第六章-代謝網(wǎng)絡(luò)的定量分析

第六章代謝網(wǎng)絡(luò)的定量分析精品課件復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)代謝理論為系統(tǒng)研究微生物提供了新的平臺。代謝網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用主要是生物體內(nèi)發(fā)生的多個化學(xué)反應(yīng)的總和。根據(jù)研究目的的不同，代謝網(wǎng)絡(luò)可以表達成三種不同形式的圖：代謝物圖、反應(yīng)圖、二分圖。代謝物圖是把代謝網(wǎng)絡(luò)中的代謝物看成是圖的邊；反應(yīng)圖是把酶看成圖中的結(jié)點，連接兩個連續(xù)反應(yīng)的中間復(fù)合物看成是圖的邊；二分圖是把代謝物和酶看成兩種不同類型的結(jié)點。精品課件用代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析的方法來解釋細胞代謝的調(diào)控日益引起重視。在國外，1994年NIESON將代謝工程的定量分析方法，作為單獨的一章加以介紹。近幾年代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析法發(fā)展迅猛，各種方法不斷涌現(xiàn)、發(fā)展，國內(nèi)在1996年7月的第七屆全國生物化工學(xué)術(shù)會議上才有涉及定量分析的研究論文出現(xiàn)。精品課件代謝網(wǎng)絡(luò)途徑分析從簡單地分析代謝反應(yīng)掛圖已發(fā)展到最近的深入研究代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的理論。代謝途徑的確定于提供一個以整個代謝功能和表型為出發(fā)點進行途徑定位方法是必不可少的。對于這種鑒別和分析的方法，最有發(fā)展途的是利用凸分析原理，這些原理包括最近提出的元素模概念和極端途徑模型，兩者都能用于確定代謝網(wǎng)絡(luò)的生產(chǎn)力的界限。途徑分析用到一些數(shù)學(xué)概念，如零空間和凸多面的應(yīng)用，精品課件途徑分析在基因識別和生物技術(shù)上有很大應(yīng)用前途由于對細胞代謝結(jié)構(gòu)的深入理解和巨大的基因組信息在當(dāng)可被利用，生物化學(xué)家和生物技術(shù)家將能得出細胞的完整代謝圖并通過合理、定向的代謝工程來對它進行重新設(shè)計。精品課件代謝網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用理論基礎(chǔ)顯然，利用數(shù)學(xué)工具進行分析是一個重要的方面。1960，匈牙利數(shù)學(xué)家艾爾德(P.Erdǒs)和萊利(A.Rényi)提出，用隨機作圖理論來分析網(wǎng)絡(luò)的拓撲復(fù)雜性。他們的這一理論后來成為分析網(wǎng)絡(luò)的經(jīng)典數(shù)學(xué)方法，被稱為“ER理論”，其研究的網(wǎng)絡(luò)則被稱為“ER模型”。精品課件ER模型建立在隨機過程上，即一定數(shù)量的節(jié)點彼此完全隨機地連接在一起，每個節(jié)點具有相同數(shù)量的連接。因此，這種模型在統(tǒng)計意義上是一種均一性網(wǎng)絡(luò)。最近幾年，隨著大量數(shù)據(jù)的產(chǎn)生和計算機的應(yīng)用，人們發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)實世界里真實的網(wǎng)絡(luò)與ER模型相差甚遠。這些真實的網(wǎng)絡(luò)既不是概率為零的絕對規(guī)則連接網(wǎng)絡(luò)，也不是概率為1的完全隨機連接的網(wǎng)絡(luò)，而介于這兩者之間。科學(xué)家把種類型的網(wǎng)絡(luò)稱為“小世絡(luò)”(small-worldnetwork)。精品課件研究者發(fā)現(xiàn)，線的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)就是一種典型的小世界網(wǎng)絡(luò)。許多自然狀態(tài)下的網(wǎng)絡(luò)還表現(xiàn)出一特別的屬性：少數(shù)節(jié)點的連接數(shù)遠高于平均的節(jié)點連接數(shù)。這類網(wǎng)絡(luò)被稱為“由規(guī)模網(wǎng)絡(luò)”(scale-freenetwork)，屬于高度非均一性的網(wǎng)絡(luò)。它具有真網(wǎng)絡(luò)中最常見的兩個特性：增長(growth)和偏好連接(preferentialattachment研究者利用基因組數(shù)據(jù)庫，對動物、植物、微生物三大類型中的43種生物體的謝網(wǎng)絡(luò)進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些代謝網(wǎng)絡(luò)均遵循著自由規(guī)模網(wǎng)絡(luò)的設(shè)計原則。精品課件代謝網(wǎng)絡(luò)研究的主要研究成果

