分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法

【實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法】分子生物學(xué)技術(shù)(zt)

分子生物學(xué)技術(shù)真核細(xì)胞DNA的制備與定量I質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取與純化I入噬菌體

DNA提取|DNA分子的限制性內(nèi)切酶消化|DNA片段回收與純化|目的基因的亞克隆|PCR|引物

參數(shù)計(jì)算|PCR產(chǎn)物的克隆|DNA序列測(cè)定［Southern雜交|PCR-SSCP|細(xì)胞凋亡|RNA操作

中的一般要求|RNA的制備|mRNA的分離與純化|RT-PCR|NorthernBlot|RPA|ddPCR|原位

雜交|原核表達(dá)|蛋白SDS電泳|Western］表達(dá)蛋白的分離與純化|表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性的檢

測(cè)I真核轉(zhuǎn)染

真核細(xì)胞DNA的制備與定量

制備基因組DNA是進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長(zhǎng)度不小于

100-200kb?在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的

完整性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。一般真核細(xì)胞基因組DNA有107-9bp,可以從新鮮組織、

培養(yǎng)細(xì)胞或低溫保存的組織細(xì)胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等試劑存在下用蛋白酶K

消化細(xì)胞，隨后用酚抽提而實(shí)現(xiàn)的。這一方法獲得的DNA不僅經(jīng)酶切后可用于Southern分析,

還可用于PCR的模板、文庫(kù)構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)材料來(lái)源不同，采取不同的材料處理方法，而后的DNA提取方法大體類似，但都應(yīng)考慮以

下兩個(gè)原則：(1)防止和抑制DNase對(duì)DNA的降解；(2)盡量減少對(duì)溶液中DNA的機(jī)械剪

切破壞。

一、試劑準(zhǔn)備

1.TE:10mMTris-HCI(pH7.8);ImMEDTA(pH8.0)。

2.TBS:25mMTris-HCI(pH7.4);200mMNaCI；5mMKCL

3.裂解緩沖液：250mMsDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4.20%SDS

5.2mg/ml蛋白酶K

6.Tris飽和酚(pH8.0)、酚/氯仿(酚：氯仿=1：1)、氯仿

7.無(wú)水乙醇、75%乙醇

二、操作步驟

)材料處理

1.新鮮或冰凍組織處理：

(1)取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎,加TE0.5ml,轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。

⑵將勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中。

⑶加20%SDS25ml,蛋白酶K(2mg/ml)25ml,混勻。

⑷60℃水浴l-3hr。

2.培養(yǎng)細(xì)胞處理：

⑴將培養(yǎng)細(xì)胞懸浮后，用TBS洗滌一次。

⑵離心4000gx5min,去除上清液。

⑶加10倍體積的裂解緩沖液。

(4)50-55℃水浴l-2hn

(二)DNA提取

1.加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。

2.離心5000gxl0min,取上層水相到另一1.5ml離心管中。

3.加等體積飽和酚，混勻，離心5000gxl0min,取上層水相到另一管中。

4.加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000gxl0min,取上層水相到另一管中。如水相仍不

澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。

5.加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000gxl0min,取上層水相到另一管中。

6.加1/10體積的3M醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕倒置混勻。

7.待絮狀物出現(xiàn)后，離心5000gx5min,棄上清液。

8.沉淀用75%乙醇洗滌，離心5000gx3min,棄上清液。

9.室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100mlTE溶解過(guò)夜。

(=)DNA定量和電泳檢測(cè)

1.DNA定量：

DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中

在230nm處。因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定DNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約

50|jg/ml雙鏈DNA。如用1cm光徑，用H2O稀釋DNA樣品n倍并以H2。為空白對(duì)照，根

據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：DNA(mg/ml)=50xOD260讀數(shù)x

稀釋倍數(shù)/1000。

DNA純品的OD260/OD280為1.8,故根據(jù)OD260/OD280的值可以估計(jì)DNA的純度。若

比值較高說(shuō)明含有RNA,比值較低說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在。OD230/OD260的比值應(yīng)在

0.4-0.5之間，若比值較高說(shuō)明有殘余的鹽存在。

2.電泳檢測(cè)：

取l|jg基因組DNA用行0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測(cè)DNA的完整性，或多個(gè)樣品的濃度是

否相同。電泳結(jié)束后在點(diǎn)樣孔附近應(yīng)有單一的高分子量條帶。

三、注意事項(xiàng)

1.所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘余的DNA酶。

2.所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制。

3.用大口滴管或吸頭操作，以盡量減少打斷DNA的可能性。

4.用上述方法提取的DNA純度可以滿足一般實(shí)驗(yàn)(如Southern雜交、PCR等)目的。如要

求更高，可參考有關(guān)資料進(jìn)行DNA純化。

質(zhì)粒DNA的堿裂解法提取與純化

細(xì)菌質(zhì)粒是一類雙鏈、閉環(huán)的DNA,大小范圍從lkb至200kb以上不等。各種質(zhì)粒都是存在

于細(xì)胞質(zhì)中、獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的自主復(fù)制的遺傳成份，通常情況下可持續(xù)穩(wěn)定地處于染色

體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下也會(huì)可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制，

并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。

質(zhì)粒己成為目前最常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子。

目前已有許多方法可用于質(zhì)粒DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法,其基本原理為：當(dāng)菌體在NaOH和SDS

溶液中裂解時(shí)，蛋白質(zhì)與DNA發(fā)生變性，當(dāng)加入中和液后，質(zhì)粒DNA分子能夠迅速?gòu)?fù)性，呈

溶解狀態(tài)，離心時(shí)留在上清中；蛋白質(zhì)與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時(shí)可沉淀下來(lái)。

純化質(zhì)粒DNA的方法通常是利用了質(zhì)粒DNA相對(duì)較小及共價(jià)閉環(huán)兩個(gè)性質(zhì)。例如，氯化鈉-

濱化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、聚乙二醇分級(jí)沉淀等方法，但這些方法

相對(duì)昂貴或費(fèi)時(shí)。對(duì)于小量制備的質(zhì)粒DNA,經(jīng)過(guò)苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等

