聚合酶鏈反應(yīng)分析儀凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本規(guī)范。3術(shù)語3.1快速核酸檢測儀rapidnucleicaciddetectors快速核酸檢測儀是基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)或核酸恒溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)的小型化、快速化、將核酸提取、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析等多個(gè)核酸檢測步驟整合到一個(gè)系統(tǒng)的核酸檢測設(shè)備。3.2實(shí)時(shí)熒光PCRreal-timechainreactionPCR在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）過程中，利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，熒光信號(hào)變量和擴(kuò)增產(chǎn)物變量成正比，并通過對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的PCR儀。3.3核酸恒溫?cái)U(kuò)增nucleicacidisothermalamplification由常溫升溫至一固定的擴(kuò)增高溫后，在該固定溫度下進(jìn)行核酸（包括DNA和RNA）體外快速復(fù)制放大的過程。注：因使用的聚合酶和引物的不同，擴(kuò)增的高溫的溫度值存在一定的差異，需要根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。3.4拷貝數(shù)copynumber特定基因在某一生物體基因組中所含的個(gè)數(shù)以及每個(gè)生物細(xì)胞中所具有的轉(zhuǎn)錄物（RNA）個(gè)數(shù)。3.5溫度偏差temperaturedeviation同一循環(huán)中，恒溫計(jì)時(shí)開始倒計(jì)時(shí)結(jié)束之間，每隔一定的時(shí)間數(shù)據(jù)采集儀所記錄溫度的平均值與模塊設(shè)定溫度的差值。3.6溫度波動(dòng)度temperaturefluctuation恒溫過程中模塊內(nèi)實(shí)測溫度隨時(shí)間的變化量。3.7模塊溫度均勻性u(píng)niformityofthermocontrol模塊對(duì)應(yīng)的樣本孔之間的溫度一致性。3.8溫度持續(xù)時(shí)間偏差durationdeviationofthermocontrol設(shè)定恒溫的時(shí)間與溫度測量數(shù)據(jù)采集到所記錄的恒溫（符合溫度顯示偏差要求時(shí)即為恒溫）的持續(xù)時(shí)間的差值。3.9檢測限limitofdetection指樣品中被測物能被定量測定的最低值。4概述快速核酸檢測儀（以下簡稱檢測儀）能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病毒特異性核酸序列的檢測，其檢測技術(shù)主要包括基于實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)和基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)兩種方式。檢測儀的技術(shù)原理是基于標(biāo)本前處理技術(shù)、核酸提取技術(shù)、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析技術(shù)，以及與之配套的核酸檢測試劑盒共同作用下，對(duì)樣本的RNA/DNA進(jìn)行提取，并在樣本中加入核苷酸、酶等試劑，對(duì)樣本中的目標(biāo)基因進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。當(dāng)樣本中含有病毒時(shí)，通過監(jiān)測在反應(yīng)體系中因加入熒光基團(tuán)而產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)被測樣本中的核酸進(jìn)行定性或定量檢測分析。