DB41T2371-2022豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.30

CCSB43

41

河南省地方標準

DB41/T2371—2022

豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范

2022-12-22發(fā)布2023-03-21實施

河南省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB41/T2371—2022

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4基本要求...........................................................................2

5稀釋液配制.........................................................................2

6品質(zhì)檢查...........................................................................2

7精液冷凍...........................................................................2

8解凍檢測與儲存.....................................................................3

9冷凍質(zhì)量要求.......................................................................3

10生產(chǎn)記錄..........................................................................4

11運輸..............................................................................4

附錄A（資料性）豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備表.............................................5

附錄B（資料性）凍精生產(chǎn)相關(guān)稀釋液配制...............................................6

附錄C（資料性）精液離心和稀釋.......................................................7

附錄D（資料性）豬冷凍精液生產(chǎn)記錄樣式...............................................8

I

DB41/T2371—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由河南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所、河南省畜牧技術(shù)推廣總站、河南精旺豬種改

良有限公司、牧原食品股份有限公司、漯河市畜牧工作站、北京田園奧瑞生物科技有限公司。

本文件主要起草人：邢寶松、張家慶、王獻偉、盧清俠、原黎偉、葛位西、胡波、徐澤君、李彥朋、

呂玲燕、蔣凡、申明、和小娥、高彬文、蔣立云、任巧玲、陳俊峰、王璟、馬強、牛剛。

II

DB41/T2371—2022

豬冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了豬冷凍精液生產(chǎn)與保存的基本要求和技術(shù)要求。包括精液采集、稀釋液配制、品質(zhì)檢

查、精液冷凍、解凍品質(zhì)檢測、凍精包裝、儲存及運輸?shù)葍?nèi)容。

本文件適用于豬冷凍精液生產(chǎn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T4143—2008牛冷凍精液

GB/T5458—2012液氮生物容器

GB/T23238—2021種豬常溫精液

GB/T25172—2020豬常溫精液生產(chǎn)與保存技術(shù)規(guī)范

GB/T30396—2013牛冷凍精液包裝、標簽、貯存和運輸

NY/T1234—2018牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

NY/T2077—2011種公豬站建設(shè)技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

種公豬

體型外貌和性能質(zhì)量符合種用標準要求的公豬。

3.2

凍精細管

用于分裝精液的耐凍、無毒的聚氯乙烯復合塑料細管。

3.3

冷凍精液

經(jīng)特殊方法處理經(jīng)超低溫冷凍并可在液氮中（-196℃）長期保存的精液。簡稱凍精。

3.4

細管冷凍精液

冷凍細管裝入精液經(jīng)液氮冷凍所形成的產(chǎn)品。

3.5

細菌數(shù)