簡(jiǎn)單步驟去除殘余蛋白質(zhì)和RNA,所得純化的質(zhì)粒DNA已可滿足細(xì)菌轉(zhuǎn)化、DNA片段的分離

和酶切、常規(guī)亞克隆及探針標(biāo)記等要求，故在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用。

一、試劑準(zhǔn)備

1.溶液1:50mM葡萄糖，25mMTris-HCI（pH8.0）,10mMEDTA（pH8.0）。IM

Tris-HCI（pH8.0）12.5ml,0.5MEDTA（pH8.0）10ml,葡萄糖4.730g,加ddH20至

500mL在10Ibf/in2高壓滅菌15min,貯存于4℃。

2.溶液H：0.2NNaOH,1%SDS。2NNaOH1ml,10%SDS1ml,力口ddH20至10ml。

使用前臨時(shí)配置。

3.溶液IH：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH4.8。5MKAc300ml,冰醋酸57.5ml,加ddH20

至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.TE：lOmMTris-HCI（pH8.0）,ImMEDTA（pH8.0）.IMTris-HCI（pH8.0）lml,

0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml,加ddH2。至100ml。15Ibf/in2高壓濕熱滅菌20min,4℃

保存?zhèn)溆谩?/p>

5.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）

6.乙醇（無(wú)水乙醇、70%乙醇）

7.5xTBE：Tris堿54g,硼酸27.5g,EDTA-Na2?2H2O4.65g,力口ddH20至1000ml。

15Ibf/in2高壓濕熱滅菌20min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8.澳化乙錠（EB）：10mg/ml

9.RNaseA（RNA酶A）：不含DNA酶（DNase-free）RNaseA的lOmg/ml,TE配制，沸

水加熱15min,分裝后貯存于-20℃。

10.6xloadingbu仟er■（上樣緩沖液）：0.25%濱酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF,40%（W/V）

蔗糖水溶液。

11.1%瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml0.5xTBE,微波爐加熱至完

全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5|jg/ml（注意：EB為強(qiáng)誘

變劑，操作時(shí)帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min

以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5XTBE）,即可上樣。

二、操作步驟

1.挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單菌落，接種于2.0mlLB（含相應(yīng)抗生素）液體培養(yǎng)基中，

37℃、250g振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約12-14hr）。

2.取1.5ml培養(yǎng)物入微量離心管中，室溫離心8000gxlmin,棄上清，將離心管倒置，使液

體盡可能流盡。

3.將細(xì)菌沉淀重懸于100川預(yù)冷的溶液I中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。

4.加200口1新鮮配制的溶液H,顛倒數(shù)次混勻（不要?jiǎng)×艺袷帲?，并將離心管放置于冰上2-3min,

使細(xì)胞膜裂解（溶液11為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。

5.加入1503預(yù)冷的溶液in,將管溫和顛倒數(shù)次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5mino

溶液HI為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同

時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。

6.加入450川的苯酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心12000gx10min。

7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置

2-5min,4℃離心12000gxl5min。

8.1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4℃離心8000gx7min,棄上清，將沉淀在室溫下

晾干。

9.沉淀溶于20|jlTE(含RNaseA20|jg/ml),37℃水浴30mm以降解RNA分子，-20℃保

存?zhèn)溆谩?/p>

三、質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)

觀察瓊脂凝膠中DNA的最簡(jiǎn)單方法是利用熒光染料演化乙錠進(jìn)行染色。該物質(zhì)含有一個(gè)可以嵌

入DNA的堆積堿基之間的一個(gè)平面基團(tuán)，這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致染

料與DNA結(jié)合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫

外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，

被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來(lái)。因此，當(dāng)凝膠中含有游離漠化乙

錠時(shí)即可以檢測(cè)到少量的DNA。

取制備的質(zhì)粒DNA1-2口1,加適當(dāng)loadingbuffer混勻上樣，采用l-5V/cm的電壓，使DNA

分子從負(fù)極向正極移動(dòng)至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測(cè)，攝片。

四、注意事項(xiàng)

本裂解法小量制備質(zhì)粒DNA重復(fù)性好，一般無(wú)麻煩。若所提取質(zhì)粒DNA不能被限制性內(nèi)切酶

切割，可通過(guò)酚/氯仿再次抽提，以清除雜質(zhì)來(lái)解決問(wèn)題。

入噬菌體DNA提取

入噬菌體是最早使用的克隆載體，入噬菌體的基因組是一長(zhǎng)度約為50kb的雙鏈DNA分子，它

在宿主細(xì)胞有兩種生活途徑，其一是裂解生長(zhǎng)，環(huán)狀DNA分子在細(xì)胞內(nèi)多次復(fù)制，合成大量噬

菌體基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌再進(jìn)行下一次感染；其二是溶源性生長(zhǎng)，即感染

細(xì)胞內(nèi)入噬菌體DNA整合到宿主菌染色體DNA中與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)

胞不裂解。平板培養(yǎng)時(shí)，裂解生長(zhǎng)形成噬斑。液體培養(yǎng)時(shí)，裂解生長(zhǎng)使菌液中宿主菌最后全部被

裂解而釋放出大量的噬菌體顆粒。經(jīng)過(guò)改造的A噬菌體克隆位點(diǎn)可插入幾到幾十kb的外源

DNAo許多CDNA和基因組文庫(kù)是以入噬菌體作為克隆載體構(gòu)建的。因此，在經(jīng)文庫(kù)篩選得到

目的克隆后，我們常常需要利用人噬菌體裂解生長(zhǎng)的特點(diǎn)，培養(yǎng)獲得大量的噬菌體顆粒，并提

取A噬菌體DNA來(lái)開展進(jìn)一步的工作。

一、試劑準(zhǔn)備

1.LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白陳(細(xì)菌培養(yǎng)用)10g,酹母提取物(細(xì)菌培養(yǎng)用)5g,NaCI10g,

力口ddH2O至1000ml,完全溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。

2.1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基：稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶，力口lOOmILB,15Ibf/in2