近幾年，在代謝網(wǎng)絡(luò)方面國外作了大量的研究。H.Jeong,H.Tombor等利用SAYTHS技術(shù)研究了43種生物的細胞代謝網(wǎng)絡(luò)得出：1、它們都是自由規(guī)模網(wǎng)，這些網(wǎng)都是強健的和耐受出錯的(error-tolerant)，也就是抗干擾的。2、具有小世界特性：任何兩個底物(節(jié)點)都可以有少量的代謝反應(yīng)(連接點)與其連接。精品課件3、高度連接的是底物而很少連接的則是種屬特異性酶的產(chǎn)物。4、生物網(wǎng)絡(luò)都是統(tǒng)計異質(zhì)的，也就是說不同的節(jié)點由不同的連接數(shù)(k),符合倍數(shù)定律分布，也就是說在這樣的網(wǎng)中，新的節(jié)點偏向于和已經(jīng)連接了節(jié)點的節(jié)點連接。此種網(wǎng)即強健又具有抗出錯能力。5、所有已測定的43種生物的代謝網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和規(guī)模都是一樣的。6、所有已測定的生物的平均連接數(shù)目(兩個節(jié)點之間的連接數(shù)目)都意外地相近，在3左右。精品課件7、如果一種底物(節(jié)點)由于催化其反應(yīng)的酶的突變而突然降低，則很快就可能有一條最短的生化代謝途徑和少數(shù)新酶的表達，通過更大的網(wǎng)絡(luò)半徑來補救。8、E.coli代謝網(wǎng)絡(luò)計算機模擬和在體突變(Insilicoandinvivomutagenesis)研究表明，細胞可以耐受若干代謝酶的刪除。9、擁有最多連接的節(jié)點也就是“hubs”在所有已測生物中都一樣。對于微生物的精品課件蛋白質(zhì)之間的互作網(wǎng)研究表明，自由規(guī)模網(wǎng)有驚人的對抗意外損傷的能力，即使80%的隨機選定的節(jié)點斷裂，保留的20%仍能形成互聯(lián)簇，使任何兩個節(jié)點間連接。當(dāng)然，這一特征依賴于hubs。在酵母菌中，0～10%的蛋白質(zhì)少于5個連接，大于60%的多于15個互連（互相作用），這表明蛋白的互連度在決定缺陷基因表型中具有重要作用，精品課件只有～18.7%的酵母基因（～14.4%的大腸桿菌基因）缺失使細胞致死。很多大腸桿菌的基因同時缺失甚至不會發(fā)生任何表型變化。證明很多基因在自由規(guī)模網(wǎng)中不具有主要作用。精品課件由于代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是一種并行的結(jié)構(gòu)，加上生物體本身的復(fù)雜性，單靠單一的定量分析方法對復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)很難得出完美的優(yōu)化結(jié)構(gòu)。從國外研究來看，定量分析方法本身尚處于不斷發(fā)展中，新的方法也不斷出現(xiàn)。這些方法的出現(xiàn)、發(fā)展、完善，再加上與新的并行處理方法，如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遺傳算法、進化規(guī)則、細胞自動機模型、計算機技術(shù)等方法結(jié)合，代謝工程定量分析必然會有更大的進展，從而為發(fā)揮代謝工程的潛力和代謝工程的廣泛應(yīng)用開辟廣闊的前景。精品課件一、代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析的研究意義與目的在由代謝途徑組成的代謝系統(tǒng)中，往往幾種調(diào)控機制同時發(fā)揮作用傳播到整個代謝系統(tǒng)。因為在分子水平上影響代謝通量的因素眾多，在確定的環(huán)境中，對通過特定的代謝途徑的代謝通量變化往往存在各種各樣的解釋。精品課件如果這些解釋使用的是定性的方法，就很難對這些解釋進行評價了。在這種情況，用代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析的方法來解釋細胞代謝的調(diào)控日益引起重視。在國外1994年Bailey在Science中將代謝工程的定量分析方法，作為單獨的一章加以介紹。精品課件近幾年代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析法發(fā)展迅猛，各種方法不斷涌現(xiàn)、發(fā)展。國內(nèi)，在1996年7月的第七屆全國生物化工學(xué)術(shù)會議上才有涉及定量分析的研究論文出現(xiàn)。精品課件

鑒于代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析在代謝工程中的基礎(chǔ)性作用，下面將具體介紹國內(nèi)外近幾年在該方面的研究進展。★精品課件二、代謝網(wǎng)絡(luò)定量分析的基本理論

★代謝控制分析（MCA）的基本理論及應(yīng)用

★代謝通量分析（MFA）的基本理論及應(yīng)用

★生化系統(tǒng)理論（BST）的基本理論及應(yīng)用

★控制論模型（CM）的基本理論及應(yīng)用

★途徑分析的基本理論及應(yīng)用★精品課件㈠代謝控制分析（MCA）的基本理論及應(yīng)用MCA是在生化反應(yīng)系統(tǒng)敏感性分析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是研究分析代謝途徑中代謝控制在各個反應(yīng)步驟之間如何分配的理論。這一理論可以用數(shù)學(xué)形式表達，也可以同實驗方法結(jié)合對細胞代謝的調(diào)控問題提出定量的解釋。精品課件

隨著對復(fù)雜代謝現(xiàn)象認識的需要和在生物技術(shù)中研究和應(yīng)用實例的積累，代謝控制分析理論日益引起廣泛的關(guān)注。精品課件

