巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展pdf

1/1巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展pdf江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2012年第40卷第3期一35一姚晶，吳正鈞，任婧．巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(3)：

3538巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展姚晶1＇。

，吳正鈞2，任婧1(1．乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海200436；2．上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306)摘要：

巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有優(yōu)良的特性，是目前廣泛應(yīng)用的微生物表達(dá)系統(tǒng)之一，它在理論研究和實(shí)踐應(yīng)用上尤其是在大規(guī)模發(fā)酵中具有重要的意義。

本研究綜述了巴氏畢赤酵母的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性，詳細(xì)闡述了巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的組成以及影響外源基因表達(dá)的因素，并提出了一些提高表達(dá)量的方法。

關(guān)鍵詞：

巴氏畢赤酵母；表達(dá)系統(tǒng)；表達(dá)；影響因素中圖分類號(hào)：

Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

A文章編號(hào)：

10021302(2012)03003504隨著分子生物學(xué)理論研究的不斷深入，分子生物學(xué)技術(shù)得到了快速發(fā)展，與此同時(shí)，構(gòu)建的不同表達(dá)系統(tǒng)也層出不窮。

巴氏畢赤酵母(Pwhiapastor括)是1969年由Ogata等首次發(fā)現(xiàn)的，并于20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展為一個(gè)新興的表達(dá)系統(tǒng)。

巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有優(yōu)勢(shì)的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性，和大腸埃希菌(Escherwhmcoli)、釀酒酵母(Saccharom，，凹scerev西iae)等傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)一樣，被廣泛用于外源基因的表達(dá)。

1巴氏畢赤酵母的特性巴氏畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母。

甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母是指一類可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的酵母菌，主要包括：

漢遜酵母屬(Hansenula)、念珠酵母屬(Candida)、球擬酵母屬(％刪掣蠡)、克勒克酵母屬(K如eckem)以及畢赤酵母屬(Pwhia)等。

現(xiàn)研究證實(shí)，可作為表達(dá)外源蛋白的宿主菌的主要是巴氏畢赤酵母(P．pastoris)和多形漢遜酵母(Hpolymorpha)舊o。

甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母的甲醇代謝途徑與甲醇氧化機(jī)制非常相似，圖1為甲醇在巴氏畢赤酵母中的代謝過程睜1，甲醇酵母可以在以甲醇為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因?yàn)槠浼?xì)胞中含有甲醇代謝途徑的必需酶，如醇氧化酶(AOX)、二羥丙酮合成酶和過氧化氫酶等，其中AOX是甲醇酵母代謝途徑中的第1個(gè)酶，它催化甲醇被氧化為甲醛和過氧化氫，過氧化氫進(jìn)一步由過氧化氫酶分解成水和氧。

甲醛在胞漿內(nèi)被甲醛脫氫酶(FMD)和甲酸脫氫酶(FMDH)氧化成CO：

，或者在5一磷酸木酮糖(Xu5P)、二羥丙酮合成酶(DHAS)催化下形成3一磷酸甘油醛(GAP)和二羥丙酮(DHAP)；DHAP與GAP在1，6一二磷酸果糖醛縮酶作用下形成果糖一1，6一二磷酸(FBP)；FBP又經(jīng)1，5一二磷酸果糖酶去磷酸化生成Xu5P和GAP；Xu5P又一次參加循收稿日期：

201105一09基金項(xiàng)目：

國(guó)家973＂計(jì)劃(編號(hào)：

2010cB735705)；上海市科委課題(編號(hào)：

09DZ2251400)。

作者簡(jiǎn)介：

姚晶(1987一)，男，江蘇宜興人，碩士研究生，主要從事食品生物技術(shù)研究。

Email：

yawin905@sina．com。

通信作者：

任婧，博士，主要從事乳酸菌分子生物學(xué)研究。

Email：

叫ing@bnghtdairy．corn。

1一醇氧酶；2一過氧化氫酶；3一甲醛脫氫酶；4一甲酸脫氫酶；5～二羥丙酮合成酶；6-二羥丙酮激酶；71，6一二磷酸果糖醛縮酶；8一果糖一l，6．二磷酸化酶；9一甲醛還原酶圖1巴氏畢赤酵母中甲醇的代謝途徑環(huán)，而GAP有1／3進(jìn)入主代謝途徑，用于合成其他物質(zhì)。

