《中級(jí)食品檢驗(yàn)工 》課件-實(shí)訓(xùn)任務(wù)8 焙烤食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)

實(shí)訓(xùn)任務(wù)7焙烤食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)高級(jí)食品檢驗(yàn)工目錄一

儀器和用具二

培養(yǎng)基與試劑三

操作方法沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，是引起人類和動(dòng)物發(fā)病及食物中毒的主要病原菌。沙門氏菌在水中能存活2~3周，在糞便中可存活1~2個(gè)月，在冰凍土壤中可過冬，對(duì)熱抵抗力不強(qiáng)，60℃處理15min即可將其殺死。膽鹽、煌綠及其他染料對(duì)本屬細(xì)菌的抑制作用較其他腸道桿菌小，用這些染料制備腸道選擇性培養(yǎng)基有利用分離沙門氏菌。沙門氏菌屬的形態(tài)特征是：革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，無英膜，大多數(shù)有動(dòng)力，周生鞭毛。其生化反應(yīng)特征是：①吲哚、尿素分解及V·P實(shí)驗(yàn)均呈陰性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，產(chǎn)生HS；②不分解蔗糖和水楊素，不利用丙二酸鈉，不液化明膠，且在含有氰化鉀的培養(yǎng)基內(nèi)不能生長，使賴氨酸、精氨酸、鳥氨酸脫羧基；③在普通培養(yǎng)基上形成中等大小、無色透明、表面光滑的菌落，菌落邊緣整齊或呈鋸齒形；④不分解乳糖,在腸道鑒別培養(yǎng)基上形成無色菌落。焙烤食品中的沙門氏菌的含量較少，加工過程常常使其受損傷而處于瀕死狀態(tài)。為了分離焙烤食品中的沙門氏菌，必須對(duì)樣品進(jìn)行增菌處理，用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的沙門氏菌恢復(fù)活力，再進(jìn)行選擇性增菌，即增殖沙門氏菌，而抑制大多數(shù)其他細(xì)菌。檢驗(yàn)沙門氏菌當(dāng)前通用的方法分為5個(gè)基本步驟：前增菌、選擇性增菌、選擇性平板分離、生化鑒定實(shí)驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定。紫外光燈：波長366mm，功率大于或等于6W。放大鏡：3~4倍放大能力。毛細(xì)滴管。一、儀器和用具二、培養(yǎng)基與試劑(1)緩沖蛋白胨水。

成分如下:蛋白胨10.0g

氯化鈉5.0g

磷酸二氫鉀1.5g磷酸氫二鈉9.0g

蒸餾水(pH=7.2)1000mL制法：將各成分配好后，裝入大燒杯中，于121℃高壓滅菌15min，備用。臨用時(shí)，在無菌條件下每瓶分裝225mL，供沙門氏菌前增菌使用。二、培養(yǎng)基與試劑(2)氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液。

成分如下:甲液：胰蛋白胨5.0g

氯化鈉8.0g磷酸二氫鉀1.6g

蒸餾水1000mL乙液：氯化鎂(化學(xué)純)40.0g

蒸餾水100mL丙液：40gL孔雀綠水溶液制法：將各成分配好后，于121℃高壓滅菌15min，備用。臨用時(shí)，取甲液90mL、乙液9mL、丙液0.9mL，在無菌條件下混合即可。二、培養(yǎng)基與試劑(3)四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液。

成分如下:多胨或脲胨5.0g

膽鹽1.0g

硫代硫酸鈉300g碳酸鈣10.0g

蒸餾水1000mL制法：將各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，每瓶分裝100mL，再加2mL碘液(6g碘+5g碘化鉀+20mL蒸餾水)和1mL1g/L的煌綠溶液。二、培養(yǎng)基與試劑(4)亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液。

成分如下:蛋白胨5.0g

乳糖4.0g

亞硒酸氫鈉4.0g磷酸二氫鉀4.5g

磷酸氫二鈉5.5g

L-胱氨酸0.01g

蒸餾水1000mL

制法：將除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸以外的所有成分溶解于900mL蒸餾水中，加熱煮沸后冷卻。另將亞硒酸氫鈉溶解于100mL蒸餾水中，加熱煮沸后冷卻。在無菌條件下將兩種溶液混合，再加入1mL10g/L的L-胱氨酸的氫氧化納溶液(0.1gL-胱氨酸+1.5mL1mol/L的氫氧化的溶液+8.5mL蒸餾水)，混勻，然后每瓶分裝100mL，此時(shí)溶液pH值應(yīng)為7.0±0.1。二、培養(yǎng)基與試劑(5)SS瓊脂培養(yǎng)基[含1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖]。

成分加下牛肉浸膏5.0g

蛋白胨50g

乳糖10.0g蔗糖10.0g

膽鹽8.5g

檸檬酸鈉8.5g硫代硫酸鈉1.0g

檸檬酸亞鐵1.0g

煌綠1.0g中性紅0.025g瓊脂13.5g

蒸餾水1000mL制法：將各成分溶于水，煮沸4~5min，最終溶液pH=7.0±0.2，冷卻至55-66℃傾于平板上。二、培養(yǎng)基與試劑(6)HE瓊脂培養(yǎng)基。