高壓滅菌20min,稍冷卻，制備平皿。

3.20%麥芽糖：麥芽糖20g,加ddH20至100ml,0.22pm濾膜過(guò)濾。

4.SM液：NaCI5.8g,MgSO4?7H2O2g,IMTris?CL(PH7.5)50ml,2%明膠5ml,

加ddH20至1000ml。15lbf/in2高壓滅菌20min。

5.RNaseAlOmg/ml,TE配制，沸水浴15min,分裝后貯存于-20℃。

6.DNaseIlOmg/ml,TE配制，分裝后貯存于-20℃。

7.PEG8000

8.10%SDS

9.EDTA:0.5MpH8.0

3.苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）

4.異丙醇

5.無(wú)水乙醇、70%乙醇

二、操作步驟

1.入噬菌體平板培養(yǎng)

⑴用SM液10倍梯度稀釋入噬菌體原種。

⑵取0.1ml各梯度稀釋離心到一消毒微量離心管中，加0.2ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，加麥芽糖

（0.2%）,MgSO4（10mm）,37'C溫育20min,使噬菌體顆粒吸附于細(xì)菌。

⑶取熔化（47℃）0.7%瓊脂LB固體培養(yǎng)基3ml與上述管混勻，立即倒入預(yù)備（2-4天）的

含凝固1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基的平板內(nèi)，輕輕晃動(dòng)平板便均勻分布。

⑷37"。培養(yǎng)6-8hr后，觀察噬斑形成。

⑸用剪去部分頭部的吸頭挖取單個(gè)噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震蕩。37℃

溫育lOmin.

（6）重復(fù)⑴-（4）,獲得單個(gè)噬斑滴度。

2.入噬菌體液體培養(yǎng)

⑴取2ml新鮮培養(yǎng)的宿主菌，離心，0.4mlLB培養(yǎng)基重懸，加入噬菌體0.1ml（新鮮獲得的

單個(gè)噬斑，依滴度使之與宿主菌比約1/500-1000）?

（2）加麥芽糖（0.2%）,MgS04（10mM）,37℃溫育20min,使噬菌體顆粒吸附于細(xì)菌。

（3）力口至ij100mlLB液體培養(yǎng)基中，加麥芽糖（0.2%）,1^$。4（1001乂）,370搖震培養(yǎng)9-12M

后可見裂解發(fā)生。

⑷加0.1ml氯仿,37℃繼續(xù)搖震培養(yǎng)10-20min?

（二）人噬菌體DNA提取

1.將上述裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，離心8000gxl0min,去細(xì)菌碎片，取上清液。

2.加RNaseA、DNasel至l|jg/ml,37℃溫育30min。

3.力口9.3gPEG8000,5.8gNaCI,搖勻至溶解，冰浴lhr或4℃過(guò)夜。

4.4℃離心lOOOOgx20min,去上清液。

5.力口2mlsM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量離心管，加20川10%SDS,20pl0.5M

EDTA,68℃15min?

6.加等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）,混勻，離心12000gx5min,取上層液到一新微

量離心管，加等體積氯仿/異戊醇（24：1）,混勻，離心12000gx5min。

7.取上層液到一新微量離心管，加等體積異丙醇，混勻，-20℃lhr,4℃離心12000gxl0min,

去上清液。

8.1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4℃離心8000gx7min,棄上清，將沉淀室溫下晾

干。

9.沉淀溶于20|jlTE,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、注意事項(xiàng)

1.用于裂解的噬菌體、宿主菌為新鮮培養(yǎng)獲得時(shí)，裂解好、裂解噬菌體收獲量大。

2.液體培養(yǎng)裂解時(shí)，如到培養(yǎng)時(shí)間時(shí)裂解尚未發(fā)生，可適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度或加大搖震速度。

3.RNaseA、Dnasel消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌體。

4.苯酚/氯仿抽提時(shí)，注意PEG、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，它們會(huì)影響限制性內(nèi)切酶切割。

DNA分子的限制性內(nèi)切酶消化

限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識(shí)別序列的DNA序列位點(diǎn)上并在此切割雙鏈

DNA。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別長(zhǎng)度為4、5或6個(gè)核甘酸且呈二重對(duì)稱的特異序列，切割

位點(diǎn)相對(duì)于二重對(duì)稱軸的位置因酶而異。一些酶恰在對(duì)稱軸處同時(shí)切割DNA雙鏈而產(chǎn)生帶平端

的DNA片段，另一些酶則在對(duì)稱軸兩側(cè)相對(duì)的位置上分別切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突出端（即

粘端）的DNA片段。1個(gè)單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50pl體積1小時(shí)內(nèi)完全切

開IpgA噬菌體DNA所需的酶量。不同的限制性內(nèi)切酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應(yīng)

條件，甚至對(duì)同一種酶也如此。但是，幾乎所有的生產(chǎn)廠家都對(duì)其生產(chǎn)的酶制劑優(yōu)化過(guò)反應(yīng)條件，

因此購(gòu)買的內(nèi)切酶說(shuō)明書上均有其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，同時(shí)提供有酶切緩沖液（buffer,10x、

5x）和最適條件，使得酶切反應(yīng)變得日益簡(jiǎn)單。

一、限制性內(nèi)切酶對(duì)DNA消化的一般方案

1.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。

2.203體積反應(yīng)體系如下：

DNA0.2-1pg

10x酶切buffer2.0pl

限制性內(nèi)切酶1-2u（單位）

加ddH20至20pl

限制性內(nèi)切酶最后加入，輕輕混勻，稍加離心，放置于最適溫度水浴并按所需的時(shí)間溫育，一般

為37℃水浴消化lhr?

