色譜分析-薄層色譜（分析化學(xué)課件）

1、薄層板的制備在制備吸附薄層色譜中，固定相的選擇十分重要。其選擇應(yīng)從兩個方面考慮：①被分離物質(zhì)的性質(zhì)（如極性、酸堿性、溶解度等）②吸附劑吸附能力的強(qiáng)弱。若被分離物質(zhì)極性強(qiáng)，應(yīng)選擇吸附能力弱的吸附劑；若被分離物質(zhì)極性弱，應(yīng)選擇吸附能力強(qiáng)的吸附劑。薄層色譜測定步驟吸附劑就其性質(zhì)而言，可分為有機(jī)吸附劑（如聚酰胺、纖維素和葡聚糖等）和無機(jī)吸附劑（如氧化鋁、硅膠、硅藻土、磷酸鈣、磷酸鎂和硅酸鈣鎂等）。最常用的是氧化鋁和硅膠，它們的吸附性能好，適用于多種化合物的分離。常用的吸附劑厚度為0.5～2.5mm，色譜板的尺寸一般為20cm×20cm或20cm×40cm。薄層厚度與薄層板的尺寸限制了PTLC可以分離的樣品量。1.0mm厚的硅膠板最多可上樣5mg／cm2。硅膠是最常用的吸附劑，可用它來分離親脂或親水性物質(zhì)。薄層色譜測定步驟2、流動相（展開劑）的選擇選擇展開劑主要是由被分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活性以及展開劑本身的極性來決定.①一般先選擇單一溶劑作展開劑；對難分離組分，則需要使用二元、三元甚至多元的溶劑；②先用一種極性較小的溶劑為基礎(chǔ)溶劑展開混合物，若展開不好，用極性較大的溶劑與前一溶劑混合，調(diào)整極性，直到選出合適的展開劑組合為止。

薄層色譜測定步驟

③對普通酸性組分：特別是離解度較大的弱酸性組分應(yīng)在展開劑中加入一定比例的酸，可防止拖尾現(xiàn)象；④對于堿性物質(zhì)：如某些生物堿，多數(shù)情況是選用氧化鋁為吸附劑，選用中性溶劑為展開劑。若采用硅膠為吸附劑，則選用堿性展開劑為宜；但對某些堿性較弱的生物堿可使用中性展開劑。理想的展開劑應(yīng)能使混合物分離后各組分的Rf值相差盡可能大。各組分理想的比移值在0.2-0.8之間。薄層色譜測定步驟3、點樣

①選用揮發(fā)性溶劑(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等)；②最好用與展開劑極性相似的溶劑，應(yīng)盡量使點樣后溶劑能迅速揮發(fā)，以減少色斑的擴(kuò)散。水溶性樣品，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或乙醇稀釋定容。薄層色譜測定步驟

點樣示意圖反應(yīng)混合液樣1-2cm點樣直徑≤2mm1cm≤點間距≤1.5cm原料樣薄層色譜測定步驟

③注意事項：A樣品的濃度應(yīng)在5％～10％左右。點樣帶應(yīng)盡可能狹窄，以獲得更好的分離效果。溶解樣品的溶劑要盡量避免用水；B適當(dāng)?shù)狞c樣量，可使斑點集中，點樣量過大，易拖尾或擴(kuò)散；點樣過少，不易檢出。一般是幾微克到幾十微克；C盡量用小的點樣管，如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點樣管。點的斑點較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。薄層色譜測定步驟4.展開展開劑要接觸到吸附劑下沿，但切勿接觸到樣點。薄層板呈傾斜狀。蓋上蓋子，容器密閉。防止邊緣效應(yīng)。薄層色譜測定步驟5.顯色常見的顯色方法：①物理顯色法②生化顯色法③化學(xué)顯色法

薄層色譜測定步驟6.樣品的收集在確定色帶位置后，可用刮刀或一與真空收集器相連的管形刮離器將該色帶吸附劑從板上刮下。后一種方法并不適用于敏感的物質(zhì)，因吸附劑持續(xù)與氣流接觸，所含的純化合物有被氧化的危險。薄層色譜測定步驟注意：A無論采用何種回收方法，都應(yīng)以極性盡可能小的溶劑將化合物從吸附劑中提取出來(1g吸附劑約使用5mL溶劑)。B化合物與吸附劑接觸的時間越長，被破壞的可能性越大?？上扔?型玻璃砂芯漏斗過濾洗脫液，然后再用孔徑為0.2～0.45μm的濾膜過濾。C甲醇可溶解硅膠及其中含有的一些雜質(zhì)，因此，并不適用于從吸附劑上洗脫被分離的化合物，較合適的溶劑是丙酮、乙醇或氯仿。薄層色譜測定步驟薄層色譜定量分析方法定量分析：1、間接定量法：

