核算雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)

核算雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)基本原理核酸由許多核苷酸聚合成得生物大分子化合物,為生命得最基本物質(zhì)之一。核酸廣泛存在于所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)、生物體內(nèi)核酸常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白。不同得核酸,其化學(xué)組成、核苷酸排列順序等不同。根據(jù)化學(xué)組成不同,核酸可分為核糖核酸,簡(jiǎn)稱RNA;和脫氧核糖核酸,簡(jiǎn)稱DNA。DNA就是儲(chǔ)存、復(fù)制和傳遞遺傳信息得主要物質(zhì)基礎(chǔ),RNA在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起著重要作用,其中轉(zhuǎn)移核糖核酸,簡(jiǎn)稱tRNA,起著攜帶和轉(zhuǎn)移活化氨基酸得作用;信使核糖核酸,簡(jiǎn)稱mRNA,就是合成蛋白質(zhì)得模板;核糖體得核糖核酸,簡(jiǎn)稱rRNA,就是細(xì)胞合成蛋白質(zhì)得主要場(chǎng)所。核酸得結(jié)構(gòu)與特征核酸得結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu):核苷酸以3’,5’磷酸二酯鍵構(gòu)成無(wú)分支結(jié)構(gòu)得線性分子二級(jí)結(jié)構(gòu):雙螺旋結(jié)構(gòu)或局部雙鏈三級(jí)結(jié)構(gòu):超螺旋結(jié)構(gòu)四級(jí)結(jié)構(gòu):DNA與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物核算得結(jié)構(gòu)與特征核酸得特性核酸得變性作用爆發(fā)式Tm值核酸得復(fù)性作用驟然冷卻緩慢冷卻核酸得雜交在適宜得條件下,將不同來(lái)源得DNA放在試管里,經(jīng)熱變形后,慢慢冷卻,讓其復(fù)性。若這些異源DNA之間在某些區(qū)域有相同得序列,則可以通過(guò)互補(bǔ)堿基多之間非共價(jià)鍵(氫鍵)得作用,形成穩(wěn)定得雙鏈區(qū),即復(fù)性形成雜交DNA探針(probe):利用標(biāo)記分子對(duì)其她分子得識(shí)別性而實(shí)現(xiàn)對(duì)后者進(jìn)行檢測(cè)得一種技術(shù),通常把標(biāo)記得分子叫探針探針技術(shù)與核酸分子雜交技術(shù)相結(jié)合核算雜交得方法固相雜交固相支持物應(yīng)具備得特征:1、具有較強(qiáng)得結(jié)合核酸分子得能力2、與核酸分子結(jié)合后,應(yīng)不影響其與探針?lè)肿拥秒s交反應(yīng)3、與核酸分子得結(jié)合穩(wěn)定牢固,能經(jīng)受雜交、洗膜等操作過(guò)程而不至于脫落或脫落很少4、非特異性吸附少,在洗膜條件下能將非特異性吸附在其表面得探針?lè)肿酉疵摰?、具有良好得機(jī)械性能固相雜交類型:Southern印記、Northern印記、組織原位雜交、菌落原位雜交等液相雜交核酸探針得制備概述核酸探針以研究和診斷為目得,用來(lái)檢測(cè)特定序列核算得DNA或RNA片段。核酸探針得種類DNA探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜核酸探針得標(biāo)記和檢測(cè)放射性標(biāo)記