基本理論MCA的基本研究對象是由代謝反應(yīng)步驟以及代謝反應(yīng)途徑組成的代謝系統(tǒng)，單個反應(yīng)步驟是組成系統(tǒng)的基本單元。MCA認為代謝系統(tǒng)中所有反應(yīng)步驟都對代謝通量和代謝物濃度進行控制，因此對其中一個反應(yīng)步驟施加微擾而產(chǎn)生的代謝通量（或代謝物濃度）變化的大小，可以作為代謝系統(tǒng)分析理論的基本概念。精品課件根據(jù)以上概念，在假設(shè)代謝系統(tǒng)是直線式代謝途徑（恒態(tài)代謝系統(tǒng)中任何兩個反應(yīng)步驟是通過唯一的共同中間代謝物連接的），而且系統(tǒng)內(nèi)代謝物是均勻分布的基礎(chǔ)上，可以導(dǎo)出總和原理和連通原理。這些概念和原理就形成MCA理論的基本形式。

精品課件根據(jù)MCA理論,代謝控制是細胞內(nèi)代謝的系統(tǒng)屬性,并可以用酶動力學(xué)性質(zhì)進行定量表示。MCA指出了“限速步驟”觀念的局限性,認為代謝途徑中酶促反應(yīng)步驟對代謝的控制作用隨系統(tǒng)內(nèi)外條件的改變而變化。用理論計算或試驗確定的控制系數(shù)能夠加深對代謝的控制結(jié)構(gòu)特性的理解。精品課件代謝控制分析定義了一些重要的表征參數(shù)，如通量控制系數(shù)、濃度控制系數(shù)、彈性系數(shù)等，它們分別表示某一酶水平變化對速率分布或濃度分布的影響及底物濃度變化對速率分布的影響。精品課件通過對其進行比較即可找到限制性步驟和關(guān)鍵酶，為代謝工程提供了目的位點。利用加和原理、連接原理等可由某些參數(shù)確定那些難以直接測量的參數(shù)。精品課件

控制系數(shù)

是指在生理條件(即某一恒態(tài))下，對代謝系統(tǒng)中某一步反應(yīng)施加一個微小擾動，所引起指定的代謝通量或代謝物濃度的相對變化與該反應(yīng)的反應(yīng)速度Vi相對變化之比：

精品課件

上式中如果A代表指定的代謝通量，則

稱為該步驟關(guān)于這個通量的通量控制系數(shù)。

上式中如果A代表指定代謝物的濃度，則

其稱為該步驟關(guān)于這個代謝物的濃度控制系數(shù)。

精品課件

彈性系數(shù)

是指在一個與代謝系統(tǒng)中某一步反應(yīng)具有相同參數(shù)的酶促反應(yīng)中，對該反應(yīng)某一參數(shù)p

(如底物、產(chǎn)物、酶濃度、溫度、效應(yīng)物等)

進行微擾，所引起的反應(yīng)速度Vi的相對變化與該參數(shù)的相對變化之比，即:精品課件而總和原理

與連通性原理則是在假設(shè)代謝系統(tǒng)是直線式代謝途徑(恒態(tài)代謝系統(tǒng)中任何兩個反應(yīng)步驟是通過唯一的共同中間代謝物連接的)，系統(tǒng)內(nèi)代謝物是均勻分布的情況下推導(dǎo)出的。①精品課件局限性

⑴

控制系數(shù)

是否可以描述代謝的調(diào)節(jié)與控制，這在MCA出現(xiàn)伊始就引起質(zhì)疑，其原因包括以下兩點：①與變構(gòu)酶的效應(yīng)物作用相比，酶濃度不是對代謝調(diào)控特別有影響的參數(shù)；精品課件②

控制系數(shù)是否可以作為代謝控制的標準

值得懷疑，因為控制系數(shù)只在測量條件下有效，并且隨著系統(tǒng)狀態(tài)的變化而變化，因此是作用有限的預(yù)測值。有學(xué)者認為代謝網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控作用不一定是通量控制。精品課件

⑵

當(dāng)涉及MCA的連通性原理時，要求對代謝系統(tǒng)中的所有反應(yīng)及酶與代謝物的中間反應(yīng)等都鑒別清楚。而在實際應(yīng)用中，一般典型生物的代謝知識太少，對其他具有利用潛力的生物更是所知不多。精品課件

這是MCA理論應(yīng)用的“瓶頸

”。目前已經(jīng)發(fā)展了一種稱為“自上而下”的實驗方法拓展了MCA的應(yīng)用前景，可以用來對復(fù)雜代謝系統(tǒng)進行代謝控制分析。精品課件

⑶MCA在指導(dǎo)代謝工程方面的能力還存在問題。MCA只能處理恒態(tài)下的代謝系統(tǒng)，并且代謝通量的控制分布只能在對反應(yīng)速度微擾的情況

進行評估，所確定的控制系數(shù)只對該恒態(tài)有效，所以在代謝工程中用MCA來指導(dǎo)另一種恒態(tài)下代謝系統(tǒng)的調(diào)整是有疑問的。精品課件

此外，以MCA為設(shè)計基礎(chǔ)的代謝工程

多集中在對酶濃度的調(diào)整上。但是通量控制系數(shù)較大的酶有時不能進行調(diào)整，如

在具有反饋抑制機制的直線式代謝途徑中，受抑制的酶常常控制著代謝通量。精品課件

通常的做法是考慮解除

反饋抑制，而不是提高

受反饋抑制的酶的活力。目前在MCA中有學(xué)者運用了一種定位誘變(site-directedmutagenesis)的策略來解決此問題。②精品課件

應(yīng)用

MCA的重要特點之一是能夠結(jié)合具體酶的反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)，來說明代謝網(wǎng)絡(luò)特性。如利用與代謝網(wǎng)絡(luò)中某一步反應(yīng)具有相同參數(shù)的酶促反應(yīng)的速度方程求導(dǎo)得到彈性系數(shù)，或通過體內(nèi)實驗測定彈性系數(shù)，利用連通性原理可以確定網(wǎng)絡(luò)中的控制系數(shù)。精品課件