將TLC已分離的物質(zhì)斑點洗脫下來，再借助分光光度法、HPLC法或者GC法對該洗脫物質(zhì)進(jìn)行定量分析；2、直接定量法：

（1）斑點面積測定法：以半透明紙掃TLC圖上的斑點界限，然后測定其面積。將斑點面積同平行操作的標(biāo)準(zhǔn)樣品面積進(jìn)行定量；（2）目測法：

將被測樣品和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液點在同一薄層板上，顯色后，將被測樣品的斑點面積大小和顏色與標(biāo)準(zhǔn)系列相比較，可推測樣品的含量范圍。該方法適用于對常規(guī)大量樣品的重復(fù)分析。

現(xiàn)薄層掃描儀定量是薄層色譜定量的主要方法：用一定波長、一定強(qiáng)度的光束照射到薄層板上被分離組分的色斑上，用儀器進(jìn)行掃描后，求出色斑中組分的含量。薄層色譜定量分析方法

薄層色譜又稱薄層層析（ThinLayerChromatography）：是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進(jìn)行分離、鑒定和定量的一種層析分離技術(shù)。常用TLC表示。屬于固-液色譜的一種。分離機(jī)制：吸附（分配，離子交換，空間排阻）；特點：分析快速、靈敏、顯色方便；應(yīng)用：中藥成分的鑒定和藥物雜質(zhì)檢查。

薄層色譜法概述分離原理：

吸附薄層色譜是應(yīng)用最廣泛的。樣品中的A、B兩個組分，吸附系數(shù)大的組分在薄層色譜的遷移速率慢，而吸附系數(shù)小的組分在薄層色譜的遷移速率快，經(jīng)過一定時間的完全分離，在薄層色譜上形成兩個斑點，從而進(jìn)行分離。

薄層色譜法概述比移值（Rf）

被分離混合物一、比移值和相對比移值比移值與相對比移值說明：1.分配系數(shù)K↑大，Rf↓小2.Rf范圍：0<Rf<1

Rf=0.2~0.8（常用）0.3~0.5（最佳）

二、相對比移值Rs比移值與相對比移值影響Rf值的因素：展開溫度：室溫對分離影響不明顯。其他條件相同，溫度低比溫度高時展開慢，分離好。薄層厚度：板厚度變化對比移值影響明顯；厚度達(dá)0.2mm時，影響較??；在0.25mm時，分離效果最佳。吸附劑含水量：與吸附劑的種類、使用時的加水量、風(fēng)干時間、活化溫度和活化時間等因素有關(guān)。比移值與相對比移值層析缸中蒸氣：缸中蒸氣未達(dá)飽和時，比移值不能重現(xiàn)。為使缸中蒸氣飽和，可以在缸內(nèi)壁附上一層濾紙，讓展開劑全部濕潤；把展開劑放入層析缸一段時間后再放薄層板；盡可能在恒定溫度下層析。其他影響因素：展開劑的pH、展開時間、展開距離、樣品濃度、點樣量、薄層板所用吸附劑中的粘合劑的種類和用量等，都有可能影響樣品組分比移值的大小。比移值與相對比移值實驗原理實驗儀器與試劑實驗步驟實驗數(shù)據(jù)的處理二甲基黃與羅丹明B的薄層色譜的鑒別一、實驗原理：

薄層吸附色譜是將吸附劑均勻地涂在玻璃板上做固定相，經(jīng)干燥活化后點上樣品，以適當(dāng)極性的有機(jī)溶劑作為展開劑。由于組分的性質(zhì)差異，易被固定相吸附的組分移動慢，難被固定相吸附組分移動快。經(jīng)過一段時間的展開后，不同組分彼此分開，形成相互分離的斑點。

本實驗以硅膠為固定相，以95%乙醇溶劑為展開劑分離二甲基黃、羅丹明B以及兩者的混合物。二甲基黃與羅丹明B的薄層色譜的鑒別

二、實驗儀器及試劑：儀器：玻璃片、毛細(xì)管和層析缸；

試劑：二甲基黃溶液、羅丹明B溶液，兩者的混合液、硅膠、0.5%羧甲基纖維素鈉；

二甲基黃與羅丹明B的薄層色譜的鑒別三、實驗步驟：鋪板點樣展開計算Rf值

采用傾注法：稱取5g硅膠于研缽中，并加入8mL的CMC-Na，調(diào)成糊狀，將調(diào)好的糊狀物倒在玻璃板上，用手搖晃，使糊狀均勻地分布于整塊薄板上，