吉林大學生物基礎國家級實驗教學示范中心

·1·T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗于彬E-mail：yubin@淋巴細胞在體外培養(yǎng)時，受到刺激物的刺激后可表現(xiàn)為細胞體積增大、代謝旺盛、蛋白質(zhì)和核酸合成增加，即向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化和增殖。此現(xiàn)象稱為淋巴細胞轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（簡稱為淋轉(zhuǎn)）。淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的高低可以反映機體的免疫水平，因此可作為測定機體免疫功能的指標之一。淋巴細胞轉(zhuǎn)化概念·3·檢查患者細胞免疫功能估計疾病的療效及預后細胞配型抗原的檢查：移植免疫免疫藥理學：具有免疫調(diào)節(jié)的藥物、保健品、中草藥及生物制品衛(wèi)生毒理學的研究淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗的應用·4·實驗分組及材料實驗原理主要操作步驟檢測方法實驗主要內(nèi)容·5·實驗分組及材料器材75%酒精 若干無菌紗網(wǎng) 1塊/組無菌平皿 1塊/組無菌96孔培養(yǎng)板 1塊/組細胞計數(shù)板 1套/組顯微鏡 1臺/組可調(diào)微量加樣器 1套/4人無菌吸頭（大、中、?。?套/4人EP管 25個/4人眼科剪、小鑷子 1飯盒/4人5ml注射器1個/組100ml燒杯1個/組細胞培養(yǎng)箱（37℃5%CO2)酶標儀1臺離心機 2個/room超凈臺 2個/room分組：每組4人

動物及試劑小鼠1只/組培養(yǎng)液(1640)無FCS10ml/組

培養(yǎng)液(1640)10%FCS10ml/組

50ml滅菌離心筒1個/組ConA(200ug/ml)200ul/組MTT（5mg/ml)

0.7ml/組濾紙一塊二甲亞砜（DMSO) 3ml/組·6·Lymphocytes(B/T)mitogensSpecificityAgProliferationtransformationlymphoblastNucleic

Acid↑Protein↑T細胞、B細胞表面具有識別抗原的受體和有絲分裂原受體，在特異性抗原刺激下可使相應淋巴細胞克隆發(fā)生增殖。原理·7·有絲分裂原（mitogen）來自植物蛋白或細菌產(chǎn)物，它能與多種細胞膜糖類及寡糖基分子結(jié)合，后者為絲分裂原受體、結(jié)合后能促使細胞活化和誘導細胞分裂。T和B細胞表面都有絲裂原受體，在體外可非特異性刺激靜止淋巴細胞向淋巴母細胞轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化細胞DNA合成增加，出現(xiàn)細胞體積增大，胞漿增多，嗜堿性以及產(chǎn)生有絲分裂等形態(tài)變化。有絲分裂原·8·Tcellproliferation植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA)(人T）刀豆素A（concanavalin,ConA）（鼠T）美洲商陸（pokeweedmitogen,PWM)B

cellproliferation脂多糖（lipopolysaccharide,LPS)(鼠B）金黃色葡萄球菌A蛋白（staphylococcalproteinA,SPA)（人B）美洲商陸（pokeweedmitogen,PWM)常用的絲裂原·9·形態(tài)學觀察法3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）摻入法MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法）本次實驗采用MTT法常用的檢測方法·10·淋巴母細胞主要表現(xiàn)有體積明顯增大，是成熟淋巴細胞的3~4倍；染色質(zhì)疏松，核仁清晰可見；胞漿豐富并形成空泡。根據(jù)細胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結(jié)構以及有無核仁等特征，分別計數(shù)淋巴母細胞、過渡型母細胞和核絲分裂相細胞以及成熟的小淋巴細胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細胞，每份標本計數(shù)200個細胞，按下式計算轉(zhuǎn)化率：