3.用于回收酶切片段時(shí)，反應(yīng)總體積可達(dá)50-200川，各反應(yīng)組分需相應(yīng)增加。

4.多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或

高鹽的酶消化。

5.酶切結(jié)束時(shí)，加入0.5MEDTA（pH8.0）使終濃度達(dá)10mM,以終止反應(yīng)。或?qū)⒎磻?yīng)管在

65℃水浴放置lOmin以滅活限制性內(nèi)切酶活性。

6.如消化反應(yīng)體積過(guò)大，電泳時(shí)加樣孔盛不下，可加以濃縮：終止反應(yīng)后，加入0.6體積的5M

乙酸筱（或1/10體積3MNaAc）和2倍體積無(wú)水乙醇，在冰上放置5min,然后于49離心

12000gx5min。傾去含大部分蛋白質(zhì)的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量TE中（pH

7.6）o

7.如要純化消化后的DNA,可用等體積酚/氯仿（1：1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。

二、電泳檢測(cè)

取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物適量，加適當(dāng)loadingbuffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)?；?和酶切的空載體

（如有）作對(duì)照，采用l-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)，至合適位置取出置

紫外燈下檢測(cè)，攝片。

三、注意事項(xiàng)

1.濃縮的限制性內(nèi)切酸可在使用前以lx限制酶緩沖液稀釋，切勿用水稀釋以免酶變性。

2.購(gòu)買的限制性內(nèi)切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是穩(wěn)定的。進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除能以

外的所有反應(yīng)成分加入后即混勻，再?gòu)?20C冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應(yīng)

更換一個(gè)無(wú)菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20℃冰箱。

3.盡量減少反應(yīng)體積，但要確保酶體積不超過(guò)反應(yīng)總體積的10%,否則酶活性將受到甘油的抑

制。

4.通常延長(zhǎng)時(shí)間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時(shí)可用。在消化過(guò)程中可取少量反應(yīng)液

進(jìn)行微量凝膠電泳以檢測(cè)消化進(jìn)程。

5.注意星號(hào)酶切活力。

DNA片段回收與純化

質(zhì)粒、噬菌體等經(jīng)酶切，電泳；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，常常需要對(duì)一些DNA電泳片段進(jìn)行回收和

純化，用于亞克隆、探針標(biāo)記等。DNA回收和純化常用方法有壓碎法、低融點(diǎn)瓊脂糖法、凍融

法等，也有現(xiàn)成的試劑盒供應(yīng)。

一、凍融法

1.紫外燈下仔細(xì)切下含待回收DNA的膠條，將切下的膠條（小于0.6g）搗碎，置于1.5ml

離心管中；

2.加入等體積的Tris-HCI飽和酚（pH7.6）,振蕩混勻；

3.-20℃放置5-lOmin；

4.4℃離心10000gx5min,上層液轉(zhuǎn)移置另一離心管中；

5.加入1/4體積H2O于含膠的離心管中，振蕩混勻；

6.-20℃,放置5-10min；

7.4℃離心10000gx5min,合并上清液；

8.用等體積酚/氯仿、氯仿分別抽提一次，取上清；

9.加入1/10體積3MNaAc（pH5.2）、2.5倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻；

10.-20℃,靜置30min；

11.4°C離心13000gxl0min,棄上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；

12.加適量H2?；騎E溶解沉淀。

二、DNA回收試劑盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）

1.紫外燈下仔細(xì)切下含待回收DNA的凝膠，置L5ml離心管中，稱重。

2.加入BufferQG（每100mg凝膠加BufferQG300|jl）,置50℃水浴10min?

3.若回收片段小于500bp或大于4kb,則需加入異丙醇（每100mg凝膠加異丙醇lOOpI）,

混勻。

4.將小柱放在2ml收集管上，將上述溶液加于柱上。

5.4℃離心13000gxlmin,棄去收集管中液體。

6.力口入5003BufferQG于柱上，4℃離心13000gxImin,棄去收集管中液體。

7.加入7503BufferPE于柱上，4℃離心13000gxlmin,棄去收集管中液體。

8.40c離心13000gxlmin。棄去收集管。

9.將柱放于一新1.5ml離心管上，加50plEB于柱上。放置lmin,4℃離心13000gxlmin。

10.取5川回收DNA電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無(wú)DNA污染的新刀片，

其目的在于防止外源DNA的污染。

目的基因的亞克隆

所謂亞克隆就是對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆，其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一

步分析，或者進(jìn)行重組改造等。

亞克隆的基本過(guò)程包括：（1）目的DNA片段和載體的制備；（2）目的DNA片段和載體的連接；

（3）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；（4）重組子篩選。

一、試劑準(zhǔn)備

LLB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白腺（細(xì)菌培養(yǎng)用）10g,酵母提取物（細(xì)菌培養(yǎng)用）5g,NaCI10g,

力「ddH2O至1000ml,完全溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。

2.1.5%瓊脂LB固體培養(yǎng)基：稱取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶，力口100mlLB,15Ibf/in2

高壓滅菌20min,稍冷卻，制備平皿。

3.IPTG、X-Gal

4.0.1MMgCI2：15Ibf/in2高壓滅菌20min,0℃冰浴備用。

5.0.1MCaCI2（以20%甘油水溶液配制）：15Ibf/in2高壓滅菌20min,冰浴備用。

6.限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶。

二、目的DNA片段和載體的制備

選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶，消化已知目的DNA和載體，獲得線性DNA,用于重組。根據(jù)

目的DNA和載體的具體情況，選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?，分別產(chǎn)生對(duì)稱性粘性末端

（用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端）、不對(duì)稱粘性末端（用兩種不同的限制

性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端）、平端。在亞克隆時(shí)，首選不對(duì)稱相容末端連接，

次選對(duì)稱性粘性相容性末端連接，由于平末端連接效率較低，通常很少采用。但有時(shí)目的片段的

末端與載體不匹配，一般先將不匹配末端補(bǔ)平，然后再以平末端連接。（實(shí)驗(yàn)操作同前述）

三、利用T4DNA連接酶進(jìn)行目的DNA片段和載體的體外連接

（-）連接要求和結(jié)果

外源DNA片段末端性質(zhì)連接要求連接結(jié)果

不對(duì)稱粘性末端兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率載體與外源DNA連

接處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ?；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。

對(duì)稱性粘性末端線形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理載體與外源DNA連接處的限制酶

切位點(diǎn)?？杀Ａ?；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；外源DNA會(huì)以兩個(gè)方向插入到載體

中。

平端要求高濃度的DNA和連接酶載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)消失；重組

質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；非重組克隆的背景較高。

帶有相同末端（平端或粘端）的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線性質(zhì)粒載體中，但是