從圖1中可以看出，在甲醇代謝途徑中，涉及到多種酶，這些酶都是由染色體上的有關(guān)基因編碼表達(dá)的。

巴氏畢赤酵母染色體內(nèi)含有甲醇代謝必需的關(guān)鍵調(diào)控酶醇氧酶(al-eoholoxidase，AOX)基因，它可以產(chǎn)生2種酶A0x1和AOX2。

當(dāng)葡萄糖、甘油或乙醇等作為碳源時(shí)，AOX幾乎不表達(dá)，進(jìn)一步研究表明AOX的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Paox能有效控制AOX表達(dá)H1。

最近有研究報(bào)道，將順式元件與原始啟動(dòng)子連接成新型的人工啟動(dòng)子，可以提高外源蛋白的產(chǎn)量和活性＂1。

此外，甲醇代謝所需的醇氧化酶被分選到過氧化物酶(pero】【isome)體中，形成區(qū)域化：

在以葡萄糖作碳源時(shí)，菌體中只有1個(gè)或幾個(gè)很小的過氧化物酶體；而在以甲醇作碳源時(shí)，過氧化物酶體幾乎占到整個(gè)細(xì)胞體積的80％，因此，當(dāng)在AOX基因前利用同源重組方式插入外源蛋白基因時(shí)，可獲得大量表達(dá)怕1。

在構(gòu)建表達(dá)菌株時(shí)，AOX的1個(gè)或2個(gè)基因的缺失就會(huì)導(dǎo)致菌株對(duì)甲醇利用能力的改變，根據(jù)菌株的基因型可將畢赤酵母分成3種表型：

(1)甲醇快利用型菌株(Mut+)，它含有AOXJ基因，能夠快速利用甲醇作為碳源和能源，以野生型速率生長(zhǎng)；(2)甲醇慢利用型菌株(Mut8)，它雖然不含有AOXJ基因，但含有AOX2基因，能緩慢利用甲醇；(3)甲醇不利用型菌株(Mut一)，它與AOXJ萬(wàn)方數(shù)據(jù)一36一江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2012年第柏卷第3期和AOX2基因同時(shí)缺失，不能在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

2巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)2．1宿主菌株巴氏畢赤酵母是DNA轉(zhuǎn)化的宿主菌，該體系以巴氏畢赤酵母缺乏組氨酸脫氫酶的營(yíng)養(yǎng)缺陷突變株為基礎(chǔ)。

如表1所示，目前用于外源基因表達(dá)的巴氏畢赤酵母菌株為Invitrogen公司構(gòu)建，主要有X一33、GSll5、KMTI和SMDll68等，用得較多的是巴氏畢赤酵母GSll5，它們都是由原始菌株巴氏畢赤酵母NRRLY一11430衍變而來的＂o。

SMDll68菌株為蛋白酶缺陷型菌株，這類菌株基因組中缺失編碼蛋白酶A(PeP4)和編碼蛋白酶B(prbl)的基因。

蛋白酶缺陷型菌株減弱了蛋白酶對(duì)外源蛋白的降解作用，特別適用于分泌型表達(dá)。

GSIl5、KM71菌株均為組氨酸脫氫酶基因缺陷型菌株(his4)，培養(yǎng)基中必須含有組氨酸才能生長(zhǎng)，利用這一特性可以在無(wú)組氨酸的葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(minima]dextrosemeclittm，MD)上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

裹1幾種常見的巴氏畢赤酵母寰達(dá)菌株豆其基因型和表型菌株基因型表型GSll5Ah／s4Mut+．HisKM71／,h／s．a(chǎn)ozl：

：

AR9．4，d講Mut｀。

HisKMTlHaox1：

：

ARG4，耐Mut｀SMDll68ddds4，d粥P4Mut+．His一．Pep4一SMDll68H蜊Mut+，Pep42．2表達(dá)戢體巴氏畢赤酵母胞內(nèi)沒有天然質(zhì)粒，表達(dá)載體需要和宿主菌染色體進(jìn)行同源重組，從而達(dá)到外源基因在宿主菌中進(jìn)行異源表達(dá)的目的。

