血紅蛋白的提取和分離課件高二下學(xué)期生物人教版選修1

課題3

血紅蛋白的提取和分離課題背景課題背景課題背景蛋白質(zhì)是生命活動不可缺少的物質(zhì)。隨著人類基因組計劃的進展以及多種生物基因組測序工作的完成，人類跨入了后基因組和蛋白質(zhì)組時代。對蛋白質(zhì)的研究與應(yīng)用，首先需要獲得純度較高的蛋白質(zhì)。我們將以血紅蛋白為實驗材料，學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)提取和分離的一些基本技術(shù)閱讀教材P64~66，思考下列問題基礎(chǔ)知識1、選擇什么細胞提取血紅蛋白？2、蛋白質(zhì)分離的原理是？常用方法？哺乳動物紅細胞1.蛋白質(zhì)分離的原理：

根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同種類的蛋白質(zhì)。方法凝膠色譜法

電泳法

基礎(chǔ)知識2、分離的方法基礎(chǔ)知識1、什么是凝膠？常見的凝膠有哪些？2、什么是凝膠色譜法？是依據(jù)什么特性來分離蛋白質(zhì)？3、凝膠色譜法的原理？（一）凝膠色譜法思考基礎(chǔ)知識（一）凝膠色譜法1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構(gòu)成，如葡聚糖、瓊脂糖）2、凝膠色譜法：也稱作分配色譜法，是根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小來分離蛋白質(zhì)的有效方法.3、依據(jù)的特性：相對分子質(zhì)量的大小基礎(chǔ)知識（一）凝膠色譜法4、凝膠色譜法的原理相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部路程較長速度較慢相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)在凝膠外部移動路程較短速度較快相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子得以分離5、具體過程基礎(chǔ)知識（一）凝膠色譜法洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。

5、具體過程基礎(chǔ)知識（一）凝膠色譜法基礎(chǔ)知識（一）凝膠色譜法相對分子質(zhì)量大相對分子質(zhì)量小運動路徑運動方式運動路程運動速度洗脫次序凝膠外部凝膠內(nèi)部垂直向下運動無規(guī)則的擴散運動較短較慢較快較長先流出后流出根據(jù)凝膠色譜法的原理填表基礎(chǔ)知識（二）電泳思考1、什么是電泳？2、電泳的原理？3、常用的電泳方法有？1、概念帶電粒子在電場作用下發(fā)生遷移的過程2、原理（1）許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電?；A(chǔ)知識（二）電泳（2）在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。（3）電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離基礎(chǔ)知識（二）電泳3、常用方法瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳4、實例使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量思考：1、蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于什么？

2、怎么去除凈電荷對遷移速率的影響?它所帶凈電荷的多少以及分子的大小

加入SDS基礎(chǔ)知識（二）電泳SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性，解聚成單條肽鏈。因此測定的結(jié)果只是單條肽鏈的分子量。SDS所帶負電荷量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間的電荷差別。電泳遷移速率完全取決于分子的大小基礎(chǔ)知識（二）電泳凝膠色譜法和電泳法的比較凝膠色譜法電泳法分離依據(jù)分離動力分子大小的影響相對分子質(zhì)量大小分子帶電性質(zhì)差異、分子大小和形狀等重力電場力相對分子質(zhì)量大，移動速度快分子大，阻力大，移動速度慢基礎(chǔ)知識（三）緩沖溶液1、緩沖溶液的作用是什么？如何配置？2、在本實驗中使用緩沖溶液是什么？它的目的是什么？思考基礎(chǔ)知識（三）緩沖溶液1、作用在一定范圍內(nèi)，能夠抵制外界的酸或堿的對溶液的PH值的影響，維持PH基本不變2、緩沖溶液的配制通常由1－2種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的使用比例就可以制得在不同PH范圍內(nèi)使用的緩沖液。特別提醒：本實驗使用的是磷酸緩沖液，目的是模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察(紅色)和科學(xué)研究(活性)實驗操作閱讀教材P66-67回答下列問題1、蛋白質(zhì)的提取和分離的步驟？2、為什么選擇提取分離血紅蛋白？這一特點對進行蛋白質(zhì)的分離有何意義？3、提取血紅蛋白選擇哺乳動物的紅細胞作為實驗材料有什么優(yōu)點？血紅蛋白是有色蛋白

凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。哺乳動物成熟的紅細胞內(nèi)沒有細胞核和各種細胞器，血紅蛋白含量豐富，也能排除了其他物質(zhì)對實驗結(jié)果的干擾。樣品處理、粗分離、純化、純度鑒定實驗操作（一）樣品處理1、紅細胞的洗滌思考（1）洗滌紅細胞的目的？你如何知道紅細胞已經(jīng)洗滌干凈？如何洗滌？（2）為何要重復(fù)多次洗滌紅細胞？（3）為何要低速短時間離心？（4）能否用蒸餾水代替生理鹽水洗滌紅細胞？上清液不再呈現(xiàn)黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。洗滌次數(shù)過少，無法完全除去血漿蛋白。因為離心速度過高、時間過長會使白細胞等一同沉淀，達不到分離紅細胞的效果。蒸餾水會導(dǎo)致紅細胞破裂，使血紅蛋白與血漿蛋白等混在一起，增加分離的難度。實驗操作（一）樣品處理1、紅細胞的洗滌（1）洗滌目的去除雜蛋白，以利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化。（2）洗滌操作采集血樣低速短時間離心吸取上層透明的黃色血漿下層紅細胞液體倒入燒杯加五倍體積生理鹽水緩慢攪拌10min低速短時間離心重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色實驗操作（一）樣品處理2、血紅蛋白的釋放思考（1）本步操作的目的是什么，如何進行？（2）操作中加入蒸餾水和甲苯的作用分別是？（1）目的：使紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白（2）過程加蒸餾水到原血液體積