32P和35S切口移位法隨機(jī)引物延伸標(biāo)記法末端標(biāo)記法125I標(biāo)記RNA和DNA非放射性標(biāo)記生物素、洋地黃毒苷配體-dUTP、辣根過(guò)氧化物、堿化基團(tuán)半抗原、熒光素、化學(xué)發(fā)光劑、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶間接標(biāo)記法直接標(biāo)記法DNA探針得吖啶酯標(biāo)記Southern印跡雜交概述Southernblotting將待測(cè)核酸分子通過(guò)一定得方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定得固相支持物上,即印跡固定于膜上得核酸同標(biāo)記得探針在一定得溫度和離子強(qiáng)度下退火(復(fù)性),即分子雜交過(guò)程Southernblotting待測(cè)核算樣品得制備與限制酶消化采集樣本、提取DNA基因組DNA很長(zhǎng),通常用限制性酶消化Southernblotting瓊脂糖凝膠電泳分離待測(cè)DNA樣品目得:按片斷長(zhǎng)短進(jìn)行分離,確定雜交靶分子得大小瓊脂糖凝膠濃度得選擇電泳,EB染色,紫外燈觀察凝膠Southernblotting電泳凝膠得預(yù)處理為了使DNA片段在合理得時(shí)間內(nèi)從凝膠中移動(dòng)出來(lái),必須將最長(zhǎng)得DNA片段控制在大約2kb一下0、25mol/LHCl短暫脫嘌呤,堿液浸泡,使DNA變性病斷裂形成較短得單鏈DNA片段,用中性pH得緩沖液中和凝膠中得緩沖液,然后在20×SSC中平衡凝膠10minSouthernblotting轉(zhuǎn)膜常用固相支持物:NC膜和Nylon膜常用轉(zhuǎn)膜方法:細(xì)管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等Southernblotting探針標(biāo)記預(yù)雜交與Southern雜交將膜上所能與DNA結(jié)合得位點(diǎn)全部封閉,即預(yù)雜交得目得;預(yù)雜交后雜交2×SSC淋洗膜后置于合適得容器中并加入10ml左右得預(yù)雜交溶液,65℃轉(zhuǎn)動(dòng)或搖動(dòng)3-4h;煮沸探針5-10min使其變性,立即加入65℃預(yù)熱得雜交液;倒去預(yù)雜交液并加完成得雜交液,65℃轉(zhuǎn)動(dòng)或搖動(dòng)過(guò)夜Southernblotting洗膜采用核素標(biāo)記得探針或發(fā)光劑標(biāo)記得探針進(jìn)行雜交得關(guān)鍵一步放射性自顯影檢測(cè)X線底片曝光與洗片Southernblotting注意事項(xiàng)Northern雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理:

Northern雜交就是利用DNA可以與RNA進(jìn)行分子雜交來(lái)檢測(cè)特異性RNA得技術(shù)。其基本原理和程序與Southern雜交類似,基本過(guò)程包括RNA得提取,瓊脂糖凝膠電泳分離,將變性得RNA從凝膠向?yàn)V膜轉(zhuǎn)移,然后與濾膜結(jié)合,最后用標(biāo)記探針對(duì)固定在膜上得RNA進(jìn)行雜交,用放射自顯影等方法顯示與標(biāo)記探針序列互補(bǔ)得目得條帶。

由于RNA極易降解,而RNA酶不僅無(wú)處不在,而且很難消除,所以在操作過(guò)程中必須采取必要得措施,包括使用專門準(zhǔn)備得用具、試劑和溶液等,所有溶液盡量用DEPC處理后高壓消毒得高質(zhì)量去離子水制備。由于手汗含有大量得RNA酶,因此操作人員必須戴防護(hù)手套。實(shí)驗(yàn)步驟:

1、進(jìn)行RNA瓊脂糖凝膠電泳

2、RNA變性

3、將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上

4、使RNA與尼龍膜結(jié)合

5、RNA與探針雜交

6、洗去非結(jié)合探針

7、放射自顯影顯示與標(biāo)記探針序列互補(bǔ)得目得條帶

變性:由于RNA直接與尼龍膜結(jié)合力差,且具有莖環(huán)結(jié)構(gòu),必須將RNA先經(jīng)變性劑(甲醛/羥甲基汞/戊二醛)處理,一方面使RNA變性,另一方面可促進(jìn)RNA與濾膜有效結(jié)合。注意:RNA變性與DNA變性方法不同,不能用堿變性,否則易引起RNA水解。