為了達(dá)到這個(gè)目的，選擇的表達(dá)載體一般為整合型載體＂】。

表達(dá)載體都是穿梭質(zhì)粒，能夠穿梭于大腸桿菌和巴氏畢赤酵母之間．包括啟動(dòng)子、克隆位點(diǎn)、終止序列和篩選標(biāo)記等，圖2為InviUogen公司構(gòu)建的一種商品化表達(dá)載體pA0815，它和pPIC9、pPiC9K等表達(dá)載體一樣。

含有強(qiáng)誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子P篩選標(biāo)記基因H／s4以及整合到宿主菌染色體靶位點(diǎn)的3＇AOXJ序列；此外，pA0815還有多個(gè)插人位點(diǎn)，而且可以控制目的基因的拷貝數(shù)。

表2是巴氏畢赤酵母常用表達(dá)載體的信息，根據(jù)表達(dá)載體的表達(dá)方式可以分為分泌型表達(dá)載體(如pPICgK)和胞內(nèi)型表達(dá)載體(如pAOSl5)，這2種表達(dá)載體的基因組件雖然各有特點(diǎn)．但還是具有一些共同的序列．如這些載體都包括一個(gè)表達(dá)盒(c掙sette)和一個(gè)多克隆位點(diǎn)，表達(dá)盒由900bp的5＇AOXJ序列和約300bp的3＇轉(zhuǎn)錄終止序列組成。

2．3巴氏半赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有較多優(yōu)點(diǎn)[91：

(1)營(yíng)養(yǎng)要求低，生長(zhǎng)周期短，適合高密度培養(yǎng)，成本低廉；(2)胞內(nèi)存在合成過氧化酶的微體，有利于外源基因的表達(dá)，且避免了產(chǎn)物蛋白的損失；(3)含有甲醇誘導(dǎo)機(jī)制的相關(guān)相關(guān)基因．表達(dá)效率高＂。

目前，已有數(shù)百種外源蛋白在巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，表3列舉了幾種近幾年在巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)的外源蛋白。

雖然巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有高效表達(dá)外源基因的能力，但并不是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)都能夠高效表達(dá)，它受影響的因素較多。

如外源基因、分泌信號(hào)、翻譯后修飾、培養(yǎng)條件等因素都會(huì)對(duì)其高效表達(dá)產(chǎn)生影響。

表3近幾年在巴氏畢赤酵母中裹達(dá)的外蠢疊白【一｀3．1外濠基因外源基因是通過表達(dá)載體整合到巴氏畢赤酵母的染色體上的，因此，其自身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)是外源基因在巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)的重要影響因紊。

外源基因AT含量過高，常常導(dǎo)致翻譯表達(dá)過程提前終止，使其不能有效表達(dá)；相反。

GC古量過高．特別是在mRNA5＇端翻譯區(qū)，容易導(dǎo)致翻譯萬(wàn)方數(shù)據(jù)姚晶等：

巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展一37一能障過高，翻譯過程不III頃利進(jìn)行，進(jìn)一步導(dǎo)致表達(dá)量減少；大影響24。

。

另外，培養(yǎng)基的碳源及其濃度也對(duì)巴氏畢赤酵另外，mRNA5端非翻譯區(qū)序列的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度也會(huì)對(duì)外源基母表達(dá)系統(tǒng)有較大影響。

在畢赤酵母表達(dá)體系中、，混合碳源因的有效表達(dá)產(chǎn)生影響Ⅲ。

1。

因此，可以通過調(diào)整外源基因流加策略被逐漸采用，甘油、山梨醇等碳源和甲醇的混合添加的AT和GC含量，使之順利表達(dá)。

此外，選擇的外源基因應(yīng)可以提高細(xì)胞活力，增強(qiáng)醇氧酶活力，提高畢赤酵母表達(dá)外源盡量避免稀有密碼子，盡可能含有巴氏畢赤酵母偏好的密碼蛋白效率，其中山梨醇與甲醇的混合流加效果最為顯著∽，子，這樣可以提高翻譯效率，從而增加表達(dá)量。

1。

如人類葡如利用山梨醇與甲醇的混合流加生產(chǎn)堿性果膠酶，酶活性和萄糖腦苷脂酶基因在巴氏畢赤酵母中表達(dá)時(shí)，通過優(yōu)化密碼生產(chǎn)強(qiáng)度比對(duì)照分別提高了84．6％和45．2％，實(shí)現(xiàn)了堿性果子和調(diào)整GC含量，其產(chǎn)量分別增加了10．6、7．5倍1。