在連接反應(yīng)時(shí)，外源DNA和質(zhì)粒都可能發(fā)生環(huán)化,也有可能形成串聯(lián)寡聚物。因此，必須仔細(xì)調(diào)

整連接反應(yīng)中兩個(gè)DNA的濃度，以便使''正確”連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最佳水平，此外還常常使用

堿性磷酸酶去除5’磷酸基團(tuán)以抑制載體DNA的自身環(huán)化。利用T4DNA連接酶進(jìn)行目的DNA

片段和教體的體外連接反應(yīng)，也就是在雙鏈DNA5’磷酸和相鄰的3’羥基之間形成新的共價(jià)鍵。

如載體的兩條鏈都帶有5’磷酸（未脫磷），可形成4個(gè)新的磷酸二酯鍵；如載體DNA己脫磷，

則只能形成2個(gè)新的磷酸二酯鍵，此時(shí)產(chǎn)生的重組DNA帶有兩個(gè)單鏈缺口，在導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞

后可被修復(fù)。

（-）T4DNA連接酶對(duì)目的DNA片段和載體連接的一般方案

1.連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。

2.10pl體積反應(yīng)體系中：取載體50-lOOng,加入一定比例的外源DNA分子（一般線性載

體DNA分子與外源DNA分子摩爾數(shù)為1：1-1：5）,補(bǔ)足ddH20至8川。

3.輕輕混勻，稍加離心，56°C水浴5min后，迅速轉(zhuǎn)入冰浴。

4.力口入含ATP的lOxBuffer1葉T4DNA連接酶合適單位，用ddH20補(bǔ)至10可，稍加

離心，在適當(dāng)溫度（一般14-16℃水?。┻B接8-14hr。

四、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

1.感受態(tài)細(xì)胞的制備

⑴保存于-70"C的DH5a（或其他菌種）用接種環(huán)劃菌于L5%瓊脂平板上，37℃恒溫倒置培

養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（約14-16hr）o

⑵挑取單菌落，接種于2.0mlLB液體培養(yǎng)基中，37。恒溫，250g振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約12hr）?

⑶取0.5ml過(guò)夜培養(yǎng)液,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2-2.5hr■，至OD600

為0.4-0.5時(shí),放置于4℃冰箱冷卻l-2hr.

（注：以下操作均應(yīng)在冰浴中進(jìn)行。）

⑷將培養(yǎng)液分入兩個(gè)50ml離心管中，4℃離心，4000gxl0min,棄去上清，用冰浴的0.1M

MgCI225ml懸浮30min。

⑸4℃離心,4000gxl0min,棄去上清，加入冰浴的0.1MCaCI2-甘油溶液1ml懸浮。

（6）以100川/管分裝入1.5ml離心管中，-7CTC凍存?zhèn)溆谩?/p>

注：此法制備感受態(tài)細(xì)胞，可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5x106-2x107個(gè)菌落，這樣的

轉(zhuǎn)化效率足以滿足所有在質(zhì)粒中進(jìn)行的常規(guī)克隆的需要，制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70℃,但

保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使轉(zhuǎn)化效率在一定程度上受到影響，一般三個(gè)月以內(nèi)轉(zhuǎn)化效率無(wú)多大改變。

2.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

⑴取lOOpI貯存于-70'C鈣化菌，冰浴化開；

⑵加入適量連接產(chǎn)物（一般不超過(guò)10小，輕輕混勻，冰浴20min；

⑶于42℃熱休克90s,迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中，繼續(xù)冰浴2-3min；

⑷加入LB液體培養(yǎng)基200|jl,于37℃緩搖孵育45min；

⑸將培養(yǎng)物適量涂于1.5%瓊脂LB平板（根據(jù)質(zhì)粒性質(zhì)添加抗生素或/和X-Gal/IPTG）,待膠

表面沒有液體流動(dòng)時(shí)，37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr。

五、重組子的篩選

根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如Q-互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)

大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有0-半乳糖甘酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸

的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）,它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾

個(gè)氨基酸插入到B-半乳糖甘酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼0-半乳糖首酶C

端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可

形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近

操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為Q-互補(bǔ)。由Q-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑

IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA

插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)a-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組

質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)

物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。

六、注意事項(xiàng)

1.目的DNA片段制備、回收、純化時(shí)，應(yīng)避免外來(lái)DNA污染。

2.不同廠家生產(chǎn)的T4DNA連接酶反應(yīng)條件稍有不同，但其產(chǎn)品說(shuō)明書上均有最適反應(yīng)條件，

包括對(duì)不同末端性質(zhì)DNA分子連接的T4DNA連接酶的用量、作用溫度、時(shí)間等。同時(shí)提供有

連接酶緩沖液(10x,5x、2x),其中多己含有要求濃度的ATP,應(yīng)避免高溫放置和反復(fù)凍融

使其分解。

2.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當(dāng)?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力，

因此可將上述連接產(chǎn)物通過(guò)熱刺激或電脈沖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)菌大量增殖的同時(shí)，導(dǎo)入的重

組DNA也得到增殖。

3.制備感受態(tài)細(xì)胞所用離心管、培養(yǎng)瓶最好經(jīng)酸堿處理或使用新的，15Ibf/in2高壓滅菌

20min。

5.白色菌落中重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段是否是目的片段需通過(guò)鑒定。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一

種方法，為最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。典型的PCR由(1)高溫變性模板；(2)引物與模

板退火；(3)引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，通過(guò)多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅

速擴(kuò)增。其主要步驟是：將待擴(kuò)增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單

鏈；人工合成的兩個(gè)寡核甘酸引物在其合適的復(fù)性溫度下分別與目的基因兩側(cè)的兩條單鏈互補(bǔ)結(jié)

合，兩個(gè)引物在模板上結(jié)合的位置決定了擴(kuò)增片段的長(zhǎng)短；耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在