檢測儀主要由反應(yīng)模塊、光源模塊、磁導(dǎo)模塊、加熱模塊、光電檢測系統(tǒng)、顯示模塊等部分組成，需與專用的核酸檢測試劑盒配套使用。5計(jì)量特性檢測儀計(jì)量特性見表1。表1快速核酸檢測儀計(jì)量特性計(jì)量特性實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)溫度偏差不超過±0.5℃不超過±0.5℃表1（續(xù)）計(jì)量特性實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)模塊溫度均勻性不大于1℃——溫度波動(dòng)度——不超過0.5℃平均升溫速率不小于3℃/s——平均降溫速率不小于2℃/s——溫度持續(xù)時(shí)間偏差不超過±5%不超過±5%檢測限不大于500copies/mL不大于500copies/mL樣本檢測重復(fù)性不大于5%不大于5%注：以上所有計(jì)量特性技術(shù)指標(biāo)僅提供參考，不適用于合格性判定。6校準(zhǔn)條件6.1環(huán)境條件環(huán)境溫度：（15～30)℃；相對(duì)濕度：（20～85）%。6.2測量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備測量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備技術(shù)指標(biāo)見表2。表2測量標(biāo)準(zhǔn)及其他設(shè)備技術(shù)指標(biāo)序號(hào)測量設(shè)備主要技術(shù)指標(biāo)1快速核酸檢測儀溫度校準(zhǔn)裝置溫度測量范圍：（0～120）℃；最大允許誤差：±0.1℃；采樣時(shí)間間隔：≤0.1s；分辨力不低于0.01℃。時(shí)間最大允許誤差：±1s/h；分辨力不低于1s。2新型冠狀病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ORFlab基因有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)N基因有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)3移液器測量范圍（0.5～10）μL、（10～50）μL、（20～100）μL、（100～1000）μL注：若快速核酸檢測儀用于檢測其他病原體可采用相應(yīng)的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。7校準(zhǔn)項(xiàng)目和校準(zhǔn)方法7.1校準(zhǔn)項(xiàng)目校準(zhǔn)項(xiàng)目見表3表3校準(zhǔn)項(xiàng)目一覽表校準(zhǔn)項(xiàng)目實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)溫度偏差++溫度波動(dòng)度-+模塊溫度均勻性+-平均升溫速率+-平均降溫速率+-溫度持續(xù)時(shí)間偏差++檢測限++樣本檢測重復(fù)性++注：+為校準(zhǔn)項(xiàng)目；－為非校準(zhǔn)項(xiàng)目。7.2溫度偏差首先將檢測儀開機(jī)預(yù)熱30min。對(duì)于獨(dú)立控溫模塊檢測儀可逐個(gè)模塊校準(zhǔn)或同時(shí)對(duì)多個(gè)模塊分別校準(zhǔn)，布點(diǎn)參照?qǐng)D1所示。非獨(dú)立控溫的檢測儀作為一個(gè)整體進(jìn)行溫度校準(zhǔn)，以8通道、16通道檢測儀為例，布點(diǎn)遵循均勻分布的原則，可參照?qǐng)D2和圖3所示，每增加8通道可增加3個(gè)點(diǎn)。多模塊或多通道的檢測儀以所有布點(diǎn)計(jì)算結(jié)果的最大值作為測量結(jié)果?；趯?shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的檢測儀控溫程序設(shè)置可參照表4進(jìn)行，設(shè)置溫度采樣間隔為0.1s?；诤怂岷銣?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測儀溫度設(shè)定程序可參照表5進(jìn)行。將溫度校準(zhǔn)裝置傳感器放入樣品槽中，啟動(dòng)溫度校準(zhǔn)裝置，自動(dòng)采集并記錄整個(gè)循環(huán)程序溫度數(shù)據(jù)。