形態(tài)學檢測方法·11·G0G1有絲分裂原特異性抗原SPr,RNA,DNA前體物質(zhì)DNA↑↑NewDNA3H-TdRTdR3H-TdRcpm3H-TdR摻入法·12·T細胞在PHA或ConA刺激下轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，同時DNA和RNA合成明顯增加，此時將同位素3H標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），加入培養(yǎng)液內(nèi)，則被作為DNA原料攝入到轉(zhuǎn)化的細胞內(nèi)，測定細胞內(nèi)摻入DNA中的3H-TdR的放射性相對數(shù)量（以脈沖數(shù)cpm表示）可用來表示轉(zhuǎn)化率的高低。測定低能量3H的放射性需用液體閃爍計數(shù)器。3H-TdR摻入法·13·活/增殖期的細胞線粒體能量代謝琥珀酸脫氫酶MTTMTT摻入還原甲臢顆粒formazan細胞內(nèi)/周圍溶解測OD490值MTT法DMSO·14·MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法。MTT是一種噻唑鹽，化學名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，水溶液為黃橙色。小鼠脾細胞受到ConA作用后發(fā)生增殖活化，其胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶活性相應升高，MTT作為其底物參與反應，形成藍色的甲臜（Formazan）顆粒沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，用二甲亞砜(DMSO)溶解所生成的甲臜顆粒，其生成量與細胞數(shù)目和/或細胞活性呈正相關，通過檢測490nm處光密度值變化，可間接反映細胞生長及增殖活性。MTT法·15·第一天殺鼠取脾搗碎獲得細胞計數(shù)細胞稀釋（1×107）上樣（100ul/孔）ConA的梯度稀釋上樣（100ul/孔）將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱，做好標記，5%CO237℃培養(yǎng)48小時第三天取出96孔板加入MTT(5mg/ml)20ul/孔5%CO237℃，繼續(xù)培養(yǎng)2小時。2000rpm，離心10min。小心棄去上清，加入100ul/孔DMSO振蕩，使顆粒全部溶解。酶標儀測吸光度值：OD490nm結(jié)果判定：SI=ConA孔OD值/對照孔OD值實驗步驟·16·1W無菌取脾研磨成單細胞懸液+1640（無FBS)細胞計數(shù)【?/ml】取20ul細胞+980ul的1640混勻后取出20ul細胞+20ul臺盼藍加板(三復孔)(加法見附圖)調(diào)細胞濃度1×107個/ml5%CO237℃培養(yǎng)48小時培養(yǎng)終止前2小時加入MTT(5mg/ml)20ul/孔5%CO237℃繼續(xù)培養(yǎng)2小時2000rpm10min小心棄去上清，加入100ul/孔DMSO振蕩，使顆粒全部溶解酶標儀測吸光度值：OD490nm結(jié)果判定：SI=ConA孔OD值/對照孔OD值實驗流程·17·單細胞懸液的制備小鼠脫臼處死，75%酒精浸泡消毒2-3分鐘。于超凈臺內(nèi)取出脾組織，放入預先盛有5ml無血清1640培養(yǎng)液的平皿內(nèi)。用紗網(wǎng)包裹住脾組織，將脾剪成小塊，用5ml注射器塞輕壓使脾細胞透過紗網(wǎng)。然后用1000ul加樣器隔著紗布將脾細胞懸液吸出，放入50ml無菌離心管中，再分別用1ml培養(yǎng)液沖洗紗網(wǎng)和平皿，并將細胞懸液吸出，放入同一50ml離心管中，剩余3ml培養(yǎng)液備用。2000rpm，常溫離心6分鐘，棄上清，加3ml含血清1640培養(yǎng)液重懸細胞。細胞計數(shù)取上述制備好的細胞懸液混勻后取出20ul，加到盛有980ul計數(shù)液的EP管中，混勻后取出20ul到一個新的EP管中，再向其中加入20ul臺盼藍染料，混勻后取20ul計入到細胞計數(shù)版上，在顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)方法見后。用含血清1640培養(yǎng)液調(diào)細胞濃度至1×107/ml，每組所需總量為4ml（此步可使用之前裝無血清培養(yǎng)液的離心管）。詳細實驗步驟·18·細胞計數(shù)板查出四個大方格（16個小方格/大格）的總細胞數(shù)(X)；算出每個大方格的細胞數(shù)：A=X/4每個大方格的體積為：V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細胞懸液的細胞濃度（/ml)=A×104×稀釋倍數(shù)(100)4·19·細胞培養(yǎng)按圖所示加板。將板做好標記，在倒置顯微鏡下觀察細胞，然后放于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時。MTT摻入：在終止培養(yǎng)前2小時，在顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)化情況。每孔內(nèi)加入MTT（5mg/ml)20ul，加完后輕輕搕板，使MTT和細胞混勻。在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時，取出板，觀察顏色變化，然后離心2000rpm，10min，輕輕吸去上清，注意不要將孔底部的顆粒物吸出）觀察板底是否有藍色的顆粒。加入100ul二甲亞砜（DMSO)，輕輕晃板，將顆粒完全溶解。結(jié)果測定：結(jié)果測量：用酶標儀測定490nm處光密度值（OD490nm），記錄結(jié)果。結(jié)果判定：SI（刺激指數(shù)）=ConA刺激孔值/對照孔值詳細實驗步驟·20·100μL

ConA200ug/mlConA的倍比稀釋400μL含10%血清的1640400μL400μL400μL400μL400μL400μL1234567900μL含血清的1640201052.51.250.6250.3130.157ug/ml0400μL含10%血清的1640·21·12354760111每個樣品設置三復孔

100ulspleen

Cell+100ul

ConA20ug/ml100ulspleencell+100ulConA10ug/ml100ulspleenCell+100ulConA5ug/ml100ulspleenCell+100ulConA2.5ug/ml100ulspleenCell+100ulConA1.25ug/ml100ulspleenCell+100ulConA0.625ug/ml100ulspleenCell+100ulConA0.313ug/ml100ulspleen

Cell+100ul10%1640“0”