一種利用體外產(chǎn)氣法檢驗(yàn)日糧適合度的方法

2一種利用體外產(chǎn)氣法檢驗(yàn)日糧適合度的方法本文件規(guī)定了日糧適合度檢驗(yàn)的儀器和設(shè)備、試樣、評(píng)定指標(biāo)及方法。本文件適用于TMR全混日糧適合度評(píng)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1日糧適合度檢驗(yàn)testingforrationfitness一種利用體外批次培養(yǎng)、瘤胃液和發(fā)酵產(chǎn)氣技術(shù)并結(jié)合數(shù)學(xué)曲線剖分技術(shù)，對(duì)動(dòng)物所采食日糧進(jìn)行品質(zhì)和組合效應(yīng)分析，解構(gòu)蛋白質(zhì)和碳水化合物的快速和慢速降解池，評(píng)價(jià)微生物蛋白產(chǎn)量和發(fā)酵效率，檢驗(yàn)日糧適合度的方法。4儀器和設(shè)備4.1實(shí)驗(yàn)室用樣品粉碎機(jī)或研缽。4.2瘤胃液取樣器（長(zhǎng)30cm，內(nèi)徑12.70mmPPR管）。4.3分析天平（分度值0.0001g）。4.4烘干箱（室溫～300℃)。4.5磁力攪拌器（轉(zhuǎn)速為100～1400r/min）。4.6纖維袋（ANKOMF57，25μm孔隙）。4.7封口機(jī)。4.8纖維分析儀（濾袋結(jié)構(gòu)：25μm孔隙；處理能力：24個(gè)/批；測(cè)定樣品重量：0.5～1.0g）。4.9體外模擬培養(yǎng)箱（濾袋結(jié)構(gòu)：25μm孔隙；處理能力：100個(gè)/批；測(cè)定樣品重量：0.25～1.0g）。4.10體外產(chǎn)氣儀（測(cè)量方式：累計(jì)產(chǎn)氣量、設(shè)定時(shí)段產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣瞬時(shí)溫度；模塊數(shù)據(jù)傳輸和感應(yīng)方式：無(wú)線，有效距離至少10米；樣品裝填單元容量：250ml）。35試樣5.1采樣按GB/T14699.1進(jìn)行采樣。5.2制備樣品根據(jù)GB/T20195制備，置于烘箱內(nèi)于65℃烘干，研磨，過(guò)1mm篩。6評(píng)定指標(biāo)及方法6.1CNCPS對(duì)蛋白質(zhì)和碳水化合物組分的剖分康乃爾凈碳水化合物和蛋白質(zhì)體系（CNCPS）根據(jù)瘤胃降解特性將飼料中蛋白質(zhì)分為5個(gè)部分，即瞬間可溶性蛋白，PA；不可降解粗蛋白，PC；真蛋白，PB；將PB又分為快速降解真白，PB1；中速降解蛋白，PB2；慢速降解蛋白，PB3。CNCPS將飼料中碳水化合物分為4個(gè)組分，即以糖類(lèi)為主的快速降解碳水化合物，CA；以淀粉和果膠為主要成分的中速降解碳水化合物，CB1；以可消化纖維為主的慢速降解碳水化合物，CB2；以細(xì)胞壁為主的不可利用碳水化合物，CC。6.2日糧適合度指標(biāo)檢驗(yàn)6.2.1體外發(fā)酵產(chǎn)氣快慢池的剖分操作步驟參見(jiàn)附錄A，產(chǎn)氣快慢池剖分參見(jiàn)附錄B。6.2.2有機(jī)物質(zhì)的降解率操作步驟參見(jiàn)附錄A。6.2.3比例因子操作步驟參見(jiàn)附錄A。6.2.4微生物的生物合成量操作步驟參見(jiàn)附錄A。6.2.5微生物生物合成效率操作步驟參見(jiàn)附錄A。6.3日糧適合度檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)6.3.1體外發(fā)酵快慢池的產(chǎn)氣量體外發(fā)酵快慢池的產(chǎn)氣量參考范圍見(jiàn)表1。4表1快慢池的產(chǎn)氣量參考范圍平均值參考范圍標(biāo)準(zhǔn)偏差TMR快速發(fā)酵池(mL)29.516.3—42.76.6<40慢速發(fā)酵池(mL)40.923.1—58.78.9~60總產(chǎn)氣量(mL)70.542.1—98.880-110診斷意見(jiàn)：1.