圖1獨(dú)立模塊快速核酸檢測儀布點(diǎn)示意圖圖28通道快速核酸檢測儀布點(diǎn)示意圖圖316通道快速核酸檢測儀布點(diǎn)示意圖表4基于實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)快速核酸檢測儀控溫程序步驟溫度設(shè)定點(diǎn)/℃溫度持續(xù)時(shí)間/s1501029010340104951054010670107601084010表5基于恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速核酸檢測儀控溫程序步驟溫度設(shè)定點(diǎn)/℃溫度持續(xù)時(shí)間/min溫度采樣間隔/s15510302601030溫度偏差按照公式（1）和公式（2）計(jì)算。（1）（2）溫度偏差，℃；——溫度設(shè)定值，℃；——測量點(diǎn)溫度實(shí)測值的平均值，℃；——測量點(diǎn)校準(zhǔn)裝置第i次的測量值，℃；——測量次數(shù)大于等于6。7.3溫度波動(dòng)度按照7.2中的布點(diǎn)規(guī)則和控溫程序，溫度波動(dòng)度按照公式（3）計(jì)算。（3）式中：——溫度波動(dòng)度，℃；——模塊恒溫時(shí)間內(nèi)實(shí)測的最高溫度，℃；——模塊恒溫時(shí)間內(nèi)實(shí)測的最低溫度，℃。模塊溫度均勻性模塊溫度均勻性按照公式（4）計(jì)算（4）式中：——模塊溫度均勻性，℃；——所有溫度傳感器測量值的最大值，℃；——所有溫度傳感器測量值的最小值，℃。7.5平均升溫速率按照7.2中的布點(diǎn)規(guī)則和控溫程序，在升溫過程中，取50℃±0.5℃范圍內(nèi)采集的第一任意溫度值，記為，取90℃±0.5℃范圍內(nèi)采集的第一任意溫度值，記為，從到的時(shí)間記為t，計(jì)算溫度從升溫至過程中的升溫速率，如圖4所示。平均升溫速率按照公式（5）計(jì)算。（5）式中：——平均升溫速率，℃/s；——50℃±0.5℃范圍內(nèi)采集的第一任意溫度值，℃；——90℃±0.5℃范圍內(nèi)采集的第一任意溫度值，℃；——從到達(dá)的時(shí)間，s。圖4升降溫速率取點(diǎn)示意圖7.6平均降溫速率按照7.2中的布點(diǎn)規(guī)則和控溫程序，在降溫過程中，取90℃±0.5℃范圍內(nèi)采集的第一任意溫度值，記為，取50℃±0.5℃范圍內(nèi)采集的第一任意溫度值，記為，從到的時(shí)間記為，計(jì)算溫度從降溫至過程中的降溫速率，如圖4所示。平均降溫速率按照公式（6）計(jì)算。（6）式中：——平均降溫速率，℃/s；——50℃±0.5℃范圍內(nèi)采集的第一任意溫度值，℃；——90℃±0.5℃范圍內(nèi)采集的第一任意溫度值，℃；——從到達(dá)的時(shí)間，s。7.7溫度持續(xù)時(shí)間偏差按照7.2中的布點(diǎn)規(guī)則和控溫程序，將所采集溫度數(shù)據(jù)按照?qǐng)D5進(jìn)行t1、t2取點(diǎn)，溫度持續(xù)時(shí)間偏差按照公式（7）和公式（8）計(jì)算。（7）（8）式中：——持續(xù)時(shí)間偏差，s；——實(shí)際持續(xù)時(shí)間，s——設(shè)定持續(xù)時(shí)間，st1——校準(zhǔn)裝置采集到的第一個(gè)到達(dá)設(shè)定溫度的時(shí)刻；t2——校準(zhǔn)裝置采集到的最后一個(gè)維持設(shè)定溫度的時(shí)刻。t1、t27.8檢測限檢查根據(jù)儀器廠家聲明的檢測限濃度（比如500copies/mL），將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋到該濃度作為樣本進(jìn)行上機(jī)檢測。以體積為50μL、濃度為5000copies/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為例，具體稀釋過程為：根據(jù)濃度和體積的換算關(guān)系，用相應(yīng)規(guī)格的移液器分別吸取50μL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和450μL稀釋液進(jìn)行混合，得到體積為500μL、濃度為500copies/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋溶液。