《桿狀病毒昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概述及案例分享》

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)概述及案例分享Baculovirus–insect

cell

expression

system,BEVS-IC北京義翹神州科技股份有限公司BEVS-IC的組成與優(yōu)化1BEVS-IC的應(yīng)用2案例展示3CONTENT義翹神州BEVS-IC的組成與優(yōu)化01義翹神州義翹神州桿狀病毒：一類具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，以節(jié)肢動物為專一性宿主。表達(dá)用桿狀病毒通常是Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)doi:10.1002/cpps.47義翹神州桿狀病毒：一類具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，以節(jié)肢動物為專一性宿主。表達(dá)用桿狀病毒通常是Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus(AcMNPV)LifeCycleExpressionStartPromotersHoursPostInfectionInfectionDNAReplicationVirionProductionCellLysisImmediateEarly(0-6hpi)ie0ie1ie2DelayedEarly(3-6hpi)39kLate(3-24hpi)p6.9(basic)vp39VeryLate(18-24to72hpi)polyhedrinp10桿狀病毒發(fā)展重要節(jié)點(diǎn)：19831ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCells1993BAC-to-BACExpressionSystem1953Firstcomprehensivereviewofbaculoviruschemistryandbiochemistry1962Establishedcellstrainsfromtissueculturedinvitro1971Discoveryandidentificationofthebaculovirus,Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus1972ThestructureofNuclearPolyhedrosisVirusesI.Theinclusionbody1973AcMNPVwasisolated1978~1992Analysisofbaculovirusgenomesandusedtodeveloptherecombinantbaculovirusvectors2008~2019flashBac2011~2016GeneticengineeringofbaculovirusThestorycontinues…2007~2017Insectcellengineering義翹神州昆蟲細(xì)胞發(fā)展重要節(jié)點(diǎn)：1983Establishmentofsf9（）(Spodopterafrugiperda)1994EstablishmentofTn-5B1-4

(HighFive)(Trichopulsiani)1915spermatidfromSamiaceropia1915~1958

Exploreinsectcellcultureinvitro1959Establishmentofovariancellline(Bombyxmori)1962Establishmentofovariancellline(Antheraeaeucalypti)1970Establishmentofsf21(Spodopterafrugiperda)1986EstablishmentofTn-5B1(Trichopulsiani)2010EstablishmentofAo38Thestorycontinues…義翹神州BEVS-IC優(yōu)化義翹神州BEVS-IC的應(yīng)用02義翹神州昆蟲-桿狀病毒與其他表達(dá)系統(tǒng)的比較：經(jīng)濟(jì)周期短高產(chǎn)量大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)后修飾匱乏易成包涵體難表達(dá)大分子蛋白酵母表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)濟(jì)快速BEVS-IC后修飾高產(chǎn)量高細(xì)胞密度可溶表達(dá)周期長大分子蛋白成本高哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)修飾完全可溶表達(dá)周期長成本高義翹神州特殊糖基化類型

轉(zhuǎn)化難度高應(yīng)用場景重組蛋白的應(yīng)用生物藥結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究天然vs重組蛋白天然蛋白重組蛋白豐度豐度低無豐度限制動物源有無產(chǎn)率低高批間差不可控可控andsomuchmore…工業(yè)酶生物材料藥物開發(fā)VLP/亞單位疫苗開發(fā)診斷試劑義翹神州表達(dá)流程義翹神州??SIMSF無血清培養(yǎng)基——專為Sf9和Sf21細(xì)胞設(shè)計貨號：MSF1特點(diǎn)：無血清、無蛋白最大細(xì)胞生長密度：1.2×107cells/mLSf21細(xì)胞設(shè)計貨號：MSF1特點(diǎn)：無血清、無蛋白最大細(xì)胞生長密度：1.2×107cells/mL：蛋白表達(dá)、Sf9/Sf21細(xì)胞培養(yǎng)、重組桿狀病毒的包裝和擴(kuò)增昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基義翹神州?SIMSF無血清培養(yǎng)基——專為Sf9和Sf21細(xì)胞設(shè)計貨號：MSF1