當(dāng)快速發(fā)酵池產(chǎn)生超過(guò)40mL氣體時(shí)，較多的氣體產(chǎn)量可能來(lái)自快速消化的B2（可溶性纖維）池，其產(chǎn)生大量的甲烷和二氧化碳?xì)怏w（以及乙酸鹽和較少的ATP用于微生物生長(zhǎng)）而不是來(lái)自過(guò)量的淀粉。在TMR顯示相對(duì)緩慢的“慢池消化率”時(shí)，可能存在考慮添加NFFS源的趨勢(shì)。然而，這將導(dǎo)致產(chǎn)生更多的氣體，并且不會(huì)使發(fā)酵朝向支持更高的乳產(chǎn)量所需的丙酸鹽（谷物，其途徑不產(chǎn)生氣體）所需的能量。2.日糧總產(chǎn)氣量很大時(shí)(例如>110mL)，可能表明具有優(yōu)異的飼草消化率，但由于細(xì)菌能量溢出（缺乏可溶性蛋白）或缺乏丙酸鹽前體（谷物）而缺乏適合ATP和微生物生產(chǎn)的能量。6.3.2產(chǎn)氣快慢池的降解速率產(chǎn)氣快慢池的降解速率參考范圍見(jiàn)表2。表2產(chǎn)氣快慢池的降解速率的參考范圍平均值參考范圍標(biāo)準(zhǔn)偏差TMRCB1/kd(starch,%/h)8.9—26.94.518-20CB3/kd(NDF,%/h)4.62.4—6.85-6診斷意見(jiàn)：1.當(dāng)慢速降解部分CB3速率低于5%時(shí)，表明粗料有較低的消化率，將會(huì)導(dǎo)致能量攝入減少進(jìn)而影響微生物蛋白合成?？赏ㄟ^(guò)增加非飼草纖維來(lái)源來(lái)提高發(fā)酵率。2.當(dāng)快速發(fā)酵部分CB1超過(guò)25%/h時(shí)，可能會(huì)發(fā)生瘤胃酸中毒的情況，也會(huì)出現(xiàn)蹄部健康問(wèn)題?？赏ㄟ^(guò)飼喂干玉米來(lái)替代發(fā)酵玉米，或者降低玉米青貯加工的粉碎粒度效果和對(duì)谷物的破碎粒度（700-1000微米）等方法來(lái)降低瘤胃內(nèi)的降解速率。6.3.3有機(jī)物質(zhì)的降解率有機(jī)物質(zhì)的降解率參考范圍見(jiàn)表3。表3有機(jī)物質(zhì)的降解率的參考范圍平均值參考范圍標(biāo)準(zhǔn)偏差TMR60.546.1—74.97.2診斷意見(jiàn)：1.當(dāng)TDOM<50%，牛奶產(chǎn)奶量通常較低，制定日糧配方更具挑戰(zhàn)性；2.當(dāng)TDOM在60%左右，牛奶產(chǎn)量正常，制定日糧配方相對(duì)容易；3.當(dāng)TDOM>65%，牛奶產(chǎn)量較高，但需注意消化率和相對(duì)池的大小。6.3.4比例因子5比例因子參考范圍見(jiàn)表4。表4比例因子的參考范圍平均值參考范圍標(biāo)準(zhǔn)偏差TMR4.12.5—5.70.8診斷意見(jiàn)：較高的比例因子的值表明有較少的氣體產(chǎn)生和更多的ATP用于微生物的生長(zhǎng)。一般來(lái)說(shuō)，較多的氣體產(chǎn)生表明乙酸的產(chǎn)量較高，這反過(guò)來(lái)會(huì)導(dǎo)致ATP產(chǎn)量降低。6.3.5微生物的生物合成量微生物的生物合成量參考范圍見(jiàn)表5。表5微生物的生物合成量的參考范圍平均值參考范圍標(biāo)準(zhǔn)偏差TMR135.876.0—195.659.9>1406附錄A體外發(fā)酵產(chǎn)氣操作步驟A.1瘤胃液的制備在晨飼前經(jīng)瘤胃瘺管利用瘤胃液取樣器采集供試羊（牛）的瘤胃液100mL～200mL，直接轉(zhuǎn)入預(yù)熱至39℃的保溫容器中，混合均勻后經(jīng)4層紗布過(guò)濾，濾液持續(xù)通入CO2氣體，然后量取20mL～30mL瘤胃上清液于39℃保溫容器備用。A.2培養(yǎng)液的制備A.2.1礦物質(zhì)溶液1：二水氯化鈣13.2g、四水氯化錳10.0g、六水氯化鈷1.0g、六水三氯化鐵8.0g，用蒸餾水溶解，冷卻后，定容至100mL。A.2.2礦物質(zhì)溶液2：磷酸氫二鈉5.7g、磷酸二氫鉀6.2g、七水硫酸鎂0.6g用蒸餾水溶解后,定容至1000mL。A.2.3緩沖溶液：碳酸氫鈉35.0g、碳酸氫銨4.0g，用蒸餾水溶解，冷卻后，定容至1000mL。A.2.4刃天青溶液：用蒸餾水溶解100mg刃天青，冷卻，定容至100mL。