稀釋液可根據(jù)情況選用儀器廠家提供的稀釋液或者被驗(yàn)證的陰性血清，且整個(gè)稀釋過程要在潔凈環(huán)境下操作。參照送檢快速核酸檢測儀說明書設(shè)定程序，將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣本，對(duì)同一模塊或通道進(jìn)行2次檢測，分別記錄ORFlab基因和N基因的擴(kuò)增結(jié)果，與儀器廠家聲明的檢測限進(jìn)行比較。多模塊或多通道的檢測儀可以根據(jù)用戶要求進(jìn)行。7.9樣本檢測重復(fù)性參照送檢檢測儀說明書設(shè)定程序，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋到高于檢測限的一定濃度（比如1000copies/mL）作為樣本，對(duì)同一模塊或通道進(jìn)行6次或6次以上重復(fù)性檢測，分別記錄ORFlab基因和N基因的Ct值。樣本檢測重復(fù)性用變異系數(shù)CV表示，按照公式（9）計(jì)算。（9）式中：CV——變異系數(shù)；SD——標(biāo)準(zhǔn)差；——測量結(jié)果的平均值。多模塊或多通道的檢測儀可以根據(jù)用戶要求進(jìn)行。8校準(zhǔn)結(jié)果表達(dá)經(jīng)校準(zhǔn)的檢測儀出具校準(zhǔn)證書，給出校準(zhǔn)結(jié)果以及校準(zhǔn)不確定度。校準(zhǔn)記錄格式（推薦性）見附錄A，校準(zhǔn)證書內(nèi)頁的信息和格式（推薦性）見附錄B。9復(fù)校時(shí)間間隔由于復(fù)校時(shí)間間隔的長短是由檢測儀的使用情況、使用者、儀器本身質(zhì)量等諸因素所決定，因此使用單位可根據(jù)實(shí)際使用情況決定復(fù)校時(shí)間間隔，建議復(fù)校時(shí)間間隔不超過1年。附錄A校準(zhǔn)記錄格式（推薦性）□實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)□恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)委托單位證書編號(hào)器具名稱制造廠型號(hào)規(guī)格校準(zhǔn)地點(diǎn)出廠編號(hào)溫度技術(shù)依據(jù)相對(duì)濕度校準(zhǔn)人員核驗(yàn)人員校準(zhǔn)日期備注校準(zhǔn)使用的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)器標(biāo)準(zhǔn)器名稱測量范圍不確定度/準(zhǔn)確度等級(jí)/最大允許誤差證書編號(hào)及有效期1.溫度偏差℃溫度設(shè)定值實(shí)測值平均值溫度偏差123456n溫度偏差的擴(kuò)展不確定度：2.溫度波動(dòng)度℃溫度設(shè)定值?Tf3.模塊溫度均勻性℃溫度設(shè)定值?Tu4.平均升溫速率溫度設(shè)定值實(shí)測值/℃50℃90℃時(shí)間/s平均升溫速率/（℃/s）5.平均降溫速率溫度設(shè)定值實(shí)測值/℃90℃50℃時(shí)間/s平均降溫速率/（℃/s）6.溫度持續(xù)時(shí)間偏差s時(shí)間設(shè)定值實(shí)測值偏差7.檢測限檢查基因類型核酸濃度/（copies/μL）擴(kuò)增結(jié)果檢查結(jié)果8.樣本檢測重復(fù)性基因類型核酸濃度/（copies/μL）Ct值變異系數(shù)附錄B校準(zhǔn)證書內(nèi)頁格式（推薦性）圖B.1布點(diǎn)圖校準(zhǔn)結(jié)果：校準(zhǔn)項(xiàng)目校準(zhǔn)結(jié)果溫度偏差/℃溫度波動(dòng)度/℃模塊溫度均勻性/℃平均升溫速率/（℃/s）平均降溫速率/（℃/s）溫度持續(xù)時(shí)間偏差/s檢測限檢查樣本檢測重復(fù)性溫度偏差的擴(kuò)展不確定度：附錄C快速核酸檢測儀溫度偏差測量結(jié)果不確定度評(píng)定示例C.1概述C.1.1被校儀器：快速核酸檢測儀。C.1.2測量標(biāo)準(zhǔn)：快速核酸檢測儀溫度校準(zhǔn)裝置，最大允許誤差：±0.1℃。C.1.3環(huán)境條件：環(huán)境溫度：22℃；濕度：42％RH。C.1.4測量方法：依據(jù)本規(guī)范中的規(guī)定。C.2測量模型