特點(diǎn)：無血清、無蛋白

最大細(xì)胞生長密度：1.2×107

cells/mL

用途：蛋白表達(dá)、Sf9/Sf21細(xì)胞培養(yǎng)、重組桿狀病毒的包裝和擴(kuò)增?SIMHF無血清培養(yǎng)基——專為Hi-5細(xì)胞開發(fā)貨號：MHF1特點(diǎn)：無血清、無蛋白最大細(xì)胞生長密度：7.5×106cells/mL用途：Hi-5細(xì)胞的培養(yǎng)、重組蛋白表達(dá)?無動物源、無血清SIMSF培養(yǎng)基貨號：MSF-AF特點(diǎn)：無血清、無蛋白、無動物源用途：蛋白表達(dá)、Sf9/Sf21細(xì)胞培養(yǎng)、重組桿狀病毒的包裝和擴(kuò)增?無動物源、無血清SIMHF培養(yǎng)基貨號：MHF-AF特點(diǎn)：無血清、無蛋白、無動物源用途：Hi-5細(xì)胞的培養(yǎng)、重組蛋白表達(dá)相同培養(yǎng)條件下，Sf9細(xì)胞在義翹神州和競爭品牌昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中的生長水平相同培養(yǎng)條件下，Hi-5細(xì)胞在義翹神州和競爭品牌昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中的生長水平SIMHFCompetitorACompetitorB酶轉(zhuǎn)錄因子超大蛋白跨膜蛋白病毒結(jié)構(gòu)蛋白適用BEVS的蛋白類型分泌蛋白復(fù)合體義翹神州案例展示03義翹神州重組表達(dá)策略制定ProteinIDAccession#(UniPortorNCBI)AA/cDNAsequenceBasicparametersStructuralFeaturesReferenceDisordernessCyscontentS-SprofileHydrophobicitydistributionInstabilityprofileAssessmentMw,pI…TM,PTM,domainsConstructconstruct,affinitytag,QCmethodsandstandardsPilotPOCScale-upFeasibilityassessmentTrouble-shootingFormulation,activity,stability…蛋白最終應(yīng)用決定表達(dá)和純化策略義翹神州構(gòu)建設(shè)計方案截去影響蛋白表達(dá)的區(qū)段Construct1Construct2

單次跨膜蛋白胞外區(qū)(MW=~90KDa)

昆蟲細(xì)胞表達(dá)

純化分泌蛋白

刪去N端高疏水區(qū)促進(jìn)蛋白分泌表達(dá)義翹神州構(gòu)建設(shè)計方案功能區(qū)域串聯(lián)表達(dá)Full-length(2511AA)，~70%purity,Yield<0.5mg/LEnoylreductase+Ketoacylreductase(~1000AA)Methyltransferase+Ketoreductase(~700AA)>90%purity,Yield>20mg/L

重組人脂肪酸合成酶（FASN）

多功能域復(fù)合酶昆蟲細(xì)胞表達(dá)純化胞內(nèi)蛋白

通過功能區(qū)串聯(lián)獲得高產(chǎn)重組蛋白義翹神州AlphaFoldmotif的靈活運(yùn)用Construct1：串聯(lián)形式1Construct2：串聯(lián)形式2功能性motif的構(gòu)建形式對蛋白的聚集情況有明顯影響義翹神州Buffer:PBSDetergentformula1Buffer:PBSDetergentformula2Buffer:PBSDetergent:DDMNi-affinitypurificationNi-affinitypurificationSECpurification不同Buffer蛋白對純化的影響義翹神州整體策略優(yōu)化

重組表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子蛋白

蛋白高度無序，穩(wěn)定性差

昆蟲細(xì)胞表達(dá)純化胞內(nèi)蛋白

構(gòu)建、培養(yǎng)和純化過程綜合優(yōu)化Construct1:Nt-GST-TF,pilotN端融合標(biāo)簽觀察到目標(biāo)蛋白表達(dá)

目標(biāo)蛋白未GSH梯度洗脫

目標(biāo)蛋白降解嚴(yán)重Construct2:Nt-TF-GST,pilot(V1)Construct2:Nt-TF-GST,scale-up

培養(yǎng)體積=10XV1

蛋白降解

培養(yǎng)體積=V1

收集Elute2并置換Buffer

目標(biāo)蛋白在高鹽buffer中較為穩(wěn)定Buffer[NaCl]=150mMBuffer[NaCl]=500mM高無序度蛋白Longestdisorderregion=166AA(166AA/384AA)Percentageofcoilstructure=79%C端融合標(biāo)簽觀察到目標(biāo)蛋白表達(dá)

目標(biāo)蛋白未GSH梯度洗脫

目標(biāo)蛋白降解緩解義翹神州美國子公司賓夕法尼亞州費(fèi)城區(qū)北京總部上海分公司歐洲子公司德國法蘭克福蘇州子公司泰州子公司廣州分公司日本子公司義翹神州義翹神州堅持自主研發(fā)生產(chǎn)打造中國生命科學(xué)研究“一站式”試劑與服務(wù)支撐平臺人才與設(shè)施榮譽(yù)資質(zhì)設(shè)施：---25,000+平米研發(fā)中心

---7,000平米潔凈車間

團(tuán)隊(duì)：900+---碩士以上學(xué)歷占1/3---10+歐美深造經(jīng)歷14,000+

精品抗體6,500+

重組蛋白47,000+