每劑量精液經(jīng)培養(yǎng)后觀察到的細菌菌落數(shù)。

1

DB41/T2371—2022

3.6

活力

在37℃下呈直線前進運動的精子占總精子數(shù)的百分率。

3.7

畸形率

畸形精子占總精子數(shù)的百分比。

4基本要求

4.1種公豬

應符合NY/T2077—2011中8.2.1的要求，其他應符合GB/T25172—2020中4.1的要求。

4.2原精液

應符合GB/T25172—2020中5.2.2的要求。

4.3操作環(huán)境

應符合NY/T2077—2011中7.3的要求。

4.4采集量

地方品種≥50mL,其他≥100mL。

4.5環(huán)境

精液采集室、精液檢測室的環(huán)境條件應符合NY/T2077—2011中7.4～7.5的要求。

4.6儀器設(shè)備

4.6.1儀器設(shè)備的配置應滿足豬冷凍精液生產(chǎn)的要求(生產(chǎn)儀器設(shè)備見附錄A)。

4.6.2儀器設(shè)備運行正常，定期進行維護保養(yǎng)。

4.6.3計量儀器（電子天平、恒溫箱等）、超純水儀、恒溫熱臺、高壓鍋等應定期校準或維護保養(yǎng)。

4.6.4用品、器具等應按要求進行清洗和消毒。清洗和消毒應符合NY/T1234—2018附錄A中的規(guī)定。

5稀釋液配制

5.1配制稀釋液用水應為新鮮無菌的蒸餾水、重蒸水或超純水。稀釋液所用化學試劑應為分析純以上

級別，所用卵黃應來源于無特定病原體雞場的新鮮雞蛋，配制方法見附錄B。稀釋液配制需現(xiàn)用現(xiàn)配，

化學試劑需精確稱量，配制稀釋液滅菌容器需要進行標記，配制完成后需在瓶上標記日期、名稱、保存

時間等。

5.2使用商品稀釋液應嚴格按照使用說明書的要求操作。

6品質(zhì)檢查

精液品質(zhì)檢查應按照GB/T23238—2021附錄A中的規(guī)定執(zhí)行。

7精液冷凍

2

DB41/T2371—2022

7.1預稀釋及平衡

經(jīng)過質(zhì)量評估合格的精液，用等溫預熱且與精液溫度一致的預稀釋液（配制見附錄B）按照1:1～

1:1.2比例稀釋，稀釋后的精液于室溫（25℃）靜置1h，轉(zhuǎn)入17℃恒溫冰箱，平衡2h～3h。

7.2離心

稱量離心瓶重w（0g），將離心瓶預冷至17℃，然后將17℃平衡好的精液裝入離心瓶進行離心（17℃

條件下，800g離心10min），棄上清液，稱重w1（g）。

7.34℃平衡

用17℃預冷的冷藏保護液（Ⅰ液）（配制見附錄B）重懸精子,重懸后置于盛有17℃水的500mL

燒杯中，于4℃冰箱或低溫操作柜中緩慢降溫至4℃～5℃（2.5h～3h）。按1:1加入冷凍保護液（Ⅱ

液）（配制見附錄B）混勻，在4℃下繼續(xù)平衡0.5h～1h,然后在低溫操作柜中進行灌裝。

7.4冷凍

7.4.1程序冷凍

在灌裝的同時開啟程序冷凍儀，選定冷凍曲線，待冷凍儀溫度穩(wěn)定在初始溫度（4℃～5℃）后，

迅速將擺放好細管的托架放入冷凍室中，啟動冷凍程序。待冷凍曲線走完后，將托架迅速取出放入裝有

液氮的泡沫箱中，液氮深度至少浸沒所有細管。

7.4.2熏蒸冷凍

將液氮倒入深度50cm以上的專用冷凍箱預冷10min,保持冷凍支架上的細管在液氮面之上2cm,熏

蒸冷凍8min,最后將冷凍樣品浸入液氮中。

7.4.3分裝

將細管支架升到液氮面上1cm～2cm，然后將細管凍精裝入拇指管（每管12支），再將拇指管裝入

紗布袋（每袋6管），在紗布袋或拇指管上標記或貼上打印好的標簽。

8解凍檢測與儲存

8.1凍后抽檢

每份原精液制作的細管凍精至少抽取3支進行檢測。細管從液氮罐中取出后在空氣中停留2s～3s，

迅速置于50℃水浴中解凍16s，擦干表面水分后，將精液移入5mL離心管中，用預熱到37℃的解凍稀

釋液（配制見附錄B）作10倍稀釋。在37℃水浴中維持10min～15min，然后在顯微鏡下檢測解凍后精

子活力，如活力合格，即可將凍精轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

8.2包裝

外包裝上標明生產(chǎn)場、品種、種公豬號、生產(chǎn)日期和支數(shù)等。

8.3儲存

儲存方法應符合GB/T30396—2013中的要求，容器質(zhì)量應符合GB/T5458—2012中的規(guī)定。

9冷凍質(zhì)量要求

3

DB41/T2371—2022

9.1精子活力

≥40%。

9.2精子畸形率

≤20%。

9.3細菌數(shù)