基因膠酶的高效生產(chǎn)、2。

此外，誘導(dǎo)劑濃度及添加時(shí)機(jī)、方式直劑量也會(huì)對(duì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，基因劑量就是指外源接關(guān)系到外源基因的高效表達(dá)，也關(guān)系到所產(chǎn)蛋白中完整蛋基因在巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的拷貝數(shù)。

在一般情況下，白的含量。

表達(dá)量和基因劑量呈正相關(guān)關(guān)系；也有研究報(bào)道，一些基因的巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)最大的一個(gè)弱點(diǎn)是存在降解表達(dá)在單拷貝時(shí)可以達(dá)到最大表達(dá)，而隨著拷貝數(shù)的增加，表達(dá)量蛋白的蛋白酶。

不少學(xué)者對(duì)發(fā)酵過程中的蛋白酶進(jìn)行了監(jiān)反而減少Ⅲ。

，這可能是隨著拷貝數(shù)的增加而產(chǎn)生的負(fù)反饋機(jī)測(cè)，Wu等認(rèn)為總蛋白酶活性隨著發(fā)酵過程的推移不斷增制調(diào)控的結(jié)果。

強(qiáng)Ⅲ1；Wang等在開始用甘油培養(yǎng)時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性，而3．2分泌信號(hào)當(dāng)用甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，蛋白酶活性迅速上升并維持在一一般來說，為了更加方便獲得巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的定水平3。

因此，如何控制蛋白酶的降解和表達(dá)蛋白的穩(wěn)定表達(dá)蛋白，都期望表達(dá)蛋白可以分泌到環(huán)境中。

如表2中所是培養(yǎng)過程中須要密切關(guān)注的問題。

首先，培養(yǎng)基組成與蛋列舉的幾種分泌型表達(dá)載體構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)，他們利用自身白酶的產(chǎn)生有很大的關(guān)系，在合成培養(yǎng)基中，氮源的缺乏往往的分泌信號(hào)就可以將表達(dá)分泌至胞外。

而對(duì)于自身沒有分泌伴隨著蛋白酶活性的增加，可以在天然培養(yǎng)基或者氨基酸富信號(hào)的表達(dá)系統(tǒng)，就需要選擇一些合適的分泌信號(hào)；如果選擇足的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，這樣既可以避免氮源的缺乏，又可以通過的分泌信號(hào)不合適，會(huì)導(dǎo)致表達(dá)蛋白分泌量的減少，甚至不分培養(yǎng)基中充足的酶解底物抑制蛋白酶的活性，獲得較高的產(chǎn)泌，另外還會(huì)對(duì)目的蛋白的正常翻譯產(chǎn)生不利影響。

因此，可量口。

其次，培養(yǎng)溫度也會(huì)影響表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性及誘導(dǎo)表以通過優(yōu)化信號(hào)肽密碼子、適當(dāng)?shù)卦黾影被岷透脑毂磉_(dá)載達(dá)效率。

Jahic等在研究中發(fā)現(xiàn)，雖然較低的溫度能顯著限制體信號(hào)肽，將表達(dá)載體改造為新的表達(dá)載體，如謝濤對(duì)菌體的生長(zhǎng)，但是此時(shí)蛋白酶的活性最低，同時(shí)AOX的活性pPIC9K中d因子信號(hào)肽進(jìn)行密碼子的優(yōu)化改造時(shí)，人工合成增強(qiáng)，表達(dá)蛋白的產(chǎn)量增加了1倍日。

同樣，pH值也影響著新的信號(hào)肽MS，構(gòu)建了新型酵母表達(dá)載體pPIC9KMS，其蛋白酶的活性和表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性。

根據(jù)研究報(bào)道，在pH構(gòu)建的2株不同植酸酶工程菌表達(dá)量就出發(fā)菌株在BMGY／值5．5～8．o時(shí)，蛋白酶的活性最低，同時(shí)表達(dá)蛋白穩(wěn)定性也BMMY培養(yǎng)基中分別提高了2．81、1．51倍舊。