A.2.5還原劑溶液：準(zhǔn)確量取2.0mL的1mol的氫氧化鈉溶液、312.5mg九水硫化鈉；加入47.5mL蒸餾水即可。需在培養(yǎng)的當(dāng)天配置。A.2.6緩沖溶液的配制：將礦物質(zhì)溶液10.12mL、緩沖溶液237.00mL、礦物質(zhì)溶液2237.00mL以及1.22mL刃天青溶液加入到474.00mL蒸餾水中，溫?zé)岬?9℃后，加入還原劑溶液。A.2.7人工瘤胃培養(yǎng)液配制：將20mL瘤胃上清液與40mL緩沖溶液混合,得到混合人工瘤胃培養(yǎng)液。A.3體外產(chǎn)氣量的測(cè)定將0.4000g待測(cè)樣品干物質(zhì)置于ANKOMRFS產(chǎn)氣測(cè)量系統(tǒng)的產(chǎn)氣瓶中，用60mL人工瘤胃培養(yǎng)液消化。每個(gè)培養(yǎng)設(shè)3個(gè)重復(fù)，通過(guò)無(wú)線傳輸連接多個(gè)容器，儀器自動(dòng)檢測(cè)并在電子表格中記錄氣壓信息。同一批次培養(yǎng)中設(shè)定空白組，即為無(wú)發(fā)酵底物，僅有瘤胃液和培養(yǎng)液，作為產(chǎn)氣量校正。A.4體外發(fā)酵產(chǎn)氣快慢池的剖分根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的產(chǎn)氣量，采用Logistic-dualpool模型公式對(duì)快慢池產(chǎn)氣量進(jìn)行剖分:V(t)＝Vf1/(1+exp(2-4k1(t-L)))+Vf2/(1+exp(2-4k2(t-L)))式中：V(t)——t時(shí)間的產(chǎn)氣量，單位為毫升（mL）；Vf1——來(lái)源于快速降解的可溶部分產(chǎn)生的產(chǎn)氣量，單位為毫升（mLVf2——來(lái)源于慢速降解的不溶部分產(chǎn)生的產(chǎn)氣量，單位為毫升（mLk1——降解的可溶部分的產(chǎn)氣速率，單位為百分比每小時(shí)（%/hk2——降解的不溶部分的產(chǎn)氣速率，單位為百分比每小時(shí)（%/hL——延遲時(shí)間，單位為小時(shí)（h）；t——產(chǎn)氣時(shí)間點(diǎn)，單位為小時(shí)（h）。A.5有機(jī)物質(zhì)降解率的測(cè)定7A.5.1操作步驟試驗(yàn)結(jié)束后將產(chǎn)氣瓶于冰上冷卻，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到離心管中，3500轉(zhuǎn)離心15min，棄上清液，將殘?jiān)D(zhuǎn)移到坩堝中，105℃烘干至恒重，然后放到550℃的馬福爐中灼燒4h后，稱重，直至恒重。A.5.2計(jì)算公式A.5.2.1試樣中有機(jī)物質(zhì)的降解率以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)表示，按式（A.1）計(jì)算。TDOM=（W1-W2）-（W3-W4）/（W1-W2）×1000……………（A.1）式中：TDOM——試樣中24小時(shí)后的有機(jī)物質(zhì)的降解率，單位毫克每克（mg/gW1——原樣和坩堝的重量，單位克（gW2——原樣灰化后和坩堝的重量，單位克（gW3——?dú)堅(jiān)娓珊蠛哇釄宓闹亓浚瑔挝豢耍╣W4——烘干的殘?jiān)一蠛哇釄宓闹亓?，單位克（g）。A.6比例因子的測(cè)定A.6.1計(jì)算公式試樣中比例因子以體積分?jǐn)?shù)(mg/ml)表示，按式（A.2）計(jì)算。PF=Y/X……………（A.2）式中：PF——試樣中比例因子，單位為毫克每毫升（mg/mL）；Y——試樣中有機(jī)物質(zhì)的降解率，單位為毫克每克（mg/gX——體外發(fā)酵24小時(shí)后的產(chǎn)氣量，單位為毫升每克（mL/g）。A.7微生物的生物合成量的測(cè)定A.7.1計(jì)算公式試樣中微生物的生物合成量以質(zhì)量(mg)表示，按式（A.3）計(jì)算。MBP=[TDOM-（氣體t1/2×SF）]……………（A.3）式中:MBP——微生物的生物合成量，單位為毫克（mgTDOM——有機(jī)物質(zhì)的降解率，單位為毫克每克（mg/gSF——化學(xué)計(jì)量因子，粗飼料的SF是2.20