成分如下:蛋白胨12.0g

酵母浸出物3.0g

乳糖12.0g蔗糖12.0g

水楊素2.0g

混合膽鹽9.0g氯化鈉5.0g

硫代硫酸鈉5.0g

檸檬酸鐵銨1.5g溴麝香草酚藍(lán)0.065g

酸性復(fù)紅0.1g

瓊脂14.0g

蒸餾水1000mL制法：將各成分溶于水，煮沸45min，最終溶液pH=7.5±0.2，冷卻至55~60℃，傾注于平板上。二、培養(yǎng)基與試劑(7)MUCAP試劑(用4-甲基傘形酮辛酯配成的試劑的縮寫)。按生產(chǎn)者提供的使用說明制備工作稀釋液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中，備用。(8)氧化酶試液與試紙。

①氧化酶試液：甲液為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的α-萘酚乙醇溶液；乙液為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的二甲基對(duì)苯二胺草酸鹽水溶液。

②氧化酶試紙：先將甲液與乙液等量混合，然后取定性濾紙，浸透混合液后，于70-80℃的烘箱內(nèi)烘干，剪成適當(dāng)大小的紙條，密封于塑料袋或瓶中，儲(chǔ)存于4℃的冰箱中，備用。二、培養(yǎng)基與試劑(9)三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基。

成分如下:牛肉浸膏5.0g

蛋白胨200g

乳糖10.0g蔗糖10.0g

葡萄糖1.0g

氯化鈉5.0g硫代硫酸鈉0.2g

硫酸亞鐵銨0.2g

瓊脂12.0g

酚紅0.025g

蒸餾水(pH=7.4)1000mL制法：將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值，加入瓊脂，加熱熔化后，再加入12.5mL2g/L的酚紅水溶液，混勻，然后分裝于小試管中，于121℃高壓滅菌15min，擺置高層斜面?zhèn)溆?。?）前增菌與選擇性增菌將樣品用均質(zhì)器以8000-10000r/min的轉(zhuǎn)速打1min，或用乳缽和滅菌砂磨碎。稱取25g打碎樣品，置于裝有225mL緩沖蛋白胨水的300mL錐形瓶內(nèi)，于36±1℃培養(yǎng)4h。從中吸取10m樣品，轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液中，于42℃培養(yǎng)18-24h。同時(shí)另取10mL樣品，轉(zhuǎn)種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中，于36±1℃培養(yǎng)18-24h。三、操作方法（2)分離培養(yǎng)將增菌培養(yǎng)液據(jù)勻，挑取一接種環(huán)，劃線接種于ss和HE瓊脂培養(yǎng)基各一個(gè)中,于36±1℃培養(yǎng)22~26h。觀察各瓊脂平板上有無可疑沙門氏菌菌落，若無可疑菌落，則應(yīng)再繼續(xù)培養(yǎng)22~26h。沙門氏菌的菌落特征見下表1。三、操作方法ss平板HE平板圓形,邊緣整齊;淡黃色,半透明,有成無黑色中心;周國培養(yǎng)基為遺明演黃色圓形,邊緣整齊;藍(lán)綠色至藍(lán)色,有或無黑色中心;周圍培養(yǎng)基為透明墨綠色表1

沙門氏菌的菌落特征三、操作方法（3)測定

從培養(yǎng)的分離培養(yǎng)基上選可疑沙門氏菌菌落(盡量選較大、分離較好的單個(gè)菌落)，用玻璃筆做好標(biāo)記并編號(hào)。

用毛細(xì)滴管吸取MUCAP試劑，加一滴于已編號(hào)的菌落上。待一個(gè)平板的被檢菌落全部滴加試劑后，將平板拿到紫外光燈下于366nm處檢視，發(fā)藍(lán)色熒光的為MUCAP實(shí)驗(yàn)陽性，將陽性菌落號(hào)記錄下來。

用接種環(huán)挑取熒光反應(yīng)為陽性的菌落，涂于氧化酶試紙上，觀察涂菌點(diǎn)是否變藍(lán)。在10min內(nèi)變藍(lán)的為氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性，不變色的為陰性。三、操作方法(4)結(jié)果的報(bào)告

對(duì)于MUCAP實(shí)驗(yàn)陰性的樣品，報(bào)告為“未檢出沙門氏菌”；對(duì)于MUCAP實(shí)驗(yàn)陽性、氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性的樣品，繼續(xù)進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定。(5)生化學(xué)鑒定

挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，穿刺接種在三糖鐵瓊脂斜面和底層，同時(shí)再接種蛋白胨水(供靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)用)、尿素瓊脂培養(yǎng)基(pH=7.2)、氰化鉀培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基各1管，于36±1℃培養(yǎng)18~24h，必要時(shí)可延長至48h。之后按表2判斷生化反應(yīng)結(jié)果。反應(yīng)序號(hào)硫化氫靛基質(zhì)尿素氰化鉀賴氨酸脫羧酶判定菌屬A1++沙門氏菌屬A2+++沙門氏菌屬(少見)，愛德華氏菌屬A3+++檸檬