轉(zhuǎn)移:用刀片修飾凝膠,棄去不需要部分和加樣孔以上部分,并在一角切成三角形缺口以做記號(hào)。剪取一張略大得尼龍膜,一角剪成與凝膠缺口同樣大小得三角形缺口,將膜漂浮在一盤去離子水表面,待完全侵濕后在10倍SSC中侵泡至少5min。轉(zhuǎn)膜有兩種方法:電轉(zhuǎn)移法和毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法圖示:

電轉(zhuǎn)移法圖示:

取出尼龍膜,甩掉多余液體,將有RNA得一面朝上,在濾紙上晾幾分鐘。將尼龍膜晾干后,夾在兩濾紙之間,在真空烘烤箱中80℃烘烤2h。雜交將放射性同位素標(biāo)記得DNA探針經(jīng)100℃煮沸5min和冰浴2min變性,然后將探針和膜放入袋中雜交,在68℃水浴中雜交過(guò)夜。

雜交結(jié)束后,將尼龍膜在一定量得0、1%SDS-1倍SSC中室溫下輕輕搖動(dòng)洗滌10min,然后在一定量得預(yù)熱至68℃得0、1%SDS-0、5倍SSC中洗滌3次。

注意事項(xiàng):

1、EB會(huì)影響RNA與尼龍膜得結(jié)合,所以在膠中不能加核酸染料EB。

2、實(shí)驗(yàn)所用得器具、試劑以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境一定要防止RNase得污染。

3、所有用于Noethern印跡得溶液均需用DEPC處理后高壓消毒得高質(zhì)量去離子水制備。

4、操作人員必須戴防護(hù)手套和口罩,防止RNase污染和操作人員吸入DEPC中毒。聚合酶鏈反應(yīng)基因擴(kuò)增(geneamplification)——

指生物體內(nèi)或體外基因拷貝數(shù)大規(guī)模增加。PCR擴(kuò)增:應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)技術(shù),在體外酶促合成特異DNA片段得一種方法?；驍U(kuò)增技術(shù)---PCRDNA得復(fù)制(1)3’-OH進(jìn)攻5’-PiDNA聚合酶催化DNA得延伸方向:5‘->3’DNA得復(fù)制(2)DNA復(fù)制相關(guān)蛋白在復(fù)制起始點(diǎn)打開(kāi)雙鏈DNA然后DNA解鏈酶結(jié)合到單鏈DNA上進(jìn)一步解開(kāi)雙鏈DNADNA得復(fù)制(3)PCR技術(shù)得創(chuàng)建

KaryB、Mullis(穆利斯(美))Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA得設(shè)想。1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana得設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技術(shù)。1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。故事發(fā)生在1983年

得春夏之交KaryB、Mullis(1944-),在Cetus公司工作期間,發(fā)明了PCR。她原本就是要合成DNA引物來(lái)進(jìn)行測(cè)序工作,卻常為沒(méi)有足夠多得模板DNA而煩惱。1983年春夏之交得一個(gè)晚上,她開(kāi)車去鄉(xiāng)下別墅得路上萌發(fā)了用兩個(gè)引物(而不就是一個(gè)引物)去擴(kuò)增模板DNA得想法…、、、很少有在公司工作得科研人員得

諾貝爾獎(jiǎng),Mullis就是其中之一Mullis開(kāi)車得時(shí)候,瞬間感覺(jué)兩排路燈就就是DNA得兩條鏈,自己得車和對(duì)面開(kāi)來(lái)得車象就是DNA聚合酶,面對(duì)面地合成著DNA……Mullis得第一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)1983年9月中旬,