加40％體積的甲苯置于磁力攪拌器攪拌10min紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白使紅細胞吸水脹破溶解細胞膜實驗操作（一）樣品處理思考3、分離血紅蛋白溶液（1）本步操作的目的是什么，如何進行？（2）血紅蛋白釋放后的混合液經(jīng)離心后分為哪幾層？如何獲得血紅蛋白溶液？（1）目的：經(jīng)過離心使血紅蛋白與其他雜質(zhì)分離開來，便于下一步對血紅蛋白的純化。（2）過程將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min實驗操作（一）樣品處理（3）結(jié)果：離心后試管中的溶液分為4層3、分離血紅蛋白溶液有機溶劑(無色透明)脂類物質(zhì)(白色固體)血紅蛋白水溶液(紅色透明)雜質(zhì)沉淀(暗紅色)（4）分離用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體實驗操作（二）粗分離思考（1）粗分離采用什么方法，如何進行操作？（2）該操作的目的是？利用得原理？（1）操作：取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/l的磷酸緩沖液中（pH為7.0），透析12小時（2）目的透析除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)或用于更換樣品中的緩沖液（3）原理透析袋能使小分子自由進出，而將大分子保留在袋內(nèi)實驗操作（三）純化—凝膠色譜操作閱讀教材P67-69回答下列問題1、總結(jié)凝膠色譜法的操作步驟2、色譜柱填料該如何處理？3、分析為什么凝膠的裝填要緊密均勻？為什么不能有氣泡？怎樣證明色譜柱制作成功？打孔→挖穴→安管→覆網(wǎng)→紗包→插管注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。1、凝膠色譜柱的制作：實驗操作（三）純化—凝膠色譜操作取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平底塞的制作頂塞的制作橡皮塞打孔

安裝玻璃管組裝將上述三部分按相應(yīng)位置組裝成一個整體實驗操作（三）純化—凝膠色譜操作2、凝膠色譜柱的裝填（1）凝膠的選擇：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克（2）凝膠的前處理配置凝膠懸浮液計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液操作提示：商品凝膠是干燥的顆粒，使用前需直接放在洗脫液中膨脹。可將濕凝膠用沸水浴加熱。這種方法不但節(jié)約時間，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。實驗操作（三）純化—凝膠色譜操作（3）凝膠色譜柱的裝填固定將色譜柱處置固定在支架上裝填將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻思考為什么凝膠的裝填要緊密均勻？以降低凝膠顆粒之間的空隙，以免空隙影響洗脫次序裝填時為什么不能有氣泡？因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果怎樣證明色譜柱制作成功？如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功實驗操作（三）純化—凝膠色譜操作（4）洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時注意1、液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象實驗操作（三）純化—凝膠色譜操作3、樣品加入與洗脫調(diào)節(jié)緩沖液面加入蛋白質(zhì)樣品調(diào)節(jié)緩沖液面洗脫收集分裝蛋白質(zhì)打開下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊關(guān)閉出口用吸管沿管壁環(huán)繞移動，將1ml樣品加到色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口加入20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）到適當(dāng)高度連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml一試管，連續(xù)收集注意：1.不要觸及破壞凝膠面；2.貼壁加樣；3.使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動實驗操作（四）純化鑒定：SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷純化的蛋白質(zhì)是否達到要求，需要進行蛋白質(zhì)純度的鑒定。鑒定的方法中，使用最多的是SDS---聚丙烯酰胺凝膠電泳。目的蛋白觀察處理的血液樣品離心后是否分層，如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞等一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？結(jié)果分析與評價2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。結(jié)果分析與評價3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。

紅細胞含有大量的血紅蛋白，紅細胞的機能主要是血紅蛋白完成，血紅蛋白的主要功能是攜帶氧氣或二氧化碳。我們可以選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液進行實驗，來提取和分離血紅蛋白，請回答下列有關(guān)問題：（1）血紅蛋白提取和分離的程序可分為四步：

、

、

和

。（2）實驗前取新鮮的血液，要切記在采血容器中預(yù)先加入檸檬酸鈉，取血回來，馬上進行離心，收集血紅蛋白溶液。①加入檸檬酸鈉的目的是

。②以上所述的過程即是樣品處理，它包括

、

、收集血紅蛋白溶液。樣品處理粗分離純化純度鑒定防止血液凝固紅細胞洗滌血紅蛋白的釋放課堂練習(xí)

（3）收集的血紅蛋白溶液在透析袋中可以經(jīng)過透析，這就是樣品的粗分離。

①透析的目的是

。

②透析的原理是

。