能維持在較高水平3。

另外，在培養(yǎng)體系中加入蛋白酶抑制3．3翻譯后修飾劑也是控制蛋白酶降解的有效手段。

Sinha等在培養(yǎng)體系中分巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)能進(jìn)行與高等真核細(xì)胞相似的許別加入了1mmol／L絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酸氟、多翻譯后修飾，包括二硫鍵形成、信號(hào)序列加工、折疊、脂類添1mmol／L的EDTA及1mmo]／L苯甲基磺酸氟和1mmol／L加、0一連接糖基化和N一連接糖基化等，通過翻譯后修飾，MEDTA的混合物，其總蛋白酶活性分別降低了78％、45％、表達(dá)蛋白才具有生物學(xué)活性。

翻譯后修飾是對(duì)表達(dá)蛋白分泌94．2％[34]．前很復(fù)雜的加工過程，其中包括一系列酶促反應(yīng)，保證修飾過程的順利進(jìn)行是穩(wěn)定表達(dá)蛋白高水平表達(dá)的先決條件。

2。

4結(jié)語(yǔ)如畢赤酵母對(duì)產(chǎn)物蛋白過度糖基化加工，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量和巴氏畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為新興的表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)廣泛活性的降低，為了避免過度糖基化，可以通過定向突變?nèi)コ堑赜糜诙喾N蛋白的高效表達(dá)，它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)的操作基化位點(diǎn)、將目的蛋白質(zhì)與糖苷酶共同表達(dá)、構(gòu)建重組基因簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，還具庫(kù)、改變培養(yǎng)基、在體內(nèi)用衣霉素抑制糖基化及用酶對(duì)重組蛋有真核表達(dá)系統(tǒng)的對(duì)外源蛋白翻譯后修飾等特點(diǎn)，如糖基化、白質(zhì)去糖基化等手段避免目的產(chǎn)物過度糖基化口。

蛋白磷酸化等；同時(shí)它還避免了釀酒酵母的分泌效率差、表達(dá)3．4培養(yǎng)條件菌株不夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷，在分子生物學(xué)、微生和其他表達(dá)系統(tǒng)相似，培養(yǎng)條件對(duì)于巴氏畢赤酵母表達(dá)物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮了重要的作用。

隨著對(duì)巴氏畢赤酵母系統(tǒng)高效表達(dá)有著舉足輕重的影響。

在大規(guī)模生產(chǎn)目的蛋白表達(dá)系統(tǒng)研究的不斷推進(jìn)，將有越來越多的外源基因在巴氏時(shí)，往往是利用發(fā)酵罐進(jìn)行高密度連續(xù)培養(yǎng)，因此，通過對(duì)發(fā)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功高效表達(dá)，在分子生物學(xué)、微生物酵條件的優(yōu)化，可以達(dá)到實(shí)際的最高產(chǎn)量。

溫度、pH值、溶氧學(xué)、醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域及工業(yè)化應(yīng)用中發(fā)揮出更大的作用。

量等因素直接或者間接影響菌體生長(zhǎng)。

例如巴氏畢赤酵母的最佳生長(zhǎng)溫度為30℃，而有報(bào)道稱15℃的誘導(dǎo)溫度可以有參考文獻(xiàn)：

效提高外源蛋白的產(chǎn)量，另外，較低的溫度可以降低蛋白酶的[1]SiegeiRS．MethylotroyphicyeastP／ch／apastourproducedinhiishcell活力，從而增加目的蛋白的產(chǎn)量；巴氏畢赤酵母的最佳生長(zhǎng)densityfermentationwithhi【ghcellyieldsasvehicleforrecombinantpH值為3～7，如果培養(yǎng)基的pH值不在這個(gè)范圍內(nèi)，雖然對(duì)proteinproduction[J]．BiotechnologyandBioegineering，1989，34：

菌體生長(zhǎng)沒有很大影響，但是對(duì)蛋白的穩(wěn)定性及其活力有很403404．萬(wàn)方數(shù)據(jù)一38一江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2012年第40卷第3期[2]CereghinoJL，CreggJM。

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姚晶，吳正鈞，任婧作者單位：

姚晶(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心,上海200436;上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306)，吳正鈞(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海,201306)，任婧(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心,上海,200436)刊名：

江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)英文刊名：

JiangsuAgriculturalSciences年，卷(期)：

2012,40(3)被引用次數(shù)：

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