≤1600個/mL，按GB/T4143—2008附錄B中規(guī)定的方法進行細菌數(shù)測定。

10生產(chǎn)記錄

做好豬凍精生產(chǎn)相應記錄，參見附錄D。

11運輸

應符合GB/T30396—2013中8.1～8.3的要求。

4

DB41/T2371—2022

A

A

附錄A

（資料性）

豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備表

豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備見表A.1。

表A.1豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備表

名稱規(guī)格及用途

采精架（假臺豬）采精用，可升降、調(diào)角度

防滑墊環(huán)保橡膠，不含滑石粉添加劑，（采精室地面防滑）

恒溫水浴鍋數(shù)顯式控溫，控溫精度±1℃

電熱恒溫培養(yǎng)箱數(shù)顯溫度、可控溫度34℃±1℃

磁力攪拌器可恒溫、調(diào)速

電子精密臺稱精液、稀釋粉稱重

電子天平0～300g±0.01g，化學試劑稱量

pH計0.0～14.0±0.1，測定精液、稀釋液的pH值

血球計數(shù)板測定精液中精子數(shù)量

超純水儀稀釋液用水

離心機單孔200mL～750mL

液氮容器（不同型號）貯存液氮，精液冷凍和保存

微量移液器50uL～100uL

微量移液器100uL～1000uL

溫度計溫度測量，0℃～60℃

磁力攪拌器可恒溫、調(diào)速

采精保溫杯600mL

量筒500mL、1000mL，量取液體

三角燒杯50mL、100mL、250mL、500mL

精子密度測定儀精液中精子密度的測定,億/mL

精子質(zhì)量分析系統(tǒng)40X～600X；有相差鏡頭，觀測精子數(shù)、活力和畸形率

顯微鏡恒溫臺（板）數(shù)顯溫度，加熱恒溫提高精子活體觀察的準確性

細管精液分裝機封裝細管精液

低溫平衡柜稀釋后的精液平衡，細管精液封裝

精液冷凍程控儀細管精液冷凍，控溫范圍30℃～180℃

5

DB41/T2371—2022

B

B

附錄B

（資料性）

凍精生產(chǎn)相關(guān)稀釋液配制

B.1預稀釋液

主要成分：Tris、檸檬酸、葡萄糖、半胱氨酸。

取2L量杯和2L加厚采精袋各1個，將采精袋套在燒杯內(nèi)部，取一袋豬凍精試劑A（預稀釋劑），全

部加入采精袋內(nèi)，然后將燒杯放到天平上，歸零，加入1000g水，用橡皮筋扎緊袋口，混勻，置水浴鍋

預熱至35.5℃左右備用。

B.2基礎(chǔ)營養(yǎng)液

主要成分：葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、HEPES鈉、Tris、EDTA?2Na、碳酸氫鈉、半胱氨酸。

取2L量杯和1L加厚采精袋各3個，每個量杯套一個采精袋。往其中一個采精袋中加入1000g水，再

加入整瓶豬凍精試劑B（基礎(chǔ)營養(yǎng)劑），混勻，為基礎(chǔ)液。

B.3Ⅰ液（冷藏保護液）

將250mL蛋黃加入到1L基礎(chǔ)營養(yǎng)液中，為冷藏液，使用前置于恒溫箱內(nèi)17℃保存。

B.4Ⅱ液（冷凍保護液）

主要成分:葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、HEPES鈉、Tris、EDTA?2Na、碳酸氫鈉、半胱氨酸、甘油、

SDS。

取I液276mL置于500mL的燒杯中，用注射器抽取18mL豬冷凍試劑C和移液器吸取6mL豬冷凍試劑

D(冷凍保護劑)加至其中，混勻，為冷凍液，置4℃?zhèn)溆谩?/p>

B.5解凍液

主要成分：葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉、HEPES鈉、Tris、EDTA?2Na、碳酸氫鈉、半胱氨酸、茶堿。

稱取適量（2mL/0.5mL冷凍細管）豬凍精試劑E（解凍劑）置于玻璃試管中，然后加入蒸餾水以

1:20比例混勻，置30℃?zhèn)溆谩?/p>

6

DB41/T2371—2022

C

C

附錄C

（資料性）

精液離心和稀釋

C.1精液離心

C.1.1離心前應準確稱量離心管凈重（g）,做好標記。

C.1.2降、恒溫后精液在17℃環(huán)境條件下800g離心10min,棄上清，稱重。

精子體積按式（C.1）計算：

(v0=(?1??0)?1.04)·····························································(C.1)

式中：

v0——濃縮后精子體積，單位為mL；

?1——離心瓶加精子重，單位為g；

?0——離心瓶重，單位為g；

1.04——濃縮后精液比重估計值。

C.2稀釋

C.2.1濃縮后精液稀釋總倍數(shù)：N=P0每劑有效體積/每劑總精子數(shù)量-1（有效體積按0.45mL計）

C.2.2第一稀釋倍數(shù)N1=（N+1）/2-1（稀釋后體積為凍前體積的一半）

C.2.3Ⅰ液用量（mL）V1=N1V0

C.2.4Ⅱ液用量（mL）V2=（N1+1）V0

C.2.5最終可分裝細管數(shù)=（N+1）V0/0.5

7

DB41/T2371—2022

D

D

附錄D

（資料性）

豬冷凍精液生產(chǎn)記錄樣式

豬冷凍精液生產(chǎn)相應記錄樣式見表D.1。

表D.1豬冷凍精液生產(chǎn)記錄樣式

日期公豬號采精量采集員顏色活力密度檢查員預計生冷凍后冷凍數(shù)操作員備注

mL億/mL產(chǎn)支數(shù)活力量

8

DB41/T2371—2022

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4基本要求...........................................................................2

5稀釋液配制.........................................................................2

6品質(zhì)檢查...........................................................................2

7精液冷凍...........................................................................2

8解凍檢測與儲存.....................................................................3

9冷凍質(zhì)量要求.......................................................................3

10生產(chǎn)記錄..........................................................................4

11運輸..............................................................................4

附錄A（資料性）豬冷凍精液生產(chǎn)儀器設(shè)備表.............................................5

附錄B（資料性）凍精生產(chǎn)相關(guān)稀釋液配制...............................................6

附錄C（資料性）精液離心和稀釋.......................................................7

附錄D（資料性）豬冷凍精液生產(chǎn)記錄樣式......................