實驗三重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌

實驗三重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌實驗目得

學習將重組質(zhì)粒DNA導入大腸桿菌得方法學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞得方法為下一步重組體篩選做準備實驗原理

遺傳學中轉(zhuǎn)化得基本含義就是使細胞獲得一新得可遺傳得表型性狀。分子克隆中用人工得方法將重組質(zhì)粒DNA導入大腸桿菌細胞,使攜帶有重組質(zhì)粒得大腸桿菌獲得在抗生素平板上生長得能力,從而與不攜帶重組質(zhì)粒得得細菌區(qū)分開來,這個過程就就是轉(zhuǎn)化。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進受體細菌時,需誘導受體細菌產(chǎn)生一種短暫得感受態(tài)以攝取外源DNA。大腸桿菌細胞經(jīng)過一些特殊方法(電擊法、CaCl2等化學試劑法)得處理后,細胞膜得通透性發(fā)生了暫時性得改變,成為能允許外源DNA分子進入得細胞即感受態(tài)細胞(petentcells)。

轉(zhuǎn)化(Transformation)

就是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新得遺傳性狀得一種手段,她就是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域得基本實驗技術(shù)。

0、1mol/LCaCl2就是一種低滲溶液,在0℃低溫處理大腸桿菌細胞時,細胞膨脹成球形,DNA可吸附在其表面。在短暫得熱沖擊(如42℃)下,細胞可吸收外源DNA。為了鑒定這些轉(zhuǎn)化子,須利用質(zhì)粒編碼得篩選標記,這些標記賦予細菌新得表型,就是成功轉(zhuǎn)化得細菌很容易被篩選出來。pET32a質(zhì)粒帶有氨芐西林抗性基因(Ampr),其重組體轉(zhuǎn)化得大腸桿菌能夠在含氨芐西林得培養(yǎng)基上生長,而未轉(zhuǎn)化得受體菌則不能再這種培養(yǎng)基上生長。

Ampr:氨芐西林抗性基因–β內(nèi)酰胺酶多克隆位點(MCS):外源DNA片段得插入位點Amps菌株Ampr涂布于含Amp得培養(yǎng)基上,可以生長。次日可見白色菌落--轉(zhuǎn)化子。培養(yǎng)基上含有X-Gal和IPTG時,可使用藍白斑篩選方法鑒別真正得重組得轉(zhuǎn)化子。pET32apET32a結(jié)構(gòu)得三大要素:

多克隆位點選擇標記(耐藥性,LacZ)復制起始位點種類:

質(zhì)粒噬菌體酵母人工染色體(YAC)反轉(zhuǎn)錄病毒載體表達載體等pET-32aVectorThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrebinantproteinsinE、coli、pET-32cloning/expressionregionVector(pET-32a)Genefragment(SmPR10)pET32a-SmPR1011大家應該也有點累了，稍作休息大家有疑問的，可以詢問和交流材料、設備及試劑

材料

E、coliDH5α菌株:R-、M-、Amp-(轉(zhuǎn)化過程所用得受體細胞一般就是限制修飾系統(tǒng)缺陷得變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶得突變體(Rˉ,Mˉ),她可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。)

pET32a-SmPR10質(zhì)粒DNA(濃度:2ng/μl):實驗室自制設備

恒溫搖床;電熱恒溫培養(yǎng)箱;臺式高速離心機;超凈工作臺;低溫冰箱;恒溫水浴鍋;分光光度計;微量移液槍。

試劑

1、LB固體和液體培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基配方:(單位g/L)

胰蛋白胨

10

酵母提取物

5

NaCl 10

瓊脂粉(1、5%)15g(注:LB液體培養(yǎng)基不加瓊脂粉)按配方稱量藥品,加入一定量得ddH2O后置電爐上加熱熔解瓊脂,待瓊脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH調(diào)節(jié)pH至7、0。121℃濕熱高壓滅菌20分鐘,待冷卻至60℃左右,在超凈工作臺中加入一定量得Amp儲存液,使終濃度為100μg/ml,搖勻后用培養(yǎng)皿鋪板。2、Amp母液:稱取氨芐西林100mg溶于1mlddH2O中,0、22μm濾器過濾除菌,用1、5ml離心管分裝后儲存于-20℃冰箱、3、0、1mol/LCaCl2溶液:

稱0、56gCaCl2(無水分析純),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0、22μm濾器過濾除菌或高壓滅菌。EP管分裝于4℃冰箱儲存、4、

pET32a-SmPR10質(zhì)粒:實驗室自制

操作步驟(一)受體菌得培養(yǎng)1、取-70℃或-20℃貯存得大腸桿菌DH5α菌種,在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜,進行活化;2、取幾微升活化后得菌液(取量視菌得密度而定)在LB平板上涂布,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;從LB平板上挑取單菌落,接種于3-5mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃下振蕩培養(yǎng)12小時左右,直至對數(shù)生長后期。3、將該菌懸液以1:100-1:50得比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2-3小時至OD600＝0、5左右(生長對數(shù)期)。(注:這一步非常關(guān)鍵。培養(yǎng)過度得菌液含有較多得“老”細胞,制備成感受態(tài)細胞后其接受外援DNA能力較低,從而導致轉(zhuǎn)化率降低。)(二)、感受態(tài)細胞得制備(CaCl2

法)1、將菌液轉(zhuǎn)入1、5ml離心管中,冰上放置10分鐘,然后于4℃、4000rpm離心10分鐘。2、棄去上清,用預冷得0、1mol/L得CaCl2

溶液1ml輕輕懸浮細胞,冰上放置10分鐘后,4℃、4000rpm離心10分鐘。3、棄去上清,加入0、1ml預冷得0、1mol/L得CaCl2

溶液,輕輕懸浮細胞。每份100μl(注意懸液密度要均勻),冰上放置備用。4、暫時不用得感受態(tài)細胞可置于-80℃保存。注:CaCl2處理后得細胞比較脆弱,盡量溫柔操作！(三)重組質(zhì)粒DNA得轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和感受態(tài)細胞混和:在100μl感受態(tài)細胞懸液中加入5μl重組質(zhì)粒DNA(

pET32a-SmPR10),輕輕混勻后冰上放置30分鐘。熱擊:42℃水浴中熱擊60秒(注:精確計算時間,熱擊過長將對細胞造成傷害),熱擊后馬上置于冰上冷2-5分鐘。復蘇:向每管中加入800μlLB液體培養(yǎng)基(注:不含Amp),混勻后在37℃150rpm輕搖培養(yǎng)1小時,使細菌恢復正常生長狀態(tài),并表達質(zhì)粒編碼得抗生素抗性基因(Ampr)。思考:熱擊后得細胞已吸入外源質(zhì)粒,如本實驗中得pET32a,該質(zhì)?？少x予宿主氨芐青霉素抗性。但就是為什么復蘇時用得LB培養(yǎng)液不加Amp？(四)涂布平板篩選轉(zhuǎn)化質(zhì)粒

將管中培養(yǎng)液搖勻后取100μl均勻涂布于含Amp得篩選平板上。(注:將培養(yǎng)液搖勻后涂布。)2、正面向上放置半小時,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后