隨著理論研究的深入發(fā)展，代謝控制分析已經(jīng)大大突破原有假定條件的限制，發(fā)展到可以對含有分支途徑、循環(huán)、酶-酶相互作用、級聯(lián)反應(yīng)等各種結(jié)構(gòu)形式的代謝系統(tǒng)進行代謝控制分析。精品課件MCA在研究復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)中的進展，不僅加深了對代謝網(wǎng)絡(luò)中控制結(jié)構(gòu)的了解，而且對不同代謝系統(tǒng)類型的控制分析更加系統(tǒng)化，形成了所謂的矩陣方，并且促進了計算機技術(shù)在這一領(lǐng)域的應(yīng)用，顯示出MCA應(yīng)用于代謝網(wǎng)絡(luò)分析和評價的廣闊前景?！锞氛n件代謝途徑中的限速步驟MCA的研究突破了傳統(tǒng)的限速步驟觀念,使人們對代謝的調(diào)控有了更加全面的認識。長期以來,人們一直認為代謝途徑存在著固定的限速步驟,它們控制著通過代謝途徑的代謝通量,主要表現(xiàn)在:限速步驟的反應(yīng)速度很低,整個系統(tǒng)的代謝通量取決于此步驟酶的活性;限速步驟是熱力學(xué)不能進行的反應(yīng),具有很高的平衡常數(shù),需要由與其偶聯(lián)的、熱力學(xué)上容易進行的反應(yīng)驅(qū)動;限速步驟受制于該步驟酶活性與酶合成的調(diào)節(jié)。精品課件㈡代謝通量分析（MFA）的基本理論及應(yīng)用

因為代謝通量是構(gòu)成細胞生理學(xué)的基本決定因素，所以體內(nèi)途徑通量大小的精確量化是細胞生理學(xué)和代謝工程中一個重要目標，尤其是從代謝生產(chǎn)的角度看，總是希望盡可能的將底物轉(zhuǎn)變成有用產(chǎn)物。精品課件

代謝通量分析（MFA）是代謝途徑通量確定的一個強有力的方法，因此，通過利用主要胞內(nèi)反應(yīng)的化學(xué)計量模型及應(yīng)用圍繞代謝物的質(zhì)量平衡關(guān)系，就可計算出胞內(nèi)通量。精品課件基本理論代謝通量分析是根據(jù)代謝路徑中各反應(yīng)的計量關(guān)系以及實驗的某些底物、產(chǎn)物的通量和細胞組成等來確定整個代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分布。該方法的基礎(chǔ)是準穩(wěn)態(tài)假設(shè)。精品課件假設(shè)細胞內(nèi)的中間代謝物均處于準穩(wěn)態(tài)，即其濃度變化速率為0，這樣由

n個中間代謝物即可得到n

個關(guān)于速率的約束條件（由計量關(guān)系確定），若選定的速率的總數(shù)目為J，則待解問題的自由度為F=J-n

。

這樣通過實驗測出F

個不相關(guān)速率可確定整體通量分布。

精品課件應(yīng)用

①計算細胞內(nèi)部通量分布；②計算某些難以直接測量的外部量的變化速率；③確定代謝路徑中剛性節(jié)點及控制步驟；④計算理論得率；⑤確定胞內(nèi)代謝路徑；⑥分析替代路徑對通量分布的影響；★精品課件

應(yīng)用代謝通量法分析黃原膠發(fā)酵實驗數(shù)據(jù)

思路：首次采用代謝通量分析法對黃原膠發(fā)酵過程的實驗數(shù)據(jù)進行了定量分析，根據(jù)黃單胞菌的膠合成及糖分解代謝機理求得了產(chǎn)膠期的內(nèi)部代謝通量分布，得出了得率與呼吸商間的關(guān)系式；并根據(jù)一定維持機理求得了維持系數(shù)、P/O及理論得率等。具體實例精品課件其中產(chǎn)膠期黃單胞菌內(nèi)部代謝通量分析如下：對各中間代謝物按準穩(wěn)態(tài)假定可得各速率間具有以下計量關(guān)系:

5r1+r2-r0=0r6-r1=0r3+pr6-r2=0r4-r2-r3=0r5+ar6-r4=02r1+2r2+r4+4r5-r7=0精品課件寫成矩陣形式可表示為:精品課件

矩陣A的秩為6，須確定的速率變量共8個，則方程自由度為2，測出兩個速率即可完全確定代謝網(wǎng)絡(luò)中的通量分布。在黃原膠發(fā)酵實驗中通過離線分析可以測得不同時間的細胞、糖及黃原膠濃度，對其進行數(shù)值微分即可求得糖消耗速率及黃原膠合成速率；

精品課件

由出口氣體組成可以測得氧消耗速率OUR及二氧化碳釋放速率CER。除以細胞濃度即可求得相應(yīng)比速率rs、rp、SOUR及SCER。本實驗采用Amanullah的數(shù)據(jù)進行分析。