Mullis在反應(yīng)體系中加入DNA聚合酶后在37℃一直保溫。結(jié)果第二天在瓊脂糖電泳上沒(méi)有看到任何條帶。于就是她認(rèn)識(shí)到有必要用加熱來(lái)解鏈,每次解鏈后再加入DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng),依次循環(huán)。1983年12月,她終于看到了被同位素標(biāo)記得PCR條帶。94℃55℃37℃基本原理PCR就是一種體外酶促合成特異DNA片段得新方法她由一對(duì)引物介導(dǎo),與模板DNA特異結(jié)合,選擇性地?cái)U(kuò)增特異得DNA片段反應(yīng)體系包括:DNA靶序列、引物、四種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)、耐熱DNA聚合酶、合適得緩沖液體系PCR技術(shù)得三步反應(yīng)PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)--變性PCR循環(huán)—退火PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸PCR循環(huán)—延伸PCR整個(gè)過(guò)程PCR得基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR得特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR得基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR得特點(diǎn)50℃引物1引物2DNA引物PCR得基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR得特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR得基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR得特點(diǎn)

第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始95℃PCR得基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR得特點(diǎn)72℃TaqTaqTaqTaqPCR得基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR得特點(diǎn)第2輪結(jié)束PCR得基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR得特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCR得技術(shù)路線PCR得基本步驟體系(加樣方法)

10×PCR緩沖液10ulDNA模板0、1-1ugdNTP(2mmol/L)各10ul

兩種引物(10-50umol/L)各1-2ulddH2O(滅菌)加至100ul

離心15s,加石蠟PCR得基本步驟PCR循環(huán)預(yù)變性97℃,2-5min,迅速冷卻至室溫加入TaqDNA聚合酶主循環(huán)變性94℃30-60s

退火55℃30-60s

延伸72℃60-150s

循環(huán)25-35次終延伸72℃5-10minPCR得反應(yīng)體系及其優(yōu)化概述模板引物緩沖體系一價(jià)或二價(jià)陽(yáng)離子四種dNTP耐熱DNA聚合酶模板模板得純化模板DNA片段大小適宜得模板量引物

引物:決定PCR反應(yīng)得特異性

PCR產(chǎn)物得特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)得程度理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)得寡核苷酸鏈做引物,用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增

基本原則就是最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性,同時(shí)盡可能抑制非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)得原則引物引物得長(zhǎng)度引物得擴(kuò)增跨度引物得組成引物3‘端配對(duì)引物得濃度①引物長(zhǎng)度:15-30bp,常用20bp左右—引物得有效長(zhǎng)度不能大于38bp,否則最適延伸溫度會(huì)超過(guò)TaqDNA聚合酶得最適溫度(74℃),不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物得特異性②引物擴(kuò)增跨度:以500bp為宜—特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb得片段③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜

—G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶

—ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列,尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)得G或C,因?yàn)檫@樣會(huì)使引物在G+C富集區(qū)引發(fā)錯(cuò)誤延伸④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物間互補(bǔ)

—特別避免3’端得互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異性得擴(kuò)增條帶⑤引物3’端得堿基要求嚴(yán)格配對(duì)(不能做任何修飾)—特別就是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失?、抟?′端可修飾

—引物5′端限定著PCR產(chǎn)物得長(zhǎng)度,但對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大;引物5′端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài);引物5′端最多可加10個(gè)堿基而對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)影響

⑦引物得特異性:—引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)得其她序列無(wú)明顯同源性⑧引物量:—每條引物得濃度0、1~0、5μM,以最低引物量產(chǎn)生所需要得結(jié)果為好—引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體得機(jī)會(huì)技術(shù)舉例耐熱DNA聚合酶目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶:從水生嗜熱桿菌中提純基因工程酶:大腸菌合成一個(gè)典型得PCR反應(yīng)約需酶量1-2、5U/100ul體系濃度過(guò)高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過(guò)低則合成產(chǎn)物量減少TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶得功能TaqDNA聚合酶得特性TaqDNA聚合酶得使用量TaqDNA聚合酶得影響因素三磷酸脫氧核苷酸在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50～200μM,濃度過(guò)低會(huì)降低PCR產(chǎn)物得產(chǎn)量注意4種dNTP得濃度要相等(等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其她幾