72℃將單核甘酸從引物的3'端開始摻入，以目的基因?yàn)槟０鍙?'-3'方向延伸，合成DNA的

新互補(bǔ)鏈。

PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混

合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問(wèn)世

就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核甘酸序列

分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和

傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中

有著以下多種用途：

(1)生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針；

(2)由少量mRNA生成cDNA文庫(kù)；

(3)從CDNA中克隆某些基因；

(4)生成大量DNA以進(jìn)行序列測(cè)定；

(5)突變的分析；

(6)染色體步移；

(7)RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態(tài)性分析等。

一、試劑準(zhǔn)備

1.DNA模版

2.對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物

3.IOXPCRBuffer

4.2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5.Bq酶

二、操作步驟

1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

IOxPCRbuffer5pl

dNTPmix(2mM)4pl

引物l(10pM)2pl

引物2(lOpM)2pl

Taq酶(2U/|jl)1pl

DNA模板(50ng-l|jg/pl)1pl

加ddH20至50pl

視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃

預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃40s-58'C30s-72℃60s,循環(huán)30-35

次，最后在72℃保溫7min。

3.結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4.PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除

去石蠟油；否則，直接取5-10pl電泳檢測(cè)。

三、PCR反應(yīng)體系的組成與反應(yīng)條件的優(yōu)化

PCR反應(yīng)體系由反應(yīng)緩沖液（lOxPCRBuffer）,脫氧核昔三磷酸底物（dNTPmix）、耐熱

DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核甘酸引物（Primeri,Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分

組成。各個(gè)組份都能影響PCR結(jié)果的好壞。

1.反應(yīng)緩沖液：一般隨TaqDNA聚合酶供應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液含：50mMKCI,10mMTris-HCI

（PH8.3室溫），1.5mMMgCI2。Mg2+的濃度對(duì)反應(yīng)的特異性及產(chǎn)量有著顯著影響。濃度過(guò)

高，使反應(yīng)特異性降低；濃度過(guò)低，使產(chǎn)物減少。在各種單核甘酸濃度為200|jM時(shí)，Mg2+為

L5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當(dāng)增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA

及dNTP條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，也必須相應(yīng)調(diào)節(jié)Mg2+的濃度。據(jù)經(jīng)驗(yàn)，一般以1.5-2mM（終

濃度）較好。

2.dNTP：高濃度dNTP易產(chǎn)生錯(cuò)誤摻入，過(guò)高則可能不擴(kuò)增；但濃度過(guò)低，將降低反應(yīng)產(chǎn)

物的產(chǎn)量。PCR中常用終濃度為50-400|JM的dNTPo四種脫氧三磷酸核甘酸的濃度應(yīng)相同，

如果其中任何一種的濃度明顯不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)誘發(fā)聚合酶的錯(cuò)誤摻入作

用，降低合成速度，過(guò)早終止延伸反應(yīng)。此外，dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度

降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應(yīng)中起重要作用的Mg2+濃度。

3.TaqDNA聚合酶酶：在100川反應(yīng)體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達(dá)到每min延

伸1000-4000個(gè)核甘酸的摻入速度。酶量過(guò)多將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。但是，不同的公司

或不同批次的產(chǎn)品常有很大的差異，由于酶的濃度對(duì)PCR反應(yīng)影響極大，因此應(yīng)當(dāng)作預(yù)試驗(yàn)或

使用廠家推薦的濃度。當(dāng)降低反應(yīng)體積時(shí)（如20川或503），一般酶的用量仍不小于2U,否

則反應(yīng)效率將降低。

4.引物：引物是決定PCR結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計(jì)在PCR反應(yīng)中極為重要。要保證PCR反應(yīng)

能準(zhǔn)確、特異、有效地對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下幾條原則：

⑴引物的長(zhǎng)度以15-30bp為宜，一般（G+C）的含量在45-55%,Tm值高于55℃

[Tm=4（G+C）+2（A+T）]。應(yīng)盡量避免數(shù)個(gè)喋吟或嘴咤的連續(xù)排列，堿基的分布應(yīng)表現(xiàn)出是

隨機(jī)的。

（2）引物的3'端不應(yīng)與引物內(nèi)部有互補(bǔ)，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物在3'端不應(yīng)出現(xiàn)

同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。兩條引

物間配對(duì)堿基數(shù)少于5個(gè)，引物自身配對(duì)若形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，莖的堿基對(duì)數(shù)不能超過(guò)3個(gè)由于影

響引物設(shè)計(jì)的因素比較多，現(xiàn)常常利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)。

⑶人工合成的寡聚核甘酸引物需經(jīng)PAGE或離子交換HPLC進(jìn)行純化。

（4）引物濃度不宜偏高，濃度過(guò)高有兩個(gè)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer）,二

是當(dāng)擴(kuò)增微量靶序列并且起始材料又比較粗時(shí)，容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。一般說(shuō)來(lái)，用低濃度引

物不僅經(jīng)濟(jì)，而且反應(yīng)特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/|jl較好。

⑸引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約IOORM）,保存于-20℃。使用前取出其中一部

分用ddH20配制成10州或20|JM的工作液。

5.模板：PCR對(duì)模板的要求不高，單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用

極微量的樣品（甚至是來(lái)自單一細(xì)胞的DNA）作為摸板，但為了保證反應(yīng)的特異性，一般還宜

用pg水平的基因組DNA或104拷貝的待擴(kuò)增片段作為起始材料。原材料可以是粗制品，某些

材料甚至僅需用溶劑一步提取之后即可用于擴(kuò)增，但混有任何蛋白醐、核酸酶、TaqDNA聚合

酶抑制劑以及能結(jié)合DNA的蛋白，將可能干擾PCR反應(yīng)。

6.PCR循環(huán)加快，即相對(duì)減少變性、復(fù)性、延伸的時(shí)間，可增加產(chǎn)物的特異性。

四、注意事項(xiàng)

1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純

化的方法越簡(jiǎn)單越好。

3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

4.PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22pm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

5.試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確

保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

6.試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅

菌。

7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

PCR產(chǎn)物的克隆

PCR產(chǎn)物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。

平頭連接是將制備好的平頭載體和補(bǔ)平或削平的PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行連接。載體可用EcoRV或

SmaI切成平頭；PCR產(chǎn)物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所

具有的3'-5'外切酶活性和5'—3'的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產(chǎn)物也可不加處理。如

果使用Stratagene公司的pfuDNA聚合酶或NewEnglandBiolabs公司的VentDNA聚合

酶，這兩種酶有5'-3'校對(duì)能力，擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物已經(jīng)是平頭，可以不作平端處理。平端