精品課件

在150L規(guī)模的發(fā)酵罐中，產(chǎn)膠期rs

約為0.3h-1=10mmo1·g-1·h-1,rp約為0.21h-1=7.5mmo1·g-1·h-1,SOUR約為1.9mmo1·g-1·h-1,SCER約為1.6mmo1·g-1·h-1。

這些外部測得速率與前面分析的細胞內(nèi)部代謝速率的關(guān)系如下：

rs=6r0，rp=(30+3p+2a)·r6，SOUR=0.5r7，SCER=r4+2r5精品課件

代謝網(wǎng)絡(luò)的自由度為2，只需測得兩個變量即可確定通量分布。假定測得rs、rp，則r0、r6可直接求出，代入前面的矩陣方程中即可求得其它速率。結(jié)果為：精品課件r0=0.167rs，r1=r6=rp/(30+3p+2a)，r2=0.167rs-5/(30+3p+2a)·rpr3=0.167rs-(5+p)/(30+3p+2a)·rpr4=0.333rs-(10+p)/(30+3p+2a)·rpr5=0.333rs-(10+p+a)/(30+3p+2a)·rpr7=2rs-(58+5p+4a)/(30+3p+2a)·rpSOUR=rs-(29+2.5p+2a)/(30+3p+2a)·rpSCER=rs-rp精品課件黃原膠發(fā)酵代謝通量分布圖精品課件按文獻取P=0.38，a=0.6，則可求得代謝網(wǎng)絡(luò)中各步的通量，若將葡萄糖的碳摩爾流入量看作100，則歸一化得到通量分布。由上圖可看出，G-6-P是一關(guān)鍵分支點，此處70%的磷酸葡萄糖進入膠合成路徑，其它則分解產(chǎn)能。精品課件

如果采用一些手段提高合成路徑中酶的量及活性，則可使更多的G-6-P進入合成路徑，提高產(chǎn)膠速率及得率。這里還有一個能量平衡的問題，即糖分解代謝產(chǎn)生的ATP與產(chǎn)膠和維持消耗的ATP相等。設(shè)法提高糖代謝的能量產(chǎn)生效率亦可使膠得率提高，所以一部分將對能量代謝進行詳細討論并計算出理論得率。精品課件

如果改變操作條件，則細胞產(chǎn)膠和耗糖的速率均會發(fā)生變化，得到不同的通量分布。若某一分支點的通量分布在不同操作條件下變化不大,則可認為其是一個剛性節(jié)點,應(yīng)設(shè)法加以克服。精品課件

呼吸商RQ=SCER/SOUR，將前面得到的SOUR、SCER計算式代入則可得到呼吸商與得率Yp/s

的關(guān)系為：Yp/s=

通過這一關(guān)系，在發(fā)酵過程中就可以通過易于在線測量的呼吸商的值估計得率大小。

精品課件

通過rs、rp

根據(jù)通量模型求得的SOUR及SCER值分別為2.78和2.5mmol·g-1·h-1，均大于實測值，而且發(fā)現(xiàn)p、a取不同值時對計算結(jié)果影響也不大。出現(xiàn)誤差的原因可能有兩方面：精品課件

一是數(shù)據(jù)本身的誤差，間歇和流加發(fā)酵都是一個動態(tài)過程，只能將發(fā)酵過程分為幾個不同階段，認為各個階段內(nèi)基本上處于穩(wěn)態(tài)，由測得速率進行通量分析。由于一些關(guān)鍵參數(shù)如細胞濃度、底物濃度等本身就有一定的測量誤差，微分求得速率誤差更大，影響到計算得到的通量分布的準確性。精品課件

二是氧限制的存在，黃原膠發(fā)酵液粘度很高，發(fā)酵后期罐中出現(xiàn)死區(qū)，造成氧限制。此時細胞由于供氧不足而使得葡萄糖可能經(jīng)其它途徑分解產(chǎn)生ATP，使得模型預(yù)測結(jié)果與實驗結(jié)果產(chǎn)生較大偏差。然而在缺氧情況下黃單胞菌如何利用葡萄糖，產(chǎn)生何種副產(chǎn)物目前還未見文獻報道，因而此處的網(wǎng)絡(luò)模型中還不能包括這一部分，對此須進一步深入研究。精品課件㈢生化系統(tǒng)理論（BST）的基本理論及應(yīng)用

生化系統(tǒng)理論（BST）是與MCA同時在20世紀70年代發(fā)展起來的一種代謝網(wǎng)絡(luò)分析方法。精品課件基本理論生化系統(tǒng)理論（BST）是指基于最優(yōu)化原理尋找一種使目標最優(yōu)的網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)。它需要建立反應(yīng)各速率與其影響因素（如酶、底物、效應(yīng)物濃度）之間關(guān)系的關(guān)聯(lián)式，給定約束條件（如酶、底物濃度的變化范圍），目標函數(shù)為最大化某一速率（產(chǎn)物生成）。

精品課件求解此約束條件最優(yōu)化問題即可得到目標最優(yōu)時的網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)，為采用基因工程技術(shù)改進代謝結(jié)構(gòu)提供指導(dǎo)。

精品課件應(yīng)用生化系統(tǒng)理論以線性優(yōu)化程序優(yōu)化代謝流網(wǎng)絡(luò)。在生化系統(tǒng)理論中，把特定的最大化通量權(quán)值總和定為客體功能。精品課件Papoutsakis和Meyer等人研究了糖化菌產(chǎn)丁醇和丙酮等化合物的生化過程，把與發(fā)酵過程有關(guān)的反應(yīng)式寫成化學(xué)計量方程組，解出這些方程并有效化，使目標得到優(yōu)化。

Papoutsakis和Meyer精品課件Torres等人構(gòu)建了數(shù)學(xué)模型，用S-系統(tǒng)表示生化系統(tǒng)。這種系統(tǒng)能用線性規(guī)劃優(yōu)化檸檬酸積累過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，把代謝物庫維持在一個狹窄的生理范圍內(nèi)并允許酶濃度在0.1-50倍基本值的范圍內(nèi)變動，有可能使糖酵解代謝流增長二倍（當(dāng)保持100%的底物轉(zhuǎn)化率時），要達到這個目標，有必要同時調(diào)整7個或更多的酶?！锞氛n件㈣控制論模型（CM）的基本理論及應(yīng)用

控制論模型在代謝工程中的應(yīng)用是由Ramkrishna等人提出并發(fā)展起來。精品課件基本理論現(xiàn)代控制理論以狀態(tài)變量概念為基礎(chǔ)，利用現(xiàn)代數(shù)學(xué)方法和計算機來分析、綜合復(fù)雜控制系統(tǒng)，適用于多輸入、多輸出、時變的或非線性系統(tǒng)，核心是最優(yōu)控制理論和最優(yōu)估計理論。精品課件其觀點是把微生物本身看作是一位“優(yōu)化戰(zhàn)略家”。因此，當(dāng)提供給它不同的營養(yǎng)組分時，微生物會自動調(diào)整關(guān)鍵酶的合成和活性。改變組分的目標是達到最大化生長率或最大化產(chǎn)率。精品課件這種理解已被用于描述試驗的調(diào)節(jié)現(xiàn)象。控制論模型認為獨立代謝途徑內(nèi)的每一步資源分配被優(yōu)化，相應(yīng)地每一步均按控制論原則來調(diào)節(jié)。精品課件在以上理論的基礎(chǔ)上，Varner和Ramkrishna發(fā)展出一種通俗的理解法：導(dǎo)引原則，這種原則可以形成控制論上的受控變量，以導(dǎo)引原則構(gòu)建代謝過程圖。精品課件Varner等人用這個模型描述含碳貯存化合物的合成過程。通過基因改變研究系統(tǒng)性能的變化，用CM作為診斷工具測試各種預(yù)測計劃，并在CM框架內(nèi)描述酶活性的改變和途徑酶的過量表達?！?/p>

應(yīng)用精品課件㈤途徑分析的基本理論及應(yīng)用代謝網(wǎng)絡(luò)途徑分析從簡單地分析代謝反應(yīng)掛圖已發(fā)展到最近的深入研究代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的理論。精品課件基本理論代謝途徑的確定可以提供一個以整個代謝功能和表型為出發(fā)點進行途徑定位的方法。對于鑒別和分析的方法，最有發(fā)展前途的是利用凸分析原理。精品課件這些原理包括最近提出的元素模型概念和極端途徑模型，兩者都能用于確定代謝網(wǎng)絡(luò)的生產(chǎn)能力的界限。途徑分析用到一些數(shù)學(xué)概念，如零空間和凸多面錐的應(yīng)用。精品課件途徑分析在基因識別和生物技術(shù)上有很大應(yīng)用前途。由于對細胞代謝結(jié)構(gòu)的深入理解和巨大的基因組信息在當(dāng)今可被利用。精品課件途徑分析的最新發(fā)展為凸分析在代謝工程上的應(yīng)用。在代謝通量分析中我們知道，由于許多通量被各種不等式約束，使得傳統(tǒng)的線性代數(shù)不能被用于處理這種數(shù)學(xué)上的等式/不等式體系，這迫使利用凸分析來研究空間特性以解決這個難題。精品課件Liao等發(fā)現(xiàn)代謝物產(chǎn)率最終受從中心代謝到所需的生物合成途徑的分支代謝流能力的限制，因此重建中心代謝是高產(chǎn)的基本條件。從途徑分析開始（僅需反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)化學(xué)計量數(shù)據(jù)），結(jié)合凸分析，這種方法可用于測定基本反應(yīng)模型。

應(yīng)用精品課件Seressiotis等人應(yīng)用人工智能技術(shù)發(fā)展了一種軟件系統(tǒng)用于代謝途徑分析，建立了一個可自由擴展的數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，含有酶和底物的信息?？捎靡环N搜索算法尋找需要的信息，用于定性預(yù)測增減酶活性對細胞環(huán)境和代謝調(diào)節(jié)的影響，幫助找出合適的基因型或有助于產(chǎn)量提高的基因修飾?！锞氛n件

利用途徑工程改造阿維鏈霉菌生產(chǎn)合成單一高效組分B1a和提高活性組分產(chǎn)量的研究進展。①通過途徑工程構(gòu)建生產(chǎn)單一組分的菌株