連接的一個(gè)顯而易見的缺陷是連接效率低下，即使使用很高單位的連接酶，或在反應(yīng)體系中加入

PEG8000,也只能很有限地提高效率。

粘頭連接也可以大致分為兩類，一類粘頭連接是用某種方法，在載體和PCR產(chǎn)物上產(chǎn)生長(zhǎng)的可

互補(bǔ)的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5'端加入一段某種限制酶的識(shí)別序列。如果兩個(gè)引

物選用不同的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，就可以做到定向連接。另一類利用部分PCR產(chǎn)物3'端帶

有一個(gè)凸出的dAMP的特性，構(gòu)建3'端帶有凸出的dTMP的載體。一般采用的方法是先把載體

用某種限制性內(nèi)切酶消化成平頭，在70℃或72℃下在只加入一種dNTP、即dTTP的反應(yīng)體系

中用TaqDNA聚合酶處理半小時(shí)（也有人報(bào)道處理1?2小時(shí)能提高克隆效率，這樣加T反應(yīng)

會(huì)更徹底）。也可以用末端轉(zhuǎn)移酶來(lái)完成加T反應(yīng)。載體自連、PCR產(chǎn)物串連可以忽略。如果使

用ddTTP,效果會(huì)更好。這種方法一般稱為加T/A法克隆，比平頭連接效率高50?100倍。

一、PCR產(chǎn)物的TA克隆1.TA克隆構(gòu)建原理：TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司（SanDiego,

CA）發(fā)展而來(lái)的商業(yè)性試劑盒，它用于PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。其原理是利用Taq酶能夠在

PCR產(chǎn)物的3'末端加上一個(gè)非模板依賴的A,而T載體是一種帶有3'T突出端的載體，在連接

酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中。

2.操作步驟

⑴連接反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。

⑵體積反應(yīng)體系如下：

①取T載體1川（50ng）,加入等摩爾數(shù)PCR產(chǎn)物。

②加入含ATP的lOxBufferIpl,T4DNA連接酶合適單位，用ddH2O補(bǔ)足至10|jl。

⑶稍加離心，通常為14-16℃水浴連接8-14hr,或4℃過(guò)夜。

⑷轉(zhuǎn)染，藍(lán)白斑篩選同前。

二、注意事項(xiàng)

1.要獲得目的基因的TA克隆，PCR產(chǎn)物的特異性要好。

2.PCR產(chǎn)物在TA克隆前要通過(guò)純化。

3.在PCR產(chǎn)物回收、純化過(guò)程中防止外來(lái)DNA污染。

放射性同位素標(biāo)記的DNA序列測(cè)定分析

測(cè)定DNA的核甘酸序列是分析基因結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的前提。從小片段重疊法到加減法、雙脫氧

鏈終止法、化學(xué)降解法、自動(dòng)測(cè)序，DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展很快。目前在實(shí)驗(yàn)室手工測(cè)序常用Sanger

雙脫氧鏈終止法。Sanger法就是使用DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定DNA核甘酸序列的

方法。它要求使用一種單鏈的DNA模板或經(jīng)變性的雙鏈DNA模板和一種恰當(dāng)?shù)腄NA合成引

物。其基本原理是DNA聚合酶利用單鏈的DNA模板，合成出準(zhǔn)確互補(bǔ)鏈，在合成時(shí)，某種dNTP

換成了ddNTP,這時(shí)，DNA聚合酶利用2',3'-雙脫氧核昔三磷酸作底物，使之摻入到寡核甘酸

鏈的3'末端，導(dǎo)致3'末端無(wú)3'-OH,從而終止DNA鏈的生長(zhǎng)，雙脫氧核甘酸的種類不同，摻

入的位置不同就造成了在不同的專一位置終止的長(zhǎng)度不同的互補(bǔ)鏈。通過(guò)摻入放射性核甘酸和聚

丙烯酰胺凝膠電泳，即可讀出模板DNA的互補(bǔ)鏈序列。

一、試劑準(zhǔn)備

1.硅化液：四氯化碳250ml,二氯二甲基硅烷25ml。

2.6%變性PAGE膠的配制：丙烯酰胺28.5g,N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺1.5g,lOxTBE