②C5-氧-阿維菌素B的生產(chǎn)③提高阿維菌素中B1：B2的比例

④aveR基因失活提高阿維菌素產(chǎn)量具體實例精品課件

阿維鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生8個組分，其中只有B1a和B1b

兩個組分有較高殺蟲活性，特別是B1a

的活性最高。這8個組分在結(jié)構(gòu)上的差異集中在3個位置上。通過途徑工程構(gòu)建生產(chǎn)單一組分的菌株精品課件日本的Ikeda和mura分離到2個突變株K2021和K2034。在K2021菌株中，作為聚酮鏈合成起始單位之一的異丁酸的前體—纈氨酸的摻入受到了抑制，因此僅產(chǎn)生阿維菌素的“a”組分。而K2034僅產(chǎn)生“B”組分，則是由于該株系aveD基因發(fā)生點突變，C5位O-甲基轉(zhuǎn)移酶失活，該酶催化將“B”組分轉(zhuǎn)變?yōu)椤癆”組分。精品課件

通過將K2021和K2034株進行雜交得到了僅產(chǎn)生阿維菌素B1a和B2a

而不產(chǎn)生其它組分的菌株。進一步，在僅產(chǎn)生B1a

和B2a

的重組株K2038中通過PCR的方法在aveC區(qū)域引入點突變，這樣得到了僅產(chǎn)生單一組分B2a

的菌株，B2a組分可通過化學(xué)加氫的方法再轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘暂^低的伊維菌素B1a。精品課件

從阿維菌素基本結(jié)構(gòu)出發(fā)，對某些基團進行適當(dāng)修飾，合成阿維菌素的新衍生物，是農(nóng)藥創(chuàng)新的重要途徑之一。在這些衍生物中，C5-氧-阿維菌素B衍生物就可增加其活性。C5-氧-阿維菌素B的生產(chǎn)精品課件Ikeda等在研究aveD和aveF基因的功能時，曾在aveF內(nèi)部引入移碼突變，導(dǎo)致客觀存在編碼的5-酮基還原酶失活，不能將C5位的酮基還原成OH，因此即便由aveD編碼的C5-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶存在，也不能將C5位酮基甲基化，該突變株只能產(chǎn)生C5-氧-阿維菌素B。

精品課件

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的陳芝等采用破壞aveD基因的策略，將7.0kb的pCZ2質(zhì)粒通過同源重組到染色體的aveD基因中，因質(zhì)粒內(nèi)部可能有終止子序列，導(dǎo)致了下游aveF的不能表達，因而合成的產(chǎn)物也是C5-氧-阿維菌素B，該產(chǎn)物經(jīng)肟基化后，其殺蟲活性更高。精品課件

野生型阿維鏈霉菌合成的B1：B2一般為1∶2，如果能提高此比例將會減少工業(yè)化提取程序。Stutzman-Engwall等人構(gòu)建了一系列含有aveC基因野生和突變閱讀框的重組表達質(zhì)粒，找到了可提高此比例的重組表達質(zhì)粒，引入宿主后與染色體發(fā)生重組，最后得到了一系列比例提高的突變株，有的達2.5：1左右。提高阿維菌素中B1：B2的比例精品課件Stutzman-Engwall等克隆了兩個基因aveR1和aveR2，這兩個基因負責(zé)調(diào)控聚酮合成酶基因的表達與阿維菌素合成酶基因的表達，他們發(fā)現(xiàn)使這兩個基因中的任何一個基因或同時兩個基因失活將會使阿維菌素產(chǎn)量有大幅度的提高。aveR基因失活提高阿維菌素產(chǎn)量精品課件

他們構(gòu)建這兩個基因替換質(zhì)粒載體pSE210、pSE214，與宿主染色體發(fā)生重組后分別得到了aveR1、aveR2基因缺失的和aveR2基因失活的突變株，突變株的產(chǎn)量比原菌株提高了3.1~3.4倍。精品課件三、展望代謝分析方法的發(fā)展方向

由于代謝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是一種并行的結(jié)構(gòu)，加上生物體本身的復(fù)雜性，靠單一的定量分析方法對復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)很難得出完美的優(yōu)化結(jié)構(gòu)。從國外研究來看，定量分析方法本身尚處于不斷發(fā)展中，新的方法也不斷出現(xiàn)。精品課件