50ml,尿素210g,加ddH20至500ml攪拌溶解，0.22pm濾膜過(guò)濾，4℃貯存于棕色瓶中。

使用時(shí)取50ml加入催化劑過(guò)硫酸錢（25%）50pl,TEMED50|jl,輕搖混勻，立即灌膠。

3.質(zhì)粒DNA堿變性液：NaOH2M,NaAc3M（pH4.8）,無(wú)水乙醇，70%乙醇。

4.T7測(cè)序試劑盒。

二、操作步驟

1.測(cè)序板硅化，流水、ddH20洗，無(wú)水乙醇洗，晾干。

2.灌膠：裝好測(cè)序板，玻璃板以15-30。角度傾斜放置，用50ml注射器將凝膠灌到兩塊玻璃

之間，將鯊魚齒梳子的平端插入膠的上緣，深約0.5-lcm。夾好，將測(cè)序板放水平。聚合約3hr

后預(yù)甩泳。

3.預(yù)電泳：按照說(shuō)明要求安裝好電泳裝置，在上槽和下槽注入IxTBE。設(shè)置溫度50C,功率

100W,時(shí)間約30min。

（同時(shí)準(zhǔn)備測(cè)序反應(yīng)）

4.質(zhì)粒DNA雙鏈堿變性：DNA3-5明溶于32川ddH20中，加2NNaOH8pl,混勻，室

溫靜置15min.加3MNaAc7川,無(wú)水乙醇120pl,混勻，-20℃放置30min?離心12000gx

15min,棄上清，70%乙醇5003洗一次，離心12000gx7min。棄上清，晾干沉淀，10pl

滅菌ddH20溶解。

5.模板與引物復(fù)性：加2口1測(cè)序引物、2川Annealingbuffer,混勻，稍稍離心，65℃溫育

5min,立即放置于37℃10min,室溫5min以上。

6.標(biāo)記反應(yīng)：加3|JIlabelingmixture、1川相應(yīng)放射性同位素（lOpCiX23T7測(cè)序酶

（使用前以稀釋液1：5稀釋），混勻，離心，置37t5min。

7.預(yù)先準(zhǔn)備四個(gè)0.5ml微量離心管，標(biāo)上A、C、G、T,分別在其中加入2.53的ddATP、

ddCTP、ddGTP,ddTTPe

8.鏈終止反應(yīng)：在A、C、G、T四個(gè)微量離心管中分別加入反應(yīng)液4.53，37r5min?加入

stopsolution5pl,短暫離心。

9.上樣：關(guān)上預(yù)電泳電源，沖洗膠平面，將鯊魚齒插入膠平面中約l-2mm形成加樣孔。將四

個(gè)反應(yīng)管置80c2min?立即取1.5-2|jl加到加樣孔上。

10.電泳：500C,100W,電泳2.5hr后，暫停電泳，在預(yù)留孔二次上樣后，繼續(xù)電泳2.5hr。

11.下膠：停止電泳，取下測(cè)序板，倒掉電泳緩沖液。拆開測(cè)序板，凝膠應(yīng)粘在未硅化的的玻

璃板上。裁一張比膠稍大一些的濾紙，平鋪在膠上，掀起濾紙，凝膠就被一起掀起。

12.壓片：將凝膠蓋上保鮮膜，用monitor■測(cè)讀放射強(qiáng)度，以估計(jì)曝光時(shí)間。在暗室中覆

上X光片，置暗夾中，-70℃放射自顯影。

13.洗片、讀片：取出暗夾，回到室溫。經(jīng)D72顯影、酸性定影液定影，水洗，晾干。在X光

片燈上讀出序列。

三、注意事項(xiàng)

1.測(cè)序板清洗、硅化的好壞直接影響灌膠及下膠。處理不好時(shí)容易導(dǎo)致灌膠時(shí)氣泡的產(chǎn)生，

下膠時(shí)則易使電泳膠損壞。

2.灌膠時(shí)要避免膠的滲漏；注射器將凝膠灌到兩塊玻璃之間時(shí)，注意速度的控制，防止氣泡的

產(chǎn)生。

3.測(cè)序反應(yīng)及電泳上樣時(shí)要注意小心操作，防止放射性同位素污染，同時(shí)要加強(qiáng)整個(gè)后續(xù)實(shí)驗(yàn)

過(guò)程中自身的防護(hù)。

4.規(guī)范、妥善處理放射性同位素接觸物品及廢棄物。

手工測(cè)序需要使用同位素，這給操作帶來(lái)許多不便，對(duì)操作者也有一定的損害。DNA測(cè)序儀的

出現(xiàn)解決了這一問(wèn)題，它不使用同位素標(biāo)記，自動(dòng)化程度高，測(cè)序效果好。雖然DNA測(cè)序儀的

價(jià)格目前仍比較高，但每次測(cè)序的花費(fèi)并不算高，而且商品化服務(wù)也令人滿意。

Southern雜交

Southern雜交是分子生物學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是將待檢測(cè)的DNA樣品固定在固相

載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信

號(hào)。通過(guò)Southern雜交可以判斷被檢測(cè)的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的

長(zhǎng)度。該項(xiàng)技術(shù)廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測(cè)、DNA指紋分析和PCR產(chǎn)物判斷等研究中。但由于該

技術(shù)的操作比較煩瑣、費(fèi)時(shí)，所以現(xiàn)在有一些其他的方法可以代替Southern雜交。但該技術(shù)

也有它的獨(dú)特之處，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多態(tài)性(RFLP)的檢測(cè)

等。

一、基因組DNA的制備(前述)

二、基因組DNA的限制酶切

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個(gè)電泳通道需要10-30|jg的

DNA,購(gòu)買的限制性內(nèi)切酶都附有相對(duì)應(yīng)的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產(chǎn)品目錄上查到

最佳消化溫度。為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化l[jg的DNA。消化的DNA濃度不宜

太高，以0.5|jg/iJl為好。由于內(nèi)切酶是保存在50%甘油內(nèi)的，而酶只有在甘油濃度＜5%的

條件下才能發(fā)揮正常作用，所以加入反應(yīng)體系的酶體積不能超過(guò)1/10。

具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入

DNA(Ipg/pl)20pg

10x酶切buffer4.0pl

限制性內(nèi)切酶(lOU/pl)5.0pl

加ddH20至500川

在最適溫度下消化l-3hr。消化結(jié)束時(shí)可取5pl電泳檢測(cè)消化效果。如果消化效果不好，可以

延長(zhǎng)消化時(shí)間，但超過(guò)6hr己沒有必要?；蛘叻糯蠓磻?yīng)體積，或者補(bǔ)充前再消化。如仍不能奏

效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質(zhì)，或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10體積的0.5MEDTA,以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯

仿抽提,2.5倍體積乙醇沉淀，少量TE溶解（參見DNA提取方法,但離心轉(zhuǎn)速要提高到12000g,

以防止小片段DNA的丟失）。

如果需要兩種酶消化DNA,而兩種酶的反應(yīng)條件可以一致，則兩種酶可同時(shí)進(jìn)行消化；如果反

應(yīng)條件不一致，則先用需要低離子強(qiáng)度的酶消化，然后補(bǔ)加鹽類等物質(zhì)調(diào)高反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度,

再加第二種酶進(jìn)行消化。

三、基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡(jiǎn)單，分離范圍廣（200bp-50kb）,

實(shí)驗(yàn)成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。

表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍

瓊脂糖凝膠濃度（%）分離DNA片段范圍（kb）

0.35-60

0.61-20

0.70.8-10

0.90.5-7

1.20.4-6

1.50.2-3

2.00.1-2

1.制備0.8%凝膠：一般用于Southern雜交的電泳膠取0.8%。

2.電泳：電泳樣品中加入6xLoading緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加DNAMarker。

l-2V/cm,DNA從負(fù)極泳向正極。電泳至溟酚藍(lán)指示劑接近凝膠另一端時(shí)，停止電泳。取出凝

膠