這些方法的出現(xiàn)、發(fā)展、完善，再加上與新的并行處理方法，如神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遺傳算法、進化規(guī)則、細胞自動機模型、計算機技術(shù)等方法結(jié)合，代謝工程定量分析必然會有更大的進展，從而為發(fā)揮代謝工程的潛力和代謝工程的廣泛應(yīng)用開辟廣闊的前景?！锞氛n件Content代謝物流分析細胞代謝流的測定代謝網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建直接構(gòu)建間接構(gòu)建代謝物流分析的計量學(xué)基礎(chǔ)精品課件細胞代謝流的測定細胞內(nèi)外代謝流量的測定是計算得出整個代謝網(wǎng)絡(luò)流量詳細分布的基礎(chǔ)，是代謝工程的重要分析技術(shù)，是對代謝網(wǎng)絡(luò)進行定量分析的依據(jù)。測定細胞內(nèi)外代謝流量的數(shù)量越多，得到的代謝流分布就會越接近實際。在進行代謝定量分析時，實驗數(shù)據(jù)必須滿足下列要求：第一完整性第二無干擾性第三重現(xiàn)性精品課件代謝流分析定義是一種計算流經(jīng)各種途徑的物流的技術(shù)，用于描述不同途徑的相互作用和圍繞支點的物流分布。精品課件代謝物流分析的意義代謝物流分析屬于途徑分析方法，是一種計算通過各種途徑的物流的強有力的技術(shù)。為了更好的了解生長細胞的行為，可將養(yǎng)分的代謝、能量交換及其相互關(guān)系同細胞的行為關(guān)聯(lián)。通過對碳中樞代謝途徑與載流途徑的控制可以改善細胞培養(yǎng)特性，獲得更多產(chǎn)物。精品課件有關(guān)代謝分析的研究方法1.詳細生理學(xué)分析2.代謝通量分析（MFA）；3.代謝控制分析(MCA)；4.生化系統(tǒng)理論；5.動力學(xué)模型；6.途徑熱力學(xué)分析等。精品課件代謝流的研究任務(wù)對已知途徑而言，是了解生物過程環(huán)境變化時對代謝流及其分布的影響，確定流向終產(chǎn)物的比例；對未知途徑而言，是主要途徑的鑒別，副產(chǎn)物途徑的了解以便指導(dǎo)遺傳操作，克服微生物自身的遺傳機制，去除副途徑。精品課件代謝流與代謝工程的關(guān)系代謝工程是對細胞內(nèi)代謝途徑進行定向的、有目的地改造以便更好地理解和利用胞內(nèi)代謝進行化學(xué)轉(zhuǎn)化、能量轉(zhuǎn)導(dǎo)和超分子組裝。代謝工程應(yīng)該是對生化反應(yīng)代謝網(wǎng)絡(luò)有目的地修飾；其研究對象是代謝網(wǎng)絡(luò)，最終的目的是改變代謝流，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率，但它不同于傳統(tǒng)菌株無目的的改造，它是一種有目的、有理性的改造。精品課件代謝物流分析應(yīng)用（１）定量各途徑的物流和測量流入細胞內(nèi)的碳。（２）鑒別細胞途徑中的分支點通過比較不同突變株和不同操作條件下的各途徑的物流分布可以鑒別途徑的節(jié)點是剛性、半剛性、還是柔性。（３）不同途徑存在的鑒別識別胞內(nèi)是否存在某代謝途徑。精品課件（４）非測量所得的胞外物流的計算（５）考察另一些分布的影響關(guān)于代謝物生產(chǎn)的優(yōu)化，可鑒別一種或幾種提高代謝物得率或消除所需代謝物的物流的限制作用。（６）最大理論得率的計算精品課件代謝流分析揭示了代謝流的靜態(tài)分布“當(dāng)外部環(huán)境在一定范圍內(nèi)變化時,合成速率和轉(zhuǎn)化速率的相對穩(wěn)定性需通過代謝控制分析解決。其核心為彈性系數(shù)(彈性系數(shù)為單位代謝物濃度,如抑制物濃度,變化引起的酶反應(yīng)速率的變化)和流量控制系數(shù)(單位酶變化量引起的某分支穩(wěn)態(tài)代謝流量的變化,表明一個系統(tǒng)對其組成變化的敏感程度,用以衡量此反應(yīng)對體系的控制程度)，兩者相互關(guān)聯(lián),其值可直接或間接測定。精品課件代謝流分析是代謝分析的一個重要手段,它假定細胞內(nèi)的物質(zhì)、能量處于一擬穩(wěn)態(tài)，通過測定胞外物質(zhì)濃度根據(jù)物料平衡計算細胞內(nèi)的代謝流，放射性標記、同位素跟蹤等的應(yīng)用使代謝流分析更簡單、方便。通過對細胞在不同情況如:改變培養(yǎng)環(huán)境、去除抑制、增加或減少酶活等的代謝流分析可確定節(jié)點類型!確定最優(yōu)途徑、估算基因改造的結(jié)果!計算最大理論產(chǎn)率等。精品課件賴氨酸產(chǎn)率變化時,其合成途徑眾多節(jié)點的代謝流量分配的明顯改變僅發(fā)生3個節(jié)點:6-磷酸葡萄糖(G-6P)，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和丙酮酸(Pyr)。以葡萄糖酸鹽代替葡萄糖發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)G-6P節(jié)點的NADP代謝流降低50%，賴氨酸產(chǎn)率保持30%不變；通過DNA技術(shù)削減6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶90%的活性，賴氨酸代謝流分率不變，但總代謝流降為原來的75%。精品課件由此，確定G6P節(jié)點是撓性的,磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸中定有剛性節(jié)點;隨后的分析表明Pyr為撓性,PEP為剛性。對青霉素生物合成通過代謝流分析進行研究時發(fā)現(xiàn):其前體之一半胱氨酸由硫氫化途徑合成時青霉素產(chǎn)率高于由轉(zhuǎn)硫化途徑合成的產(chǎn)率。精品課件結(jié)合動力學(xué)模型對青霉素的生物合成途徑進行代謝控制分析，發(fā)現(xiàn):在分批培養(yǎng)的不同階段,代謝流控制發(fā)生很大變化“培養(yǎng)的第一階段,代謝流量控制主要發(fā)